细胞细胞成像的微管细胞和微机械操作的 阿拉比多普西斯拍摄 阿皮克·梅里斯特姆

Summary

在这里，我们描述了一个协议，用于在拍摄时皮质微管细胞骨架的活细胞成像，并监测其对物理力变化的反应。

Abstract

了解细胞和组织水平对生长和形态的调控几十年来一直处于生物学研究的最前沿。分子和成像技术的进步使我们能够深入了解生化信号如何影响形态遗传事件。然而，越来越明显的是，除了生化信号，机械线索也影响细胞和组织生长的几个方面。 阿拉伯射枪（SAM） 是一个圆顶形状的结构，负责生成所有地上器官。在植物细胞中培养增生纤维素沉积的皮质微管细胞骨架的组织在空间上是截然不同的。皮质微管模式的可视化和定量评估对于理解SAM细胞的生物物理性质是必要的，因为纤维素是植物细胞壁最坚硬的成分。皮质显微管组织的陈规定型形式也是 SAM 中存在的组织范围物理力的结果。这些物理力的扰动和皮质微管组织的随后监测允许识别参与调解机械感知和转导的候选蛋白质。在这里，我们描述了一个帮助调查此类过程的协议。

Introduction

植物细胞被多糖和糖蛋白的细胞外基质包围，这些基质在机械上类似于一种纤维增强复合材料，能够动态地改变其机械性能^1。植物细胞的生长是由水吸收到细胞中所推动的，这导致细胞壁上同时积聚的拉伸力。为了响应这种力，对细胞壁的物理状态的修改允许细胞膨胀。与含有细胞的二级细胞壁相比，具有原壁的细胞能够快速生长，这主要是由于其中多糖的化学成分不同。原发性壁细胞由纤维素、血脂素和果胶以及缺乏木质素组成，木质素存在于二级细胞壁^2中。纤维素是一种通过β-1，4键连接的葡萄糖聚合物，是细胞壁的主要成分。它被组织成纤维结构，能够承受细胞生长3过程中经历的高拉伸^力。除了承受拉伸力外，沿优先方向进行机械加固还会导致沿垂直于纤维素微纤维的净向轴的涡轮驱动膨胀。纤维素微纤维的组织受皮质微管细胞骨架的影响，因为它们引导位于血浆膜⁴的纤维素合成复合物的方向运动。因此，使用微管相关蛋白质或与荧光分子融合的块状蛋白监测皮质微管组织，可作为观察植物细胞中纤维素上表面模式的代理。

皮质微管细胞骨架的图案在细胞和组织形态衍生的机械力的控制之下。皮质微管组织在位于SAM顶点的细胞中没有任何优先组织，而处于外围的细胞和SAM与新兴器官之间的边界则有一个稳定、高度组织的皮质微管⁵的超细胞阵列。已经开发出几种方法来物理干扰细胞的机械状态。渗透状态的变化，以及对影响细胞壁刚度的药理和酶化合物的治疗，都可能导致^细胞6，7经历的拉伸力^{的后续变化}。使用允许组织经历的压缩力逐渐增加的装置是另一种选择^。离心力的应用也被证明对机械力有影响，而与细胞9没有任何物理^接触。然而，在一组细胞中改变定向力的最广泛使用的方法利用了以下事实：所有表皮细胞都在紧张状态，细胞的物理消融将消除局部的结节压力，并破坏细胞对细胞的粘附，从而改变相邻细胞经历的拉伸力。这通过瞄准高功率脉冲紫外激光或通过细针执行。

在这里，我们详细阐述了在SAM的机械扰动成像和评估皮质微管行为的过程。

Protocol

1. 植物生长

1. 播种阿拉比多普斯种子表达微管结合域与绿色荧光蛋白（MBD-GFP）10在土壤上，并保持在漫长的一天（16小时白天/8小时晚上），20°C/6°C条件1周的发芽。
2. 发芽后，将幼苗转移到具有足够生长空间的新盆栽，使植物生长强劲。保持植物在短天（8小时白天/16小时晚上），20°C/16°C条件3-5周。
3. 将植物转移到漫长的一天（16小时白天/8小时夜间），20°C/16°C的条件，并保持直到植物螺栓（2-3周）。让花序长到2-5厘米长。

2. 中等准备

1. 准备解剖菜肴，通过填充小培养皿（约5.5厘米宽，1.5厘米深）到约一半的深度与2%的阿加罗斯。解剖盘也可用于单点成像。
2. 准备生长介质。
   1. 用5克肌醇、0.05克烟酸、0.05克盐酸丙二恶英、0.5克盐酸硫胺胺和0.1克甘氨酸，准备50 mL的1000x维生素库存溶液。
   2. 准备生长介质，由1/2 Murashige和Skoog介质、1%蔗糖、1.6%的加糖、1倍维生素、pH = 5.8组成。自动保存并冷却。
   3. 在无菌、干净的长凳上，用 70% 乙醇浸 15 分钟对铰链塑料盒（约 5.2 厘米 x 5.2 厘米 x 3 厘米）进行消毒。
   4. 在无菌、干净的长凳上，一旦介质处于可承受的温暖状态，将N6-苯丁宁加入到200 nM的最终浓度和1/1，000 PPM（植物防腐剂混合物）中，并混合良好。用介质填充无菌盒的深度约为其深度的一半。

3. SAM 的解剖

1. 切开花序，用锋利的钳子去除老花蕾，剥落花底的花，直到肉眼难以看到。
2. 用钳子在解剖盘中的阿加罗斯中创建一个缝隙，将花样底片种植到厚厚的阿加中。这为年轻花的进一步精细解剖，以暴露 SAM 提供了良好的坚实支持。
3. 去除剩余的花蕾，用钳子向下推，从最古老和顺序进展到年轻阶段下解剖显微镜下，直到SAM可见。当去除第 6 至 7 阶段的旧花时，SAM 通常会暴露。一旦SAM暴露，通过快速移动到下一步，避免样品脱水。

4. 养殖萨姆的转移和成长

1. 将第 1 节中详述的新鲜解剖样品种植到矩形塑料铰链培养盒中的生长介质中，SAM 刚刚暴露在介质表面上方。在培养箱的边缘加入几滴无菌去ion化水，并合上盖子以保持箱内的湿度。确保添加的水不包括 SAM。
2. 合上盖子，用微孔胶带包裹盒子。将生长盒在22°C的长日或连续日条件下放置，生长12-24小时，使SAM从解剖过程中恢复并适应培养条件。

5. SAM 的成像

1. 将含有 SAM 的培养盒填充无菌去维化水，以覆盖样品。在解剖显微镜下检查，通过用 1 mL 移液器强行向样品喷水，并清除任何气泡。
2. 将培养盒放在直立的共合显微镜舞台上。注意培养盒不接触显微镜目标。使用长距离 40 倍或 60 倍浸水镜头的数字光圈 0.8-1，这是无需盖玻璃成像的最佳方法。
3. 将目标下到水中，检查目标前透镜上形成的气泡。通过降低舞台，用光学组织轻轻擦拭镜头，然后用巴斯德移液器向目标前透镜添加少量水，然后重新浸入水中，去除任何气泡。
4. 使用共体显微镜的 GFP 过滤器和光显照明模块，调整 XY 控制器以定位样品。调整眼部的位置，将 SAM 直接置于光源下，沿 Z 轴对焦，直到顶点定位。
   注：不要直视紫外线。
5. 找到样品后，使用能够刺激的 GFP（即 488 nm 或 496 nm 激光源）的激光来照亮样品。调整显微镜的光学变焦，使整个 SAM 和阶段 1 花卉原始在视野中。进一步调整激光输出功率和增益设置，以确保最佳的信噪比。
   注：激光的高强度会导致样品的照片漂白。曝光不足和过度曝光的调色板有助于确保更好地调整这些设置。
6. 让样品沉淀2-5分钟。以 0.25 μm-0.5 μm Z 切片间隔以大约 0.3 μm 像素大小的分辨率获取样品的共合 Z 堆栈。确保从样品浸入水中到采集完成，采集一个样品的 Z 堆栈所需的总成像时间不超过 10 分钟。
7. 立即取出水，将培养盒调回生长室。将样品长时间留在水中会影响细胞的渗透状态。

6. SAM 的微机械扰动

1. 设置第 5 节所述的成像条件，并获取皮质显微图组织的预消融图像堆栈。
2. 把文化菜里的水去。使用干净的注射器针（0.4 mm x 20 mm）进行消融。
   1. 使用解剖显微镜，小心地握住针头，慢慢接近SAM。
      注：用放松的抓地力保持呼吸和处理针头有助于避免摇晃。
   2. 用针尖短暂接触 SAM 圆顶，以确认消融已过。优选在SAM的外围执行消融，从而允许可视化圆顶中心区域无组织皮质微管的行为和过渡。
3. 用无菌去维化水重新填充培养皿，并加入二碘化（10 μg/mL）。除了监测GP皮质微管信号外，使用单独的通道可视化碘化丙二烯还可以清楚地标记消融细胞的区域。使用 561 nm 或任何其他合适的激光进行照明，其发射记录在 600-650 nm 之间。
4. 在消融后获取映像堆栈（参见第 6 节），每 2 小时重复一次采集过程，为期 6 小时。每次时间点后，将培养皿和样品一起返回孵化室。确保培养介质上还剩下一些水，用微孔胶带包装培养皿，防止干燥。

7. 数据可视化和量化

1. 使用免费可用的软件（如 MORPHOGRAPHX^{11、FIJI 12}或宏 SurfCut^{13）生成表面投影}。
2. 使用FIFI的FibrilTool14宏进行皮质微^管各向 异性提取。
   注：软件使用的详细协议可以从相应的引文获得。

Representative Results

图 1显示了从 MBD-GFP 线获得的典型投影图像，其中圆顶中心有包含杂乱无章的皮质微管的细胞，而外围的细胞具有圆周分布（图1A，B），而边界域细胞包含与细胞长轴平行的皮质微管。这些观测显示SAM不同域中皮质微管的空间分布差异。时差成像显示皮质微管对齐从高度无序的阵列到消融后 6 小时内更有条理的阵列（图 1C，D）。使用FibrilTool生成的张子可以叠加在皮质微管图像上。长张量表示各向异性的程度越高。张索还显示皮质微管的对齐主轴。提取的信息可以通过在一定时间（图1E）15的盆栽中灌平平均各^{向异性来表示}。建议每种治疗或必须测试的基因型样本大小为四到五。结果表明，皮质微管各向异性在6小时内逐渐增加，并让我们得出结论，对SAM力学的调制会导致皮质微管组织的并发变化。

图1：Arabidopsis SAM中皮质微管各向异性定量和 机械消融的一例 结果。 （A） 35S 的表面投影：MBD-GFP SAM Z 堆栈。（B） 红色神经张，显示中央和边界域中手动分段细胞的皮质微管各向异性。（C，D）消融实验中皮质微管时间差数据的表面投影。（D） 放大图像从 （C） 显示皮质微管重新调整附近的消融站点 （红色星号） 覆盖与单个细胞的内体张量信息.（E） 皮质微管各向异性从0-6h消融后发生变化，从C中标记的内体张量 区域进行量化，圆 表示平均值，柱线表示95%置信区间。比例线 = 25 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

机械信号转导事件的评估对于识别机械感知和转导通路所涉及的分子调节器至关重要。此处描述的协议通过使用皮层微图响应作为 Arabidopsis SAM 中此类过程的读出，提供了此类事件的定量视图。这里描述的程序经常用于各种组织类型^{16，17，18，19的多个研究}。在所有组织类型中，微管各向异性显著增加，在 4 小时范围内。

协议中最关键的一步是确保微管的改变不会因为长时间的水淹没而发生，因为水本身会导致细胞的涡轮压力增加。因此，应尽量减少成像时间。这可能会损害图像分辨率，但它提供了更准确的扰动结果的读出。第二个最关键的步骤是仔细剖析 SAM。由于其非常小的尺寸，它很可能在过程中损坏。如果旧器官的皮根没有完全切除，器官就更难切除。最后，在解剖过程中，由于 SAM 长时间暴露空气，不应允许样品干燥。在处理难以访问或直径小于 50 μm 的突变萨姆时，这尤其常见。在解剖步骤之间频繁在 SAM 上应用水滴可防止此问题。

此过程的一个限制是，对消融区域没有实际控制。这是比较不同条件和基因型变化时的问题。因此，有必要使用以类似方式干扰的控制 SAM 进行比较。另一种选择是使用脉冲紫外激光20进行更可控^的消融。此外，虽然消融是众所周知的，创造机械性能的变化，它也在某种程度上与伤口引起的反应相关。因此，需要执行其他方法，如机械压缩和土石促使的扰动，以确认观测^{结果6，9。}

与其他操纵机械力的方法相比，此方法的一个显著优势是，它使用非常基本的工具，但提供了微管响应的强健读出。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FibrilTool			Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJI			Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
glycine	Merck	1.04201.1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica	DM6000 CS
MAP4-GFP			Marc, J. et al., Plant Cell 1998
micropore tape	Leukopor	02482-00
MorphographX			Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019
myo-inositol	Sigma	I5125
N6-benzyladenine	Sigma	B3408
nicotinic acid	Sigma	N4126
plastic hinged box	Electron microscopy sciences	64312
PPM (Plant Preservative Mixture)	Plant Cell Technology	PPM
Propidium iodide	Sigma	P4864
pyridoxine hydrochloride	Sigma	P9755
SURFCUT			Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
thiamine hydrochloride	Sigma	T4625