הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים חיים של השלד המיקרו-טבובול הקליפתי ב"ירי" ומנטר את תגובתו לשינויים בכוחות הפיזיים.

Abstract

הבנת רגולציה ברמת התא והרקמות של צמיחה ומורחוגנזה כבר בחזית המחקר הביולוגי במשך עשורים רבים. ההתקדמות בטכנולוגיות מולקולריות והדמיה אפשרה לנו לקבל תובנות כיצד אותות ביוכימיים משפיעים על אירועים מורפוגנטיים. עם זאת, זה יותר ויותר ברור כי מלבד אותות ביוכימיים, רמזים מכניים גם להשפיע על מספר היבטים של צמיחת תאים ורקמות. Arabidopsis לירות meristem apical (SAM) הוא מבנה בצורת כיפה אחראי על הדור של כל האיברים מעל פני הקרקע. הארגון של השלד ציטוסק המיקרוטובולה קליפתית כי מתווכת תצהיר תאית אפופלסטית בתאי הצמח הוא ייחודי מרחבית. הדמיה והערכה כמותית של דפוסים של מיקרוטובוליות קליפתיות נחוצים להבנת האופי הביופיזי של תאים ב SAM, כמו תאית הוא המרכיב הנוקשה ביותר של קיר התא צמח. הצורה הסטריאוטיפית של ארגון מיקרוטובולה קליפתית היא גם תוצאה של כוחות פיזיים רחבים רקמות הקיימים ב-SAM. סטייה של כוחות פיזיים אלה וניטור עוקבות של ארגון מיקרוטובולה קליפתית מאפשר זיהוי של חלבונים מועמד מעורב בתיווך תפיסה מכנו ותזוזה. כאן אנו מתארים פרוטוקול המסייע לחקור תהליכים כאלה.

Introduction

תאי הצמח מוקפים מטריצה חוץ תאית של פוליסכרידים ו גליקופרוטינים הדומה מכנית לחומר מרוכב מחוזק סיבים המסוגל לשנות באופן דינמי את תכונותיו המכניות¹. צמיחה בתאי הצמח מונעת על ידי ספיגת מים לתוך התא, מה שופך הצטברות במקביל של כוחות מתיחה על קיר התא. בתגובה לכוחות כאלה, שינויים במצב הפיזי של קיר התא מאפשרים התרחבות תאים. תאים עם קירות ראשיים מסוגלים לעבור צמיחה מהירה לעומת קיר תא משני המכיל תאים בעיקר בשל הבדלים בהרכב הכימי של הפוליסכרידים בפנים. תאי קיר ראשיים מורכבים תאית, hemicellulose, פקטין, בנוסף גליקופרוטינים, וחסר ליגנין, רכיב כי הוא קיים בקיר התא המשני². תאית, פולימר גלוקוז מקושר באמצעות β-1,4 אג"ח, הוא המרכיב העיקרי של קירות התא. הוא מאורגן לתוך מבנים fibrillar המסוגלים לעמוד כוחות מתיחה גבוהה חוו במהלך צמיחת התא^3. בנוסף לכוחות מתיחה עומדים, חיזוק מכני לאורך כיוון מועדף תוצאתו התרחבות מונעת טורגור לאורך ציר ניצב לכיוון נטו של מיקרופיבריל תאית. הארגון של מיקרופיבריל תאית מושפע microtubule קליפתי cytoskeleton, כפי שהם מנחים את התנועה הכיוונית של תאית סינתזה מורכבים הממוקמים קרום פלזמה^4. לכן, ניטור ארגון microtubule קליפתי באמצעות חלבון או צינור הקשורים microtubule התמזגו עם מולקולת פלורסנט משמש פרוקסי לתצפית על דפוסים של תאית בתאי הצמח.

התבניות של השלד ציטוסק microtubule קליפתי נמצא תחת שליטה של מורפולוגיה תא ורקמות נגזר כוחות מכניים. ארגון microtubule קליפתי אין כל ארגון מועדף לאורך זמן בתאים הממוקמים בשיאו של SAM, בעוד תאים בפריפריה ואת הגבול בין SAM האיבר המתעוררים יש יציב, מערך סופר-גולגולתי מאורגן מאוד של מיקרוטובולות^{קליפתיות 5}. מספר גישות פותחו כדי לפגוע פיזית במצב המכני של התאים. שינויים במצב osmotic, כמו גם טיפול עם תרכובות פרמקולוגיות אנזימטיות המשפיעות על הנוקשות של קיר התא יכול לגרום לשינויים הבאים בכוחות מתיחה^{שחוו תא 6,7}. השימוש במתקן המאפשר עלייה הדרגתית בכוחות הלחץ שחוו רקמות הוא חלופה נוספת^8. יישום של כוחות צנטריפוגליים גם הופק להשפיע על הכוחות המכניים ללא כל מגע פיזי עם התאים^9. עם זאת, האמצעים הנפוצים ביותר של שינוי כוחות כיווניים בקבוצת תאים לנצל את העובדה כי כל התאים האפידרמיס נמצאים תחת מתח אבלציה פיזית של תאים יבטל את לחץ turgor באופן מקומי, כמו גם לשבש הדבקה מתא לתא, ובכך לשנות את כוחות מתיחה שחוו התאים השכנים. זה מבוצע או על ידי מיקוד לייזר אולטרה סגול פעמו רב עוצמה או באמצעות מחט בסדר.

כאן אנו מפרטים על תהליך ההדמיה וההערכה של התנהגות מיקרוטובולה קליפתית עבור סטייה מכנית ב SAM.

Protocol

1. גידול צמחים

1. לזרוע זרעי Arabidopsis המביעים תחום מחייב microtubule התמזגו עם חלבון פלורסנט ירוק (MBD-GFP)¹⁰ על הקרקע ולשמור ביום ארוך (16 שעות יום / 8 שעות בלילה), 20 מעלות C / 6 ° C תנאים במשך שבוע אחד לנביטה.
2. לאחר הנביטה, להעביר שתילים סירים חדשים עם שטח צמיחה מספיק כדי לאפשר צמיחה צמחית חזקה. לשמור על צמחים ביום קצר (8 שעות ביום / 16 שעות בלילה), 20 מעלות צלזיוס / 16 ° C תנאים במשך 3-5 שבועות.
3. להעביר צמחים ליום ארוך (16 שעות ביום / 8 שעות בלילה), 20 מעלות צלזיוס / 16 מעלות צלזיוס תנאים ולשמור עד צמחים בריח (2-3 שבועות). אפשר לתנופה לגדול עד 2-5 ס"מ.

2. הכנה בינונית

1. מכינים את המנות על ידי מילוי מנות פטרי קטנות (ברוחב של כ-5.5 ס"מ, בעומק של 1.5 ס"מ) לכמחצית מהעומק שלהן עם 2% א-גרוז. ניתן להשתמש בכלי ה לנתח גם להדמיה חד-ית-ממדית.
2. הכן את מדיום הצמיחה.
   1. להכין 50 מ"ל של תמיסת ויטמין 1,000x עם 5 גרם של מיו-אינוזיטול, 0.05 גרם של חומצה nicotinic, 0.05 גרם של הידרוכלוריד פירידוקסין, 0.5 גרם של תיאמין הידרוכלוריד, ו 0.1 גרם של גלצין.
   2. הכינו את מדיום הצמיחה, המורכב מ-1/2 Murashige ו-Skoog medium, 1% סוכרוז, 1.6% אגר, ויטמינים 1x, pH = 5.8. Autoclave ולאפשר לו להתקרר.
   3. על ספסל סטרילי ונקי, מחטאים קופסאות פלסטיק תלויות (כ-5.2 ס"מ על 5.2 ס"מ על 3 ס"מ) על ידי טבילה ב-70% אתנול למשך 15 דקות.
   4. על ספסל סטרילי ונקי, ברגע שהמדיום נמצא בחום נסבל, מוסיפים N6-benzyladenine לריכוז סופי של 200 00 00 00 00 00 00 00:00:00,000 ,1/100 דפים חמים (תערובת משמרת של הצמח) ומערבבים היטב. ממלאים את הקופסאות הסטריליות לכמחצית מהעומק שלהן במדיום.

3. פירוק SAM

1. חותכים את התפרחת ולהסיר את ניצני הפרחים הישנים עם מפלצות חדות על ידי קילוף הפרחים בבסיס ה-peduncles עד שקשה לראות אותם בעין בלתי.
2. יוצרים חתך באגרוז בצלחת הקטנת עם מפלצות ושותלים את בסיס התפלה לתוך הגר העבה. זה נותן תמיכה מוצקה טובה עבור ניתוח בסדר נוסף של פרחים צעירים כדי לחשוף את SAM.
3. הסר את ניצני הפרחים הנותרים על-ידי דחיפתם כלפי מטה עם המגרסה המחליקה ביותר ומתקדמת באופן רציפים לשלבים הצעירים יותר תחת מיקרוסקופ לנתח עד שה-SAM נראה לעין. SAM חשוף בדרך כלל כאשר פרחים ישנים עד שלב 6 עד 7 מוסרים. לאחר חשיפה של SAM, הימנע מהתייבשות הדגימה על-ידי מעבר מהיר לשלב הבא.

4. העברה וצמיחה של כספומטים תרבותיים

1. לשתול את המדגם טרי לנתח כמפורט בסעיף 1 לתוך מדיום הצמיחה בתיבת התרבות מלבני פלסטיק צירים עם SAM רק נחשף מעל פני השטח הבינוני. הוסף כמה טיפות של מים ילייליים לקצוות של תיבות התרבות ולסגור את המכסה כדי לשמור על הלחות בתוך הקופסה. ודא שהמים הנוספים אינם מכסים את SAM.
2. סגור את המכסה ועטוף את התיבה בקלטת מיקרופור. מקם את תיבת הצמיחה בתנאי יום ארוך או יום רציף ב 22 °C ולגדול במשך 12-24 שעות כדי לאפשר SAM להתאושש מהליך הניתוק ולהתאים את עצמו לתנאי התרבות.

5. הדמיה של SAM

1. מלא את תיבת התרבות המכילה את SAM במים סטריליים כדי לכסות את הדגימה. בדוק תחת מיקרוסקופ לנתח ולהסיר את כל בועות אוויר על ידי ריסוס בכוח מים מכוון לדגימה עם פיפטה 1 מ"ל.
2. מניחים את תיבת התרבות על שלב מיקרוסקופ קונפוקאלי זקוף. דאג כי תיבת התרבות אינה יוצרת קשר עם מטרות המיקרוסקופ. השתמשו בעדשת טבילה מים למרחקים ארוכים של 40x או 60x של צמצם מספרי 0.8-1, האופטימלית להדמיה ללא זכוכית כיסוי.
3. הנמיך את המטרה לתוך המים ובדוק בועות אוויר שנוצרו על העדשה הקדמית של המטרה. הסר את כל הבועות על ידי הורדת הבמה ולנגב בעדינות את העדשה עם רקמה אופטית והוספת כמות קטנה של מים לעדשה הקדמית של המטרה עם פיפטה פסטר לפני reimmersion לתוך המים.
4. באמצעות מסנן GFP ומודול תאורת אפינפרין של המיקרוסקופ הנוקודאלי, התאם את בקר ה-XY כדי לאתר את הדגימה. כוונון מיקום עינית, לשים את SAM ישירות מתחת למקור האור ולהתמקד לאורך ציר Z עד ממוקם העל.
   הערה: אל תסתכל ישירות על האור האולטרה סגול.
5. ברגע שהדגימה נמצאת, להאיר אותו באמצעות לייזר מסוגל GFP מרגש (כלומר, 488 נארם או 496 nm מקור לייזר). כוונן את הזום האופטי של המיקרוסקופ כך שכל SAM ופרמורדיה פרחונית שלב 1 יהיה בשדה התצוגה. כוונן עוד יותר את העוצמה של פלט הלייזר והשיג הגדרות כדי להבטיח יחס מיטבי של אות לרעש.
   הערה: העוצמה הגבוהה של הלייזר תגרום להלבנת תמונה של המדגם. לוח הצבעים מתחת וחשיפת יתר מסייע להבטיח התאמה טובה יותר של הגדרות אלה.
6. אפשר לדגימה להתיישב במשך 2-5 דקות. רכוש ערימות Z קונפוקלי של המדגם ב 0.25 μm-0.5 μm Z מרווחי פרוסה ברזולוציה של כ 0.3 μm גודל פיקסל. ודא שזמן ההדמיה הכולל הנדרש לרכישת ערימות Z עבור מדגם אחד אינו עולה על 10 דקות מזמן טבילה הדגימה במים עד להשלמת הרכישה.
7. מיד להסיר את המים ולהעביר את תיבת התרבות בחזרה לתא הצמיחה. שמירה על הדגימות במשך זמן רב מתחת למים תשפיע על המצב האוסמוטי של התאים.

6. תדהמה מיקרומכנית של SAM

1. הגדר את תנאי ההדמיה כמתואר בסעיף 5 ורכוש ערימות של תמונות קדם-דם של ארגון המיקרו-טבולה הקליפתית.
2. לתן את המים בצלחת התרבות. בצע את אבלציה עם מחט מזרק נקי (0.4 מ"מ x 20 מ"מ).
   1. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, בזהירות להחזיק את המחט ולגשת לאט SAM.
      הערה: החזקת נשימה וטיפול במחט עם אחיזה רגועה מסייעת להימנע מרעידות.
   2. צרו קשר קצר עם כיפת SAM עם קצה המחט כדי לאשר כי אבלציה נעשתה. עדיף לבצע את אבלציה בפריפריה של SAM, המאפשר הדמיה של ההתנהגות ומעבר של microtubules קליפתיים לא מאורגנים באזור המרכזי של הכיפה.
3. למלא מחדש את צלחת התרבות עם מים deionized סטרילי ולהוסיף idodide propidium (10 μg / מ"ל). בנוסף לניטור אות המיקרוטבול הקליפתי GFP, הדמיית הנואידיום של הנואידיד באמצעות ערוץ נפרד יכולה לסמן בבירור אזורים של תאים מבלבלים. פרופידיום iodide מואר באמצעות 561 נמיר או כל לייזר מתאים אחר עם פליטה נרשם בין 600-650 נמיר.
4. רכוש ערימות תמונה מיד לאחר אבלציה (ראה סעיף 6) וחזור על תהליך הרכישה כל 2 שעות לתקופה של 6 שעות. מחזירים את צלחת התרבות יחד עם הדגימה לתא הדגירה לאחר כל נקודת זמן. ודאו שנשארו מים בתקשורת התרבות ועטפו את מנת התרבות בקלטת מיקרופור כדי למנוע היבש.

7. הדמיה של נתונים וכמות

1. צור הקרנת פני השטח באמצעות תוכנות זמינות באופן חופשי כגון MORPHOGRAPHX¹¹,^{פיג'י 12}, או מאקרו SurfCut¹³.
2. לבצע חילוץ של אניסטרופיה מיקרוטובול קליפתי באמצעות FibrilTool^{14 מאקרו} בפיג'י.
   הערה: ניתן להשיג פרוטוקולים מפורטים לשימוש בתוכנה מהציטוטים המתאימים.

Representative Results

איור 1 מציג תמונות הקרנה אופייניות המתקבלות מקווי MBD-GFP עם תאים במרכז הכיפה המכילים מיקרוטובולות קליפתיות לא מאורגנות, ותאים בפריפריה בעליהתפלגות היקף (איור 1A,B), בעודשתאי תחום הגבול מכילים מיקרוטובולות קליפתיות המיושרות במקביל לציר הארוך של התא. תצפיות אלה מראות הבדלים בהתפלגות המרחבית של מיקרוטובולות קליפתיות בתחומים השונים של SAM. הדמיית זמן לשגות הראה יישור מיקרוטובולה קליפתית משתנה ממערך מופרע מאוד למערך מאורגן יותר בתוך 6 שעות של אבלציה (איור 1C,D). הטנטורים שנוצרו באמצעות FibrilTool יכולים להיות מודבקים על תמונת המיקרוטובולה הקליפתית. טנסור ארוך יותר ייצג רמה גבוהה יותר של אניסוטרופיה. הטנרסורס גם הראו את הציר העיקרי של יישור המיקרוטובולות הקליפתיות. המידע שחולץ יכול להיות מיוצג על ידי עציצים anisotropy ממוצע לאורך זמן (איור 1E)¹⁵. גודל מדגם של ארבעה עד חמישה מומלץ לכל טיפול או גנוטיפ שיש לבדוק. התוצאות הראו עלייה הדרגתית באניקוטרופיה מיקרוטובול קליפתי בתוך תקופה של 6 שעות ואפשרו לנו להסיק כי אפנון מכניקה של SAM תוצאות שינויים בו זמנית בארגון microtubule קליפתי.

איור 1: תוצאה לדוגמה של כימות אניסטרופיה מיקרוטובולה קליפתית ואבלציה מכנית ב Arabidopsis SAM. (A) הקרנת פני השטח של ערימות 35S: MBD-GFP SAM Z. (ב)טנורים נמטיים באדום המציגים אניסטרופיה מיקרוטובולה קליפתית של תאים מחולקים באופן ידני בתחום המרכזי וגבול. אני לאיודע מה לעשות. הקרנת פני השטח של נתוני זמן המיקרו-תבליט הקליפתי מניסוי אבלציה. (D)תמונות מוגדלות מ (C) מראה יישור מחדש microtubule קליפתי ליד האתר של אבלציה (כוכבית אדומה) מכוסה מידע טנסור nematic של תאים בודדים. (ה)אניסטרופיה מיקרוטובולה קליפתית השתנתה לאחר אבלציה מ- 0-6 שעות, מכמתת מאזור הטנסור הנמטי המסומן ב- C עם המעגל המייצג את הערך ממוצע ואת הסורגים המציינים את מרווח הביטחון של 95%. קנה מידה ברים = 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

ההערכה של אירועי תמרת אותות מכניים היא קריטית לזיהוי רגולטורים מולקולריים המעורבים במסלולי התפיסה והמתמר המכנו. הפרוטוקול המתואר כאן מספק תצוגה כמותית של אירועים כאלה באמצעות תגובת microtubule קליפתי כקריאה עבור תהליך כזה ב- Arabidopsis SAMs. ההליך המתואר כאן משמש באופן שגרתי במספר מחקרים בסוגי^{רקמות שונים 16,17,18,19}. עלייה משמעותית אניסטרופיה microtubule נצפתה בטווח של 4 שעות בכל סוגי הרקמות.

הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא להבטיח כי שינויים במיקרוטובולים לא יתרחשו בשל שקוע ממושך במים, כי מים על התוצאות שלהם לעלייה של לחץ מערבולת של התאים. לכן, יש למזער את זמן ההדמיה. הדבר עלול לסכן את רזולוציית התמונה, אך היא מספקת קריאה מדויקת יותר של תוצאות ההתרה. הצעד השני המכריע ביותר הוא פירוק זהיר של SAM. בשל גודלו הקטן מאוד, הוא עלול להיפגע במהלך ההליך. האיברים הופכים להיות קשים יותר להסיר אם peduncles של איברים ישנים אינם מוסרים לחלוטין. לבסוף, במהלך הפירוק אין לאפשר לדגימה להתייבש עקב חשיפה ממושכת לאוויר של SAM. הדבר נפוץ במיוחד בעת טיפול ב- SAMs מוטציה שקשה לגשת אליהם או שהם קטנים מ-50 μm בקוטר. יישום תכוף של טיפות מים על SAM בין שלבי הפירוק למנוע בעיה זו.

מגבלה של הליך זה היא שאין שליטה אמיתית על האזור המפוברק. זוהי בעיה בהשוואת שינויים המתרחשים בתנאים וגנוטיפים שונים. לכן, יש צורך להשתמש בפקד SAMs מוטרד באופן דומה להשוואה. חלופה נוספת היא ביצוע אבלציה מבוקרת יותר באמצעות לייזר אולטרה סגול פעמו²⁰. בנוסף, בעוד אבלציה ידועה כדי ליצור שינויים במאפיינים מכניים, זה גם קשור במידה מסוימת עם תגובות שנגרמו הפצע. מסיבה זו, יש לבצע גישות אחרות, כגון דחיסה מכנית וחדירה הנגרמת על-ידי טורגור כדי לאשר את^{התצפיות 6,9}.

יתרון משמעותי של שיטה זו בהשוואה לדרכים אחרות של מניפולציה כוחות מכניים הוא שהיא משתמשת בכלים בסיסיים מאוד עדיין מספק קריאה חזקה של תגובת microtubule.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FibrilTool			Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014
FIJI			Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012
glycine	Merck	1.04201.1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica	DM6000 CS
MAP4-GFP			Marc, J. et al., Plant Cell 1998
micropore tape	Leukopor	02482-00
MorphographX			Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019
myo-inositol	Sigma	I5125
N6-benzyladenine	Sigma	B3408
nicotinic acid	Sigma	N4126
plastic hinged box	Electron microscopy sciences	64312
PPM (Plant Preservative Mixture)	Plant Cell Technology	PPM
Propidium iodide	Sigma	P4864
pyridoxine hydrochloride	Sigma	P9755
SURFCUT			Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019
thiamine hydrochloride	Sigma	T4625