Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Live-Zell-Bildgebung des kortikalen Mikrotubule-Zytoskeletts am triebförmigen Meristem und die Überwachung seiner Reaktion auf Veränderungen der physikalischen Kräfte.
Abstract
Das Verständnis der Regulierung von Wachstum und Morphogenese auf Zell- und Gewebeebene steht seit vielen Jahrzehnten an vorderster Front der biologischen Forschung. Fortschritte in molekularen und bildgebenden Technologien ermöglichten es uns, Einblicke zu gewinnen, wie biochemische Signale morphogenetische Ereignisse beeinflussen. Es wird jedoch immer deutlicher, dass neben biochemischen Signalen auch mechanische Hinweise mehrere Aspekte des Zell- und Gewebewachstums beeinflussen. Der Arabidopsis-Schieß-Apischer Meristem (SAM) ist eine kuppelförmige Struktur, die für die Erzeugung aller oberirdischen Organe verantwortlich ist. Die Organisation des kortikalen Mikrotubuli-Zytoskeletts, das apoplastische Zelluloseablagerungen in Pflanzenzellen vermittelt, ist räumlich unterschiedlich. Die Visualisierung und quantitative Bewertung von Mustern kortikaler Mikrotubuli ist notwendig, um die biophysikalische Natur von Zellen am SAM zu verstehen, da Zellulose die steifste Komponente der Pflanzenzellwand ist. Die stereotype Form der kortikalen Mikrotubuli-Organisation ist auch eine Folge der gewebeweiten physikalischen Kräfte, die am SAM vorhanden sind. Die Störung dieser physikalischen Kräfte und die anschließende Überwachung der kortikalen Mikrotubuli-Organisation ermöglicht die Identifizierung von Kandidatenproteinen, die an der Vermittlung von Mechano-Wahrnehmung und Transduktion beteiligt sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das hilft, solche Prozesse zu untersuchen.
Introduction
Pflanzenzellen sind von einer extrazellulären Matrix aus Polysacchariden und Glykoproteinen umgeben, die mechanisch einem faserverstärkten Verbundwerkstoff ähnelt, der seine mechanischen Eigenschaften dynamisch verändern kann1. Das Wachstum der Pflanzenzellen wird durch die Aufnahme von Wasser in die Zelle angetrieben, was zu einer gleichzeitigen Ansammlung von Zugkräften an der Zellwand führt. Als Reaktion auf solche Kräfte ermöglichen Modifikationen des physikalischen Zustands der Zellwand eine Zellexpansion. Zellen mit Primärwänden sind in der Lage, im Vergleich zu sekundären Zellwand enthaltenden Zellen ein schnelles Wachstum zu verzeichnen, hauptsächlich aufgrund von Unterschieden in der chemischen Zusammensetzung der Polysaccharide im Inneren. Primäre Wandzellen bestehen aus Cellulose, Hemicellulose und Pektin zusätzlich zu Glykoproteinen und fehlen Lignin, einer Komponente, die in der sekundären Zellwand2vorhanden ist. Cellulose, ein Glukosepolymer, das über β-1,4-Bindungen verbunden ist, ist der Hauptbestandteil der Zellwände. Es ist in fibrillare Strukturen organisiert, die in der Lage sind, hohen Zugkräften zu standzuhalten, die während des Zellwachstums erfahren werden3. Neben zugfesten Zugkräften führt die mechanische Verstärkung entlang einer bevorzugten Richtung zu einer turgorengetriebenen Ausdehnung entlang einer Achse senkrecht zur Netzausrichtung des Cellulose-Mikrofibrils. Die Organisation der Cellulose-Mikrofibrillen wird durch das kortikale Mikrotubuli-Zytoskelett beeinflusst, da sie die Richtungsbewegung der Cellulose-Synthesizing-Komplexe an der Plasmamembran4leiten. Daher dient die Überwachung der kortikalen Mikrotubuli-Organisation mit einem Mikrotubuli-assoziierten Protein oder Tubulin, das mit einem fluoreszierenden Molekül verschmolzen wird, als Proxy für die Beobachtung von darüber liegenden Mustern von Zellulose in Pflanzenzellen.
Die Musterung des kortikalen Mikrotubuli-Zytoskeletts ist unter der Kontrolle von Zell- und Gewebemorphologie abgeleiteten mechanischen Kräften. Kortikale Mikrotubuli-Organisation hat keine bevorzugte Organisation im Laufe der Zeit in Zellen, die sich an der Spitze des SAM befinden, während Zellen in der Peripherie und der Grenze zwischen dem SAM und dem entstehenden Organ eine stabile, hochorganisierte suprazelluläre Anordnung von kortikalen Mikrotubuli5haben. Es wurden mehrere Ansätze entwickelt, um den mechanischen Status der Zellen physisch zu stören. Veränderungen des osmotischen Status sowie die Behandlung mit pharmakologischen und enzymatischen Verbindungen, die die Steifigkeit der Zellwand beeinflussen, können zu nachträglichen Veränderungen der Zugkräfte der Zelle6,7führen. Die Verwendung von Kontraptionen, die eine allmähliche Zunahme der Druckkräfte durch Gewebe ermöglichen, ist eine weitere Alternative8. Die Anwendung von Fliehkräften hat auch gezeigt, dass die mechanischen Kräfte ohne physischen Kontakt mit den Zellenbeeinflussen 9. Die am weitesten verbreiteten Mittel zur Änderung der Richtungskräfte in einer Gruppe von Zellen nutzen jedoch die Tatsache, dass alle epidermalen Zellen unter Spannung stehen und die physikalische Ablation der Zellen den Turgorendruck lokal eliminiert und die Zell-zu-Zell-Adhäsion stört und dadurch die Zugkräfte der benachbarten Zellen verändert. Dies geschieht entweder durch gezieltes Targeting eines hochleistungsbetriebenen, gepulsten ULTRAviolettlasers oder mittels einer feinen Nadel.
Hier erarbeiten wir den Prozess der Bildgebung und Bewertung des kortikalen Mikrotubuli-Verhaltens für mechanische Störungen am SAM.
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Protocol
1. Pflanzenwachstum
- Säen Arabidopsis Samen, die Mikrotubuli-Bindungsdomäne mit grünem fluoreszierendem Protein (MBD-GFP)10 auf dem Boden verschmelzen und in langen Tagen (16 h Tag /8 h Nacht), 20 °C/6 °C Bedingungen für 1 Woche für die Keimung halten.
- Nach der Keimung Sämlinge in neue Töpfe mit ausreichend Wachstumsraum übertragen, um ein robustes vegetatives Wachstum zu ermöglichen. Halten Sie die Pflanzen in kurzen Tagen (8 h Tag /16 h Nacht), 20 °C / 16 °C Bedingungen für 3-5 Wochen.
- Pflanzen auf langen Tag (16 h Tag /8 h Nacht), 20 °C/16 °C Bedingungen übertragen und bis zum Pflanzenbolzen (2-3 Wochen) halten. Lassen Sie den Blütenstand bis zu 2-5 cm lang werden.
2. Mittlere Vorbereitung
- Bereiten Sie die sezierenden Gerichte vor, indem Sie kleine Petri-Gerichte (ca. 5,5 cm breit, 1,5 cm tief) bis etwa zur Hälfte ihrer Tiefe mit 2% Agarose füllen. Die sezierenden Gerichte könnten auch für die Einzelzeitpunkt-Bildgebung verwendet werden.
- Bereiten Sie das Wachstumsmedium vor.
- 50 ml einer 1.000-fachen Vitamin-Stammlösung mit 5 g Myo-Inositol, 0,05 g Nikotinsäure, 0,05 g Pyridoxinhydrochlorid, 0,5 g Thiaminhydrochlorid und 0,1 g Glycin zubereiten.
- Bereiten Sie das Wachstumsmedium, bestehend aus 1/2 Murashige und Skoog Medium, 1% Saccharose, 1,6% Agar, 1x Vitamine, pH = 5,8. Autoklav und lassen Sie es abkühlen.
- Auf einer sterilen, sauberen Bank, sterilisieren Scharnier Kunststoff-Boxen (ca. 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) durch Eintauchen in 70% Ethanol für 15 min.
- Auf einer sterilen, sauberen Bank, sobald das Medium bei erträglicher Wärme ist, N6-Benzyladenin zu einer Endkonzentration von 200 nM und 1/1.000 PPM (Pflanzenschutzmittelmischung) hinzufügen und gut mischen. Füllen Sie die sterilen Boxen bis etwa die Hälfte ihrer Tiefe mit dem Medium.
3. Sezieren des SAM
- Schneiden Sie den Blütenstand und entfernen Sie die älteren Blütenknospen mit scharfen Zangen, indem Sie die Blüten an der Basis der Peuner, bis es schwierig ist, sie mit dem bloßen Auge zu sehen.
- Erstellen Sie einen Schlitz in der Agarose in der Sezierenschale mit Zange und pflanzen Sie die Blütenstandbasis in den dicken Agar. Dies gibt eine gute solide Unterstützung für weitere feine Sezieren von jüngeren Blumen, um das SAM zu entlarven.
- Entfernen Sie die verbleibenden Blütenknospen, indem Sie sie mit den Zangen nach unten drücken, beginnend mit der ältesten und sequenziell fortschreitenden zu den jüngeren Stadien unter einem Sezierendes Mikroskop, bis das SAM sichtbar ist. Das SAM wird in der Regel ausgesetzt, wenn ältere Blüten bis Stufe 6 bis 7 entfernt werden. Sobald das SAM freigelegt ist, vermeiden Sie die Austrocknung der Probe, indem Sie schnell zum nächsten Schritt wechseln.
4. Transfer und Wachstum von kultivierten SAMs
- Pflanzen Sie die frisch sezierte Probe, wie in Abschnitt 1 beschrieben, in das Wachstumsmedium in die rechteckige Kunststoff-Scharnierkulturbox mit dem SAM, der nur über der mittleren Oberfläche freigelegt ist. Fügen Sie ein paar Tropfen sterilen entionisierten Wassers an die Ränder der Kulturboxen und schließen Sie den Deckel, um die Feuchtigkeit in der Box zu halten. Stellen Sie sicher, dass das zugesetzte Wasser das SAM nicht abdeckt.
- Schließen Sie den Deckel und wickeln Sie die Box mit Mikroporenband. Stellen Sie die Wachstumsbox bei langen oder durchgehenden Tagesbedingungen bei 22 °C und wachsen Sie für 12-24 h, damit sich das SAM vom Sezierverfahren erholen und sich an die Kulturbedingungen anpassen kann.
5. Bildgebung des SAM
- Füllen Sie die Kulturbox mit dem SAM mit sterilem entionisiertem Wasser, um die Probe zu bedecken. Überprüfen Sie unter dem Sezieren des Mikroskops und entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie mit einer 1 ml Pipette das auf die Probe gerichtete Wasser kräftig sprühen.
- Platzieren Sie die Kulturbox auf einer aufrechten konfokalen Mikroskopbühne. Achten Sie darauf, dass die Kulturbox nicht mit den Mikroskopobjektiven in Berührung kommt. Verwenden Sie eine 40-fache 40-fache oder 60-fache Wassertauchlinse mit numerischer Blende 0,8-1, die für die Bildgebung ohne Deckglas optimal ist.
- Senken Sie das Objektiv ins Wasser und überprüfen Sie die luftblasen, die auf der Vorderseite des Objektivs gebildet werden. Entfernen Sie Blasen, indem Sie die Bühne senken und die Linse vorsichtig mit einem optischen Gewebe abwischen und eine kleine Menge Wasser mit einer Pasteur-Pipette in die Vorderlinse des Objektivs geben, bevor Sie wieder ins Wasser eintauchen.
- Passen Sie mit dem GFP-Filter und dem Epi-Beleuchtungsmodul des Konfokalmikroskops den XY-Controller an, um die Probe zu lokalisieren. Passen Sie die Position des Okulars an, legen Sie das SAM direkt unter die Lichtquelle und fokussieren Sie entlang der Z-Achse, bis sich der Scheitelpunkt befindet.
HINWEIS: Schauen Sie nicht direkt auf das ultraviolette Licht. - Sobald die Probe gefunden ist, beleuchten Sie sie mit einem Laser, der in der Lage ist, spannende GFP (d. h. eine 488 nm oder 496 nm Laserquelle). Passen Sie den optischen Zoom des Mikroskops so an, dass sich das gesamte SAM und die Floral Primordia der Stufe 1 im Sichtfeld befinden. Stellen Sie die Leistung des Laserausgangs und der Verstärkungseinstellungen weiter ein, um ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten.
HINWEIS: Die hohe Intensität des Lasers führt zu einer Fotobleiche der Probe. Die Unter- und Überbelichtungspalette trägt zu einer besseren Anpassung dieser Einstellungen bei. - Lassen Sie die Probe für 2-5 min absetzen. Erfassen Sie konfokale Z-Stacks der Probe in 1,25 -0,5-m-Z-Slice-Intervallen bei einer Auflösung von ca. 0,3 m Pixelgröße. Stellen Sie sicher, dass die für den Erwerb von Z-Stacks für eine Probe erforderliche Gesamtbildzeit 10 min vom Eintauchen der Probe in Wasser bis zum Abschluss der Erfassung nicht überschreitet.
- Entfernen Sie sofort das Wasser und übertragen Sie die Kulturbox zurück in die Wachstumskammer. Die Proben lange unter Wasser zu halten, wird den osmotischen Status der Zellen beeinflussen.
6. Mikromechanische Störung des SAM
- Richten Sie die bildgebenden Bedingungen wie in Abschnitt 5 beschrieben ein und erfassen Sie Präablationsbildstapel der kortikalen Mikrotubuli-Organisation.
- Dekant das Wasser in der Kulturschale. Führen Sie die Ablation mit einer sauberen Spritzennadel (0,4 mm x 20 mm) durch.
- Halten Sie mit einem Sezierendes Mikroskop die Nadel vorsichtig fest und nähern Sie sich langsam dem SAM.
HINWEIS: Atemhalten und Umgang mit der Nadel mit einem entspannten Griff hilft, Schütteln zu vermeiden. - Kontaktieren Sie die SAM-Kuppel kurz mit der Nadelspitze, um zu bestätigen, dass die Ablation erfolgt ist. Führen Sie vorzugsweise die Ablation an der Peripherie des SAM durch, was die Visualisierung des Verhaltens und übergangsweise unorganisierter kortikaler Mikrotubuli im zentralen Bereich der Kuppel ermöglicht.
- Halten Sie mit einem Sezierendes Mikroskop die Nadel vorsichtig fest und nähern Sie sich langsam dem SAM.
- Füllen Sie das Kulturgericht mit sterilem entionisiertem Wasser auf und fügen Sie Propidium idodide (10 g/ml) hinzu. Neben der Überwachung des GFP-Kortikal-Mikrotubuli-Signals kann die Visualisierung des Propidiumjodids mit einem separaten Kanal Bereiche von abierten Zellen deutlich markieren. Propidiumiodid wird mit dem 561 nm oder einem anderen geeigneten Laser mit Emissionswerten zwischen 600-650 nm beleuchtet.
- Erfassen Sie Bildstapel direkt nach der Ablation (siehe Abschnitt 6) und wiederholen Sie den Erfassungsprozess alle 2 h für einen Zeitraum von 6 h. Geben Sie das Kulturgericht zusammen mit der Probe nach jedem Zeitpunkt in die Inkubationskammer zurück. Stellen Sie sicher, dass noch etwas Wasser auf den Kulturmedien vorhanden ist, und wickeln Sie das Kulturgericht mit Mikroporenband, um austrocknung zu verhindern.
7. Datenvisualisierung und Quantifizierung
- Generieren Sie Oberflächenprojektionen mit frei verfügbarer Software wie MORPHOGRAPHX11, FIJI12oder Makro SurfCut13.
- Führen Sie die Extraktion der kortikalen Mikrotubuli-Anisotropie mit FibrilTool14 Makro in FIJI.
HINWEIS: Detaillierte Protokolle für die Softwarenutzung können aus den jeweiligen Zitaten abgerufen werden.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt typische Projektionsbilder aus MBD-GFP-Linien mit Zellen in der Mitte der Kuppel, die unorganisierte kortikale Mikrotubuli enthalten, und Zellen an der Peripherie mit einer Umfangsverteilung (Abbildung 1A,B), während die Grenzbereichszellen kortikale Mikrotubuli enthalten, die parallel zur langen Achse der Zelle ausgerichtet sind. Diese Beobachtungen zeigen Unterschiede in der räumlichen Verteilung kortikaler Mikrotubuli in den verschiedenen Domänen des SAM. Die Zeitraffer-Bildgebung zeigte die kortikale Mikrotubuli-Ausrichtung, die sich von einem stark ungeordneten Array zu einem besser organisierten Array innerhalb von 6 h Ablation wandelte (Abbildung 1C,D). Die mit FibrilTool erzeugten Tensoren könnten auf dem kortikalen Mikrotubuli-Bild überlagert werden. Ein längerer Tensor stellte einen höheren Grad der Anisotropie dar. Die Tensoren zeigten auch die Hauptachse der Ausrichtung der kortikalen Mikrotubuli. Die extrahierten Informationen können dargestellt werden, indem der mittlere Anisotropie im Laufe der Zeit eintopft wird (Abbildung 1E)15. Pro Zufeinerungs- oder Genotyp wird eine Stichprobengröße von vier bis fünf empfohlen. Die Ergebnisse zeigten eine allmähliche Zunahme der kortikalen Mikrotubuli-Anisotropie innerhalb eines Zeitraums von 6 h und erlaubten uns zu dem Schluss zu kommen, dass die Modulation zur Mechanik des SAM zu gleichzeitigen Veränderungen in der kortikalen Mikrotubuli-Organisation führt.
Abbildung 1: Beispielergebnis der kortikalen Mikrotubuli-Anisotropiequantifizierung und mechanischen Ablation in Arabidopsis SAM. (A) Oberflächenprojektion von 35S: MBD-GFP SAM Z-Stacks. (B) Nematische Tensoren in Rot, die kortikale Mikrotubuli-Anisotropie manuell segmentierter Zellen im Mittel- und Grenzbereich zeigen. (C,D). Oberflächenprojektionen von kortikalen Mikrotubuli-Zeitrafferdaten aus einem Ablationsexperiment. (D) Vergrößerte Bilder von (C) zeigen die kortikale Mikrotubuli-Neuausrichtung in der Nähe des Ablationsortes (rotes Sternchen), überlagert mit nematischen Tensorinformationen einzelner Zellen. (E) Die kortikale Mikrotubuli-Anisotropie änderte sich nach Ablation von 0-6 h, quantifiziert aus dem nematischen Tensor beschrifteten Bereich in C mit dem Kreis, der den Mittelwert darstellt, und den Balken, die das 95%-Konfidenzintervall angeben. Skalenbalken = 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Bewertung mechanischer Signaltransduktionsereignisse ist entscheidend, um molekulare Regulatoren zu identifizieren, die an den Mechano-Wahrnehmungs- und Transduktionswegen beteiligt sind. Das hier beschriebene Protokoll bietet eine quantitative Ansicht solcher Ereignisse, indem die kortikale Mikrotubuli-Antwort als Auslesung für einen solchen Prozess in Arabidopsis-SAMs verwendet wird. Das hier beschriebene Verfahren wird routinemäßig in mehreren Studien an verschiedenen Gewebetypen16,17,18,19verwendet. Eine signifikante Zunahme der Mikrotubuli-Anisotropie wird im Bereich von 4 h in allen Gewebetypen beobachtet.
Der wichtigste Schritt im Protokoll ist sicherzustellen, dass Veränderungen an den Mikrotubuli nicht aufgrund eines längeren Eintauchens in Wasser auftreten, da Wasser allein zu einer Erhöhung des Turgordrucks der Zellen führt. Daher sollte die Bildzeit minimiert werden. Dies kann die Bildauflösung beeinträchtigen, bietet jedoch eine genauere Auslesung der Störergebnisse. Der zweitwichtigste Schritt ist die sorgfältige Zerlegung des SAM. Aufgrund seiner sehr geringen Größe ist es sehr wahrscheinlich, während des Verfahrens beschädigt zu werden. Die Organe werden schwieriger zu entfernen, wenn die Peunkel älterer Organe nicht vollständig entfernt werden. Schließlich sollte die Probe während der Zerlegung aufgrund der längeren Luftexposition des SAM nicht austrocknen dürfen. Dies ist besonders häufig bei der Handhabung von mutierten SAMs, die schwer zugänglich sind oder kleiner als 50 m im Durchmesser sind. Häufige Anwendung von Wassertropfen auf dem SAM zwischen den Sezierschritten verhindern dieses Problem.
Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass es keine wirkliche Kontrolle über den abierten Bereich gibt. Dies ist ein Problem beim Vergleich von Veränderungen, die unter verschiedenen Bedingungen und Genotypen auftreten. Daher ist es notwendig, Kontroll-SAMs, die in ähnlicher Weise gestört werden, für den Vergleich zu verwenden. Eine weitere Alternative ist die Durchführung einer kontrollierteren Ablation mit einem gepulsten ultravioletten Laser20. Darüber hinaus ist ablation zwar weithin dafür bekannt, Veränderungen der mechanischen Eigenschaften zu beschaffen, aber sie ist bis zu einem gewissen Grad auch mit wundinduzierten Reaktionen verbunden. Aus diesem Grund müssen andere Ansätze, wie mechanische Kompression und turgor-induzierte Störungen durchgeführt werden, um die Beobachtungen zu bestätigen6,9.
Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode im Vergleich zu anderen Möglichkeiten der Manipulation mechanischer Kräfte ist, dass sie sehr einfache Werkzeuge verwendet, aber eine robuste Auslesung der Mikrotubuli-Reaktion bietet.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
nichts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
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