Summary
Hier beschrijven we een protocol voor live celbeeldvorming van de corticale microtubuliercytoskelet bij de shoot apicale meristem en het toezicht op de reactie op veranderingen in de fysieke krachten.
Abstract
Inzicht in cel- en weefselniveauregulatie van groei en morfogenese loopt al tientallen jaren voorop in biologisch onderzoek. Dankzij de vooruitgang in moleculaire en beeldvormende technologieën konden we inzicht krijgen in hoe biochemische signalen morfogenetische gebeurtenissen beïnvloeden. Het wordt echter steeds duidelijker dat naast biochemische signalen, mechanische signalen ook invloed hebben op verschillende aspecten van cel- en weefselgroei. Arabidopsis ontspruit apical meristem (SAM) is een koepel-vormige structuur verantwoordelijk voor de generatie van alle bovengrondse organen. De organisatie van het corticale microtubulicytoskelet dat apoplastische cellulosedepositie bemiddelt in plantencellen is ruimtelijk verschillend. Visualisatie en kwantitatieve beoordeling van patronen van corticale microtubuli zijn noodzakelijk voor het begrijpen van de biofysische aard van cellen in de SAM, omdat cellulose de stijfste component van de plantencelwand is. De stereotiepe vorm van corticale microtubuli organisatie is ook een gevolg van weefsel-brede fysieke krachten bestaande in de SAM. Verstoring van deze fysieke krachten en de daaropvolgende monitoring van corticale microtubuli organisatie maakt het mogelijk voor de identificatie van kandidaat-eiwitten die betrokken zijn bij het bemiddelen van mechano-perceptie en transductie. Hier beschrijven we een protocol dat helpt bij het onderzoeken van dergelijke processen.
Introduction
Plantencellen worden omgeven door een extracellulaire matrix van polysacchariden en glycoproteïnen die mechanisch lijkt op een vezelversterkt composietmateriaal dat zijn mechanische eigenschappen dynamisch kan veranderen1. De groei van plantencellen wordt gedreven door de opname van water in de cel, wat resulteert in een gelijktijdige opbouw van trekkrachten op de celwand. In reactie op dergelijke krachten, wijzigingen in de fysieke toestand van de celwand zorgt voor celuitzetting. Cellen met primaire wanden zijn in staat om een snelle groei te ondergaan in vergelijking met secundaire celwand met cellen voornamelijk als gevolg van verschillen in de chemische samenstelling van de polysaccharides binnen. Primaire wandcellen zijn samengesteld uit cellulose, hemicellulose en pectine in aanvulling op glycoproteïnen, en gebrek aan lignine, een component die aanwezig is in de secundaire celwand2. Cellulose, een glucosepolymeer dat via β-1,4-bindingen is gekoppeld, is de belangrijkste component van de celwanden. Het is georganiseerd in fibrillar structuren die bestand zijn tegen hoge trekkrachten ervaren tijdens celgroei3. Naast het weerstaan van trekkrachten, mechanische versterking langs een preferentiële richting resulteert in turgor-gedreven expansie langs een as loodrecht op de netto oriëntatie van de cellulose microfibril. De organisatie van de cellulose microfibrils wordt beïnvloed door het corticale microtubulicytoskelet, omdat ze de richtingsbeweging van de cellulosesynthese-synthetiserende complexen op het plasmamembraan4begeleiden. Daarom dient het monitoren van corticale microtubuli organisatie met behulp van een microtubuli-geassocieerd eiwit of tubuline versmolten met een fluorescerend molecuul als een proxy voor de observatie van bovenmatige patronen van cellulose in plantencellen.
De patronen van de corticale microtubulicytoskelet is onder de controle van cel- en weefselmorfologie afgeleide mechanische krachten. Corticale microtubuli organisatie heeft geen preferentiële organisatie na verloop van tijd in cellen gelegen aan de top van de SAM, terwijl cellen in de periferie en de grens tussen de SAM en het opkomende orgaan hebben een stabiele, zeer georganiseerde supracellulaire array van corticale microtubuli5. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om de mechanische status van de cellen fysiek te verstoren. Veranderingen in de osmotische status, evenals de behandeling met farmacologische en enzymatische verbindingen die de stijfheid van de celwand beïnvloeden, kunnen leiden tot latere veranderingen in de trekkrachten die door de cel6,7 wordenervaren . Het gebruik van constructies die het mogelijk maken voor de geleidelijke toename van de compressieve krachten ervaren door weefsels is een ander alternatief8. Toepassing van centrifugale krachten is ook aangetoond dat de mechanische krachten beïnvloeden zonder enig fysiek contact met de cellen9. Echter, de meest gebruikte middelen van het veranderen van directionele krachten in een groep cellen profiteren van het feit dat alle epidermale cellen onder spanning staan en fysieke ablatie van cellen zal elimineren turgor druk lokaal evenals verstoren cel-tot-cel hechting, waardoor het wijzigen van de trekkrachten ervaren door de naburige cellen. Dit wordt uitgevoerd door het richten van een high-powered gepulseerde ultraviolette laser of door middel van een fijne naald.
Hier gaan we dieper in op het proces van beeldvorming en het beoordelen van corticale microtubuli gedrag voor mechanische verstoring bij de SAM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plantengroei
- Zaai Arabidopsis zaden uitdrukken microtubbule binding domein versmolten met groene fluorescerende eiwitten (MBD-GFP)10 op de bodem en houden in lange dag (16 uur dag / 8 uur nacht), 20 °C / 6 ° C voorwaarden voor 1 week voor ontkieming.
- Breng na het ontkiemen zaailingen over naar nieuwe potten met voldoende groeiruimte om robuuste vegetatieve groei mogelijk te maken. Houd planten op korte dag (8 uur per dag /16 uur 's nachts), 20 °C/16 °C voorwaarden gedurende 3-5 weken.
- Breng planten over op lange dag (16 uur dag /8 uur nacht), 20 °C/16 °C voorwaarden en bewaar tot planten bout (2-3 weken). Laat de bloeiwijze tot 2-5 cm lang worden.
2. Gemiddelde voorbereiding
- Bereid de ontleedschotels door kleine petrischaaltjes (ongeveer 5,5 cm breed, 1,5 cm diep) te vullen tot ongeveer de helft van hun diepte met 2% agarose. De ontledende gerechten kunnen ook worden gebruikt voor single time point imaging.
- Bereid het groeimedium voor.
- Bereid 50 mL van een 1.000x vitaminevoorraadoplossing met 5 g myo-inositol, 0,05 g nicotinezuur, 0,05 g pyridoxinehydrochloride, 0,5 g thiaminehydrochloride en 0,1 g g glycine.
- Bereid het groeimedium, samengesteld uit 1/2 Murashige en Skoog medium, 1% sacharose, 1,6% agar, 1x vitamines, pH = 5,8. Autoclave en laat het afkoelen.
- Steriliseer op een steriele, schone bank scharnierende plastic dozen (ongeveer 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) door 15 minuten lang 70% ethanol onder te dompelen.
- Op een steriele, schone bank, zodra het medium is op draaglijke warmte, voeg N6-benzyladenine aan een uiteindelijke concentratie van 200 nM, en 1/1.000 PPM (plant conserveermiddel mengsel) en meng goed. Vul de steriele dozen tot ongeveer de helft van hun diepte met het medium.
3. Dissectie van de SAM
- Snijd de bloeiwijze en verwijder de oudere bloemknoppen met scherpe tangen door de bloemen aan de basis van de peduncles te pellen totdat het moeilijk is om ze met het blote oog te zien.
- Maak een spleet in de agarose in de ontleden schotel met tangen en plant de bloeiwijze basis in de dikke agar. Dit geeft goede solide ondersteuning voor verdere fijne dissectie van jongere bloemen om de SAM bloot te leggen.
- Verwijder de resterende bloemknoppen door ze naar beneden te duwen met de tangen te beginnen met de oudste en sequentiële vordert naar de jongere stadia onder een ontleden microscoop totdat de SAM zichtbaar is. De SAM wordt meestal blootgesteld wanneer oudere bloemen tot fase 6 tot 7 worden verwijderd. Zodra de SAM is blootgesteld, vermijd uitdroging van het monster door snel naar de volgende stap te gaan.
4. Overdracht en groei van gekweekte SAM's
- Plant het vers ontleed monster zoals beschreven in sectie 1 in het groeimedium in de rechthoekige plastic scharnierende kweekdoos met de SAM net boven het middenoppervlak. Voeg een paar druppels steriel gedeïsiliseerd water toe aan de randen van de kweekdozen en sluit het deksel om de vochtigheid in de doos te behouden. Zorg ervoor dat het toegevoegde water de SAM niet bedekt.
- Sluit het deksel en wikkel de doos met micropore tape. Plaats de groeibox in lange dag- of continue dagomstandigheden op 22 °C en groei 12-24 uur om de SAM in staat te stellen zich van de ontledingsprocedure te herstellen en zich aan te passen aan de kweekomstandigheden.
5. Beeldvorming van de SAM
- Vul de kweekdoos met de SAM met steriel gedeïmiseerd water om het monster te bedekken. Controleer onder de ontleedmicroscoop en verwijder eventuele luchtbellen door met een pipet van 1 mL krachtig water op het monster te spuiten.
- Plaats de kweekdoos op een rechtopstaand confocale microscoopstadium. Zorg ervoor dat de kweekdoos geen contact maakt met de microscoopdoelstellingen. Gebruik een lange afstand 40x of 60x water dompelen lens van numerieke diafragma 0.8-1 die optimaal is voor beeldvorming zonder een cover glas.
- Verlaag het doel in het water en controleer op luchtbellen gevormd op de voorste lens van het doel. Verwijder eventuele bubbels door het verlagen van het podium en voorzichtig afvegen van de lens met een optisch weefsel en het toevoegen van een kleine hoeveelheid water aan de voorste lens van het doel met een Pasteur pipet voor reimmersion in het water.
- Stel met behulp van het GFP-filter en de epi-verlichtingsmodule van de confocale microscoop de XY-controller aan om het monster te lokaliseren. Het aanpassen van de positie van de oculair, zet de SAM direct onder de lichtbron en focus langs de Z-as totdat de top zich bevindt.
LET OP: Kijk niet direct naar het ultraviolette licht. - Zodra het monster is gevonden, verlichten met behulp van een laser geschikt voor spannende GFP (dat wil zeggen, een 488 nm of 496 nm laserbron). Pas de optische zoom van de microscoop zo aan dat de gehele SAM en de stage 1 floral primordia in het gezichtsveld zijn. Pas de kracht van de laseroutput verder aan en verkrijg de instellingen om een optimale signaal-ruisverhouding te garanderen.
OPMERKING: De hoge intensiteit van de laser zal resulteren in fotobleken van het monster. Het onder- en overbelichtingspalet zorgt voor een betere aanpassing van deze instellingen. - Laat het monster 2-5 min tot rust komen. Verkrijg confocale Z-stapels van het monster met een segmentintervallen van 0,25 μm-0,5 μm Z met een resolutie van ongeveer 0,3 μm pixelgrootte. Zorg ervoor dat de totale beeldtijd die nodig is voor het verwerven van Z-stapels voor één monster niet meer dan 10 minuten bedraagt vanaf het moment dat het monster tot de voltooiing van de overname in water wordt ondergedompeld.
- Verwijder onmiddellijk het water en breng de kweekdoos terug naar de groeikamer. Het houden van de monsters voor een lange tijd onder water zal invloed hebben op de osmotische status van de cellen.
6. Micromechanische verstoring van de SAM
- Stel de beeldvorming voorwaarden zoals beschreven in sectie 5 en verwerven preablatie beeld stapels van de corticale microtubule organisatie.
- Decanteer het water in de kweekschotel. Voer de ablatie uit met een schone spuitnaald (0,4 mm x 20 mm).
- Houd met behulp van een ontledenmicroscoop de naald voorzichtig vast en benader de SAM langzaam.
OPMERKING: Adem vasthouden en het hanteren van de naald met een ontspannen grip helpt te voorkomen dat schudden. - Neem kort contact op met de SAM-koepel met de naaldpunt om te bevestigen dat de ablatie is gedaan. Voer bij voorkeur de ablatie uit aan de periferie van de SAM, die visualisatie van het gedrag en de overgang van ongeorganiseerde corticale microtubuli in het centrale gebied van de koepel mogelijk maakt.
- Houd met behulp van een ontledenmicroscoop de naald voorzichtig vast en benader de SAM langzaam.
- Vul de kweekschaal bij met steriel gedeïmiseerd water en voeg propidium idodide (10 μg/mL) toe. Naast het monitoren van het Corticale microtubbulesignaal van de GFP, kan het visualiseren van de propidiumjodide met behulp van een apart kanaal gebieden van ablated cellen duidelijk markeren. Propidium jodide wordt verlicht met behulp van de 561 nm of een andere geschikte laser met emissie geregistreerd tussen 600-650 nm.
- Verwerf beeldstapels direct na ablatie (zie sectie 6) en herhaal het acquisitieproces om de 2 uur voor een periode van 6 uur. Breng de kweekschotel samen met het monster na elk keer weer terug in de incubatiekamer. Zorg ervoor dat er nog wat water over is op de kweekmedia en wikkel het kweekschotel met microporetape om uitdroging te voorkomen.
7. Datavisualisatie en kwantificering
- Genereer oppervlakteprojecties met behulp van vrij beschikbare software zoals MORPHOGRAPHX11, FIJI12of macro SurfCut13.
- Voer extractie van corticale microtubuli anisotropie uit met FibrilTool14 macro in FIJI.
OPMERKING: Gedetailleerde protocollen voor softwaregebruik kunnen worden verkregen uit de respectievelijke citaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont typische projectiebeelden verkregen uit MBD-GFP-lijnen met cellen in het midden van de koepel met ongeorganiseerde corticale microtubuli, en cellen aan de periferie met een omtrekverdeling(figuur 1A,B), terwijl de grensdomeincellen corticale microtubuli bevatten die parallel aan de lange as van de cel zijn uitgelijnd. Deze waarnemingen tonen verschillen in de ruimtelijke verdeling van corticale microtubuli in de verschillende domeinen van de SAM. Time lapse imaging toonde corticale microtubuli uitlijning veranderen van een zeer wanordelijke array naar een meer georganiseerde array binnen 6 uur van ablatie(Figuur 1C, D). De tensoren gegenereerd met behulp van FibrilTool kan worden bovenop het corticale microtubuli beeld. Een langere tensor vertegenwoordigde een hogere graad van anisotropie. De tensoren toonden ook de belangrijkste as van uitlijning van de corticale microtubuli. De uitgepakte informatie kan worden vertegenwoordigd door de gemiddelde anisotropie in de loop van de tijd te potten (figuur 1E)15. Een steekproefgrootte van vier tot vijf wordt aanbevolen per behandeling of genotype die moet worden getest. De resultaten toonden een geleidelijke toename van corticale microtubuli anisotropie binnen een periode van 6 uur en stelde ons in staat om te concluderen dat modulatie naar mechanica van de SAM resulteert in gelijktijdige veranderingen in corticale microtubbule organisatie.
Figuur 1: Voorbeeld resultaat van corticale microtubuliering anisotropie kwantificering en mechanische ablatie in Arabidopsis SAM. (A) Oppervlakteprojectie van 35S: MBD-GFP SAM Z-stapels. (B) Nematische tensoren in het rood met corticale microtubuli anisotropie van handmatig gesegmenteerde cellen in het centrale en grensdomein. (C,D). Oppervlakteprojecties van corticale microtubuli time lapse-gegevens uit een ablatie-experiment. (D) Vergroot beelden uit (C) met corticale microtubuliherlijning in de buurt van de plaats van ablatie (rood sterretje) bedekt met nematische tensor-informatie van individuele cellen. (E) Corticale microtubuli anisotropie veranderde na ablatie van 0-6 uur, gekwantificeerd uit het nematische tensorgemerkte gebied in C met de cirkel die de gemiddelde waarde en de balken die het betrouwbaarheidsinterval van 95% aangeven. Schaalbalken = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beoordeling van mechanische signaaltransductiegebeurtenissen is cruciaal om moleculaire regelgevers te identificeren die betrokken zijn bij de mechano-waarnemings- en transductietrajecten. Het hier beschreven protocol geeft een kwantitatief beeld van dergelijke gebeurtenissen door de corticale microtubulirespons te gebruiken als uitlezing voor een dergelijk proces in Arabidopsis SAMs. De hier beschreven procedure wordt routinematig gebruikt in verschillende studies in verschillende weefseltypen16,17,18,19. Een significante toename van microtubuli anisotropie wordt waargenomen in het bereik van 4 uur in alle weefseltypes.
De meest kritieke stap in het protocol is ervoor te zorgen dat veranderingen in de microtubuli niet optreden als gevolg van langdurige onderdompeling in water, omdat water op zichzelf resulteert in een toename van de turgordruk van de cellen. Daarom moet de beeldtijd worden geminimaliseerd. Dit kan de beeldresolutie compromitteren, maar het biedt een nauwkeurigere uitlezing van de verstorende resultaten. De tweede meest cruciale stap is zorgvuldige dissectie van de SAM. Vanwege zijn zeer kleine omvang, is het zeer waarschijnlijk worden beschadigd tijdens de procedure. De organen worden moeilijker te verwijderen als de peduncles van oudere organen niet volledig worden verwijderd. Ten slotte mag het monster tijdens de dissectie niet uitdrogen als gevolg van langdurige blootstelling aan de lucht van de SAM. Dit komt vooral voor bij het hanteren van gemuteerde SAM's die moeilijk toegankelijk zijn of die kleiner zijn dan 50 μm in diameter. Frequente toepassing van waterdruppels op de SAM tussen de dissectiestappen voorkomen dit probleem.
Een beperking van deze procedure is dat er geen echte controle is over het ablated gebied. Dit is een probleem bij het vergelijken van veranderingen die zich voordoen in verschillende omstandigheden en genotypes. Daarom is het noodzakelijk om controle-SAM's te gebruiken die op een vergelijkbare manier zijn verstoord voor vergelijking. Een ander alternatief is het uitvoeren van een meer gecontroleerde ablatie met behulp van een gepulseerde ultraviolette laser20. Bovendien, terwijl ablatie is algemeen bekend om veranderingen in mechanische eigenschappen te creëren, het is ook geassocieerd tot op zekere hoogte met wond-geïnduceerde reacties. Daarom moeten andere benaderingen, zoals mechanische compressie en door turgor geïnduceerde verstoringen worden uitgevoerd om de waarnemingen6,9te bevestigen .
Een belangrijk voordeel van deze methode in vergelijking met andere manieren van manipuleren van mechanische krachten is dat het gebruik maakt van zeer elementaire tools nog biedt een robuuste uitlezing van microtubuli respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
- Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
- Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
- Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).
- Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
- Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
- Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
- Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
- Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
- Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036 (2019).
- Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
- Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).
