Summary
Aqui descrevemos um protocolo para imagens de células vivas do citoesqueleto de microtúbulos cortical no meristem apical de tiro e monitorando sua resposta às mudanças nas forças físicas.
Abstract
A compreensão da regulação do nível celular e tecidual do crescimento e da morfogênese está na vanguarda da pesquisa biológica há muitas décadas. Os avanços nas tecnologias moleculares e de imagem nos permitiram obter insights sobre como os sinais bioquímicos influenciam eventos morfogenéticos. No entanto, é cada vez mais evidente que, além dos sinais bioquímicos, as pistas mecânicas também impactam vários aspectos do crescimento celular e tecidual. A Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) é uma estrutura em forma de cúpula responsável pela geração de todos os órgãos acima do solo. A organização do citoesqueleto de microtúbulo cortical que media a deposição de celulose apoplásica em células vegetais é espacialmente distinta. A visualização e a avaliação quantitativa dos padrões dos microtúbulos corticais são necessárias para entender a natureza biofísica das células no SAM, já que a celulose é o componente mais rígido da parede celular da planta. A forma estereotipada da organização dos microtúbulos cortical também é uma consequência das forças físicas em todo o tecido existentes no SAM. A perturbação dessas forças físicas e o monitoramento subsequente da organização de microtúbulos corticais permitem a identificação de proteínas candidatas envolvidas na mediação da mecano-percepção e transdução. Aqui descrevemos um protocolo que ajuda a investigar tais processos.
Introduction
As células vegetais são cercadas por uma matriz extracelular de polissacarídeos e glicoproteínas que se assemelha mecanicamente a um material composto reforçado com fibra capaz de mudar dinamicamente suas propriedades mecânicas1. O crescimento das células vegetais é impulsionado pela absorção de água na célula, o que resulta em um acúmulo concomitante de forças de tração na parede celular. Em resposta a tais forças, modificações no estado físico da parede celular permitem a expansão celular. As células com paredes primárias são capazes de sofrer um rápido crescimento em comparação com a parede celular secundária contendo células principalmente devido a diferenças na composição química dos polissacarídeos dentro. As células de parede primárias são compostas de celulose, hemicellulose e pectina, além de glicoproteínas, e falta de lignina, componente presente na parede celular secundária2. A celulose, um polímero de glicose ligado através de β-1,4 ligações, é o principal componente das paredes celulares. É organizado em estruturas fibrilares capazes de suportar altas forças de tração experimentadas durante o crescimento celular3. Além de resistir às forças de tração, o reforço mecânico ao longo de uma direção preferencial resulta em expansão orientada por turgor ao longo de um eixo perpendicular à orientação líquida do microfibril de celulose. A organização dos microfibrilas de celulose é influenciada pelo citoesqueleto de microtubulos cortical, pois orientam o movimento direcional dos complexos de celulose-sintetizadores localizados na membrana plasmática4. Portanto, monitorar a organização de microtúbulos corticais usando uma proteína associada a microtúbulos ou tubulina fundida com uma molécula fluorescente serve como proxy para a observação de padrões de sobrepesca de celulose em células vegetais.
A padronização do citoesqueleto de microtúbulos cortical está sob o controle de forças mecânicas derivadas da morfologia celular e tecidual. A organização de microtúbulos corticais não possui nenhuma organização preferencial ao longo do tempo em células localizadas no ápice do SAM, enquanto as células da periferia e a fronteira entre o SAM e o órgão emergente possuem uma matriz supracelular estável e altamente organizada de microtúbulos corticais5. Várias abordagens foram desenvolvidas para perturbar fisicamente o estado mecânico das células. Alterações no estado osmótico, bem como tratamento com compostos farmacológicos e enzimáticos que influenciam a rigidez da parede celular podem resultar em alterações subsequentes nas forças de tração experimentadas pela célula6,7. O uso de engenhocas que permitem o aumento gradual das forças compressivas experimentadas pelos tecidos é outra alternativa8. A aplicação de forças centrífugas também tem sido demonstrada para influenciar as forças mecânicas sem qualquer contato físico com as células9. No entanto, os meios mais amplamente utilizados de mudança de forças direcionais em um grupo de células se aproveitam do fato de que todas as células epidérmicas estão sob tensão e a ablação física das células eliminará a pressão de turgor localmente, bem como interromperá a adesão célula-celular, modificando assim as forças de tração experimentadas pelas células vizinhas. Isto é realizado tanto visando um laser ultravioleta pulsado de alta potência ou por meio de uma agulha fina.
Aqui elaboramos sobre o processo de imagem e avaliação do comportamento de microtúbulos corticais para perturbação mecânica no SAM.
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Protocol
1. Crescimento das plantas
- Semear sementes arabidopsis expressando domínio de ligação de microtúbulos fundido com proteína fluorescente verde (MBD-GFP)10 no solo e manter-se em longo dia (16 h dia /8 h noite), 20 °C/6 °C condições para 1 semana para germinação.
- Após a germinação, transfira mudas para novos potes com espaço de crescimento suficiente para permitir um crescimento vegetativo robusto. Mantenha as plantas em dias curtos (8h dia /16h à noite), 20 °C/16 °C condições por 3-5 semanas.
- Transfira as plantas para o dia longo (16h dia /8h à noite), 20 °C/16 °C e mantenha até as plantas parafuso (2-3 semanas). Permita que a inflorescência cresça até 2-5 cm de comprimento.
2. Preparação média
- Prepare os pratos de dissecação preenchendo pequenas placas de Petri (aproximadamente 5,5 cm de largura, 1,5 cm de profundidade) para aproximadamente metade de sua profundidade com 2% de agarose. Os pratos dissecando também podem ser usados para imagens de ponto único.
- Prepare o meio de crescimento.
- Prepare 50 mL de uma solução de estoque de vitaminas de 1.000x com 5 g de mio-inositol, 0,05 g de ácido nicotínico, 0,05 g de cloridrato de piridoxina, 0,5 g de cloridrato de tiamina e 0,1 g de glicerina.
- Prepare o meio de crescimento, composto por 1/2 Murashige e Skoog médio, 1% sacarose, 1,6% ágar, 1x vitaminas, pH = 5,8. Autoclave e deixe esfriar.
- Em um banco estéril e limpo, esterilizar caixas plásticas articuladas (aproximadamente 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) imergindo em 70% de etanol por 15 min.
- Em um banco estéril e limpo, uma vez que o meio esteja em calor suportável, adicione N6-benziladenina a uma concentração final de 200 nM, e 1/1.000 PPM (mistura de conservantes vegetais) e misture bem. Encha as caixas estéreis a aproximadamente metade de sua profundidade com o meio.
3. Dissecção do SAM
- Corte a inflorescência e remova os botões de flores mais velhos com fórceps afiados descascando as flores na base dos peduncles até que seja difícil vê-los a olho nu.
- Crie uma fenda na ágarose no prato de dissecação com fórceps e plante a base de inflorescência no ágar grosso. Isso dá um bom suporte sólido para uma dissecação mais fina de flores mais jovens para expor o SAM.
- Remova os botões de flores restantes empurrando-os para baixo com as fórceps começando com os estágios mais antigos e sequencialmente progredindo para os estágios mais jovens sob um microscópio dissecando até que o SAM seja visível. O SAM é geralmente exposto quando flores mais antigas até o estágio 6 a 7 são removidas. Uma vez que o SAM esteja exposto, evite a desidratação da amostra movendo-se rapidamente para o próximo passo.
4. Transferência e crescimento de SAMs cultivados
- Plante a amostra recém-dissecada como detalhada na seção 1 no meio de crescimento na caixa de cultura articulada de plástico retangular com o SAM apenas exposto acima da superfície média. Adicione algumas gotas de água deionizada estéril às bordas das caixas de cultura e feche a tampa para manter a umidade dentro da caixa. Certifique-se de que a água adicionada não cubra o SAM.
- Feche a tampa e enrole a caixa com fita micropora. Coloque a caixa de crescimento em condições diárias longas ou contínuas a 22 °C e cresça por 12-24 h para permitir que o SAM se recupere do procedimento de dissecção e se adapte às condições de cultura.
5. Imagem do SAM
- Encha a caixa de cultura contendo o SAM com água deionizada estéril para cobrir a amostra. Verifique sob o microscópio dissecando e remova quaisquer bolhas de ar pulverizando água direcionada à amostra com uma pipeta de 1 mL.
- Coloque a caixa de cultura em um estágio de microscópio confocal vertical. Tome cuidado para que a caixa de cultura não entre em contato com os objetivos do microscópio. Use uma lente de mergulho de água de longa distância 40x ou 60x de abertura numérica 0,8-1 que é ideal para imagens sem um copo de cobertura.
- Abaixe o objetivo na água e verifique se há bolhas de ar formadas na lente frontal do objetivo. Remova quaisquer bolhas baixando o palco e limpando suavemente a lente com um tecido óptico e adicionando uma pequena quantidade de água à lente frontal do objetivo com uma pipeta Pasteur antes de reimmersion na água.
- Utilizando o filtro GFP e o módulo de iluminação epi-iluminadora do microscópio confocal, ajuste o controlador XY para localizar a amostra. Ajustando a posição dos oculares, coloque o SAM diretamente sob a fonte de luz e concentre-se ao longo do eixo Z até que o ápice esteja localizado.
NOTA: Não olhe diretamente para a luz ultravioleta. - Uma vez que a amostra seja encontrada, ilumine-a usando um laser capaz de excitante GFP (ou seja, uma fonte laser de 488 nm ou 496 nm). Ajuste o zoom óptico do microscópio para que todo o SAM e o estágio 1 primordia floral estejam no campo de visão. Ajuste ainda mais a potência da saída do laser e obtenha configurações para garantir a relação sinal-ruído ideal.
NOTA: A alta intensidade do laser resultará em branqueamento fotográfico da amostra. A paleta de subposição e superexposição ajuda a garantir um melhor ajuste dessas configurações. - Deixe a amostra se acalmar por 2-5 minutos. Adquira pilhas Z confocal da amostra a intervalos de fatias Z de 0,25 μm-0,5 μm a uma resolução de aproximadamente 0,3 μm de tamanho de pixel. Certifique-se de que o tempo total de imagem necessário para a aquisição de pilhas Z para uma amostra não exceda 10 minutos a partir do momento em que a amostra é imersa em água até a conclusão da aquisição.
- Remova imediatamente a água e transfira a caixa de cultura de volta para a câmara de crescimento. Manter as amostras por muito tempo sob a água influenciará o estado osmótico das células.
6. Perturbação micromecânica do SAM
- Configure as condições de imagem conforme descrito na seção 5 e adquira pilhas de imagens de pré-ablação da organização de microtúbulos corticais.
- Decante a água no prato de cultura. Realize a ablação com uma agulha de seringa limpa (0,4 mm x 20 mm).
- Usando um microscópio dissecando, segure cuidadosamente a agulha e aproxime-se lentamente do SAM.
NOTA: Segurar a respiração e manusear a agulha com uma pegada relaxada ajuda a evitar tremer. - Entre em contato brevemente com a cúpula SAM com a ponta da agulha para confirmar que a ablação está feita. Preferencialmente realizar a ablação na periferia do SAM, o que permite visualização do comportamento e transição de microtúbulos corticais desorganizados na região central da cúpula.
- Usando um microscópio dissecando, segure cuidadosamente a agulha e aproxime-se lentamente do SAM.
- Reabastecer o prato de cultura com água deionizada estéril e adicionar propidium idodide (10 μg/mL). Além de monitorar o sinal de microtúbulo cortical GFP, visualizar o iodeto propidium usando um canal separado pode marcar claramente regiões de células abladas. O iodeto de propidium é iluminado usando o laser de 561 nm ou qualquer outro laser adequado com emissão registrada entre 600-650 nm.
- Adquira pilhas de imagens logo após a ablação (ver seção 6) e repita o processo de aquisição a cada 2h por um período de 6h. Devolva o prato de cultura junto com a amostra na câmara de incubação após cada ponto de tempo. Certifique-se de que há um pouco de água sobrando na mídia da cultura e enrole o prato de cultura com fita micropora para evitar a profilação.
7. Visualização e quantificação de dados
- Gere projeções de superfície usando softwares livremente disponíveis, como MORPHOGRAPHX11,FIJI12ou macro SurfCut13.
- Realize a extração de anisotropia de microtúbula cortical usando fibrilTool14 macro em FIJI.
NOTA: Protocolos detalhados para uso de software podem ser obtidos a partir das respectivas citações.
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Representative Results
A Figura 1 mostra imagens típicas de projeção obtidas a partir de linhas MBD-GFP com células no centro da cúpula contendo microtúbulos corticais desorganizados, e células na periferia com uma distribuição circunferencial(Figura 1A,B),enquanto as células de domínio de fronteira contêm microtúbulos corticais alinhados paralelos ao eixo longo da célula. Estas observações mostram diferenças na distribuição espacial de microtúbulos corticais nos diferentes domínios do SAM. A imagem do lapso de tempo mostrou o alinhamento do microtúbulo cortical mudando de uma matriz altamente desordenada para uma matriz mais organizada dentro de 6h de ablação(Figura 1C,D). Os tensores gerados usando FibrilTool podem ser sobrepostos à imagem de microtúbulo cortical. Um tensor mais longo representou um maior grau de anisotropia. Os tensores também mostraram o eixo principal de alinhamento dos microtúbulos corticais. As informações extraídas podem ser representadas por meio de um vaso da anisotropia média ao longo do tempo(Figura 1E)15. Recomenda-se um tamanho amostral de quatro a cinco por tratamento ou genótipo que deve ser testado. Os resultados mostraram um aumento gradual da anisotropia de microtúbulos corticais em um período de 6h e nos permitiram concluir que a modulação à mecânica do SAM resulta em alterações simultâneas na organização de microtúbulos corticais.
Figura 1: Exemplo de quantificação de anisotropia de microtúbulos cortical e ablação mecânica em Arabidopsis SAM. (A) Projeção de superfície de 35S: PILHAS DE ZS DE SAM Z MBD-GFP. (B) Tensores nemáticos em vermelho mostrando anisotropia de microtúbulo cortical de células segmentadas manualmente no domínio central e de fronteira. (C,D). Projeções superficiais de dados de lapso de tempo de microtúbulo cortical de um experimento de ablação. (D) Imagens ampliadas de (C) mostrando realinhamento de microtúbulos cortica próximo ao local da ablação (asterisco vermelho) sobrepostas com informações tensor nemáticas de células individuais. (E) A anisotropia de microtúbula cortical mudou após ablação de 0-6 h, quantificada a partir da região de tensor nematic rotulada em C com o círculo representando o valor médio e as barras indicando o intervalo de confiança de 95%. Barras de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A avaliação dos eventos de transdução de sinal mecânico é crucial para identificar os reguladores moleculares envolvidos nas vias de mecano-percepção e transdução. O protocolo descrito aqui fornece uma visão quantitativa de tais eventos usando a resposta de microtúbulos corticais como leitura para tal processo em SAMs Arabidopsis. O procedimento descrito aqui é utilizado rotineiramente em diversos estudos em diversos tipos de tecidos16,17,18,19. Observa-se um aumento significativo da anisotropia microtúbula na faixa de 4h em todos os tipos de tecidos.
O passo mais crítico do protocolo é garantir que as alterações nos microtúbulos não ocorram devido à submersão prolongada na água, pois a água por si só resulta em um aumento da pressão turgor das células. Portanto, o tempo de imagem deve ser minimizado. Isso pode comprometer a resolução da imagem, mas fornece uma leitura mais precisa dos resultados de perturbação. O segundo passo mais crucial é a dissecação cuidadosa do SAM. Devido ao seu tamanho muito pequeno, é muito provável que seja danificado durante o procedimento. Os órgãos tornam-se mais difíceis de remover se os peduncles de órgãos mais antigos não forem totalmente removidos. Finalmente, durante a dissecação, a amostra não deve ser permitida a secar devido à exposição prolongada do ar do SAM. Isso é especialmente comum ao manusear SAMs mutantes de difícil acesso ou que tenham menos de 50 μm de diâmetro. Aplicação frequente de gotas de água no SAM entre as etapas de dissecção evitar esse problema.
Uma limitação deste procedimento é que não há controle real sobre a área ablada. Trata-se de um problema na comparação de mudanças ocorridas em diferentes condições e genótipos. Portanto, é necessário usar sams de controle perturbados de forma semelhante para comparação. Outra alternativa é realizar uma ablação mais controlada usando um laser ultravioleta pulsado20. Além disso, embora a ablação seja amplamente conhecida por criar alterações nas propriedades mecânicas, ela também está associada a um certo grau com respostas induzidas por feridas. Por essa razão, outras abordagens, como a compressão mecânica e perturbações induzidas por turgor, precisam ser realizadas para confirmar as observações6,9.
Uma vantagem significativa deste método em comparação com outras formas de manipulação de forças mecânicas é que ele usa ferramentas muito básicas, mas fornece uma leitura robusta da resposta de microtúbulos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
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