Summary
ここでは、細胞内の細胞骨格を撮影する上皮状の微小管細胞骨格を生細胞イメージングするためのプロトコルを説明し、物理的な力の変化に対する応答を監視する。
Abstract
細胞および組織レベルの成長と形態形成の調節を理解することは、何十年もの間、生物学的研究の最前線にありました。分子および画像技術の進歩により、生化学的シグナルが形態遺伝学的事象にどのような影響を与えるかについての洞察を得ることができました。しかし、生化学的シグナルとは別に、機械的手がかりも細胞および組織の成長のいくつかの側面に影響を与えることがますます明らかになっています。 シロイヌナズナは 、すべての地上臓器の生成を担当するドーム型の構造である。植物細胞における非製化セルロース沈着を媒介する皮質微小管細胞骨格の組織は、空間的に異なっている。セルロースは植物細胞壁の最も硬い成分であるため、細胞の細胞の生物学的性質を理解するためには、皮質微小管のパターンの視覚化と定量的評価が必要です。皮質微小管組織のステレオタイプ形態はまた、SAMに存在する組織全体の物理的な力の結果でもある。これらの物理的な力の摂動と皮質微小管組織のその後のモニタリングは、メカノ知覚および伝達の仲介に関与する候補タンパク質の同定を可能にする。ここでは、このようなプロセスを調査するのに役立つプロトコルについて説明します。
Introduction
植物細胞は、機械的にその機械的特性を動的に変化させることができる繊維強化複合材料に似た多糖類及び糖タンパク質の細胞外マトリックスに囲まれている1。植物細胞の成長は、細胞への水の取り込みによって駆動され、細胞壁に引張力が蓄積する。このような力に応じて、細胞壁の物理的状態に対する変更は細胞の拡張を可能にする。一次壁を有する細胞は、主に多糖類の化学組成の違いにより細胞を含む二次細胞壁と比較して急速な成長を遂げることができる。一次壁細胞は、糖タンパク質に加えてセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、およびグリグニンを欠いて、二次細胞壁2に存在する成分から構成される。セルロースは、β-1,4結合を介して結合したグルコースポリマーであり、細胞壁の主要成分である。細胞増殖時に経験した高い引張力に耐えることができるフィブリラー構造に編成される3.引張力に耐えるだけでなく、優先方向に沿った機械的補強は、セルロースマイクロフィブリルの正味方向に垂直な軸に沿ってターゴール駆動の膨張をもたらす。セルロースミクロフィブリルの組織は、皮質微小管細胞骨格の影響を受け、原形質膜4に位置するセルロース合成複合体の方向運動を導くようにする。したがって、蛍光分子と融合した微小管関連タンパク質または管状管を用いた皮質微小管組織をモニタリングすることは、植物細胞におけるセルロースの上層パターンの観察の代理となる役割を果たす。
皮質微小管細胞骨格のパターニングは、細胞および組織形態の制御下にある機械的な力を導く。皮質微小管組織は、SAMの頂点に位置する細胞に経時の優向組織を有していないが、一方、周囲およびSAMと新興器官の境界内の細胞は、皮質微小管5の安定した高度に組織化された超細胞アレイを有する。細胞の機械的状態を物理的に摂動させるいくつかのアプローチが開発されている。浸透圧状態の変化は、細胞壁の剛性に影響を与える薬理学的および酵素的化合物による治療と同様に、細胞6,7が経験する引張力の後続の変化をもたらす可能性がある。組織が経験する圧縮力の漸進的増加を可能にする仕掛けの使用は、別の代替8である。遠心力の適用は、細胞9との物理的接触なしに機械的な力に影響を与えることも示されている。しかし、細胞群の指向性力を変化させる最も広く使用されている手段は、すべての表皮細胞が緊張下にあり、細胞の物理的なアブレーションが細胞のターゴール圧力を局所的に排除し、細胞間接着を破壊し、それによって隣接細胞が経験する引張力を改変するという事実を利用する。これは、高出力のパルス紫外線レーザーをターゲットにするか、細かい針を使用して行われます。
ここでは、SAMにおける機械的摂動に対する皮質微小管挙動のイメージングおよび評価のプロセスについて詳しく説明する。
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Protocol
1. 植物の成長
- シロイヌナズナズ種子は、緑色蛍光タンパク質(MBD-GFP)10と土壌上に融合した微小管結合ドメインを発現し、長い日(16時間日/8時間夜)、発芽のために1週間20°C/6°Cの条件で保持する。
- 発芽後、丈夫な栄養成長を可能にする十分な成長スペースを持つ新しいポットに苗を移す。植物を短い日(8時間日/16時間の夜)、20°C/16 °Cの条件で3〜5週間保ちます。
- 長い日(16時間日/8時間の夜)、20 °C / 16 °Cの条件に植物を移し、植物ボルト(2-3週間)まで保ちます。花序を2〜5センチまで成長させる。
2. 中程度の準備
- 小さなペトリ皿(幅約5.5cm、深さ1.5cm)を2%アガロースで約半分の深さに充填して、解剖皿を準備します。解剖皿はまた単一のタイムポイントのイメージ投射のために使用することができる。
- 成長培地を準備します。
- 5gのミオイノシトール、0.05gのニコチン酸、0.05gのピリドキシン塩酸塩、0.5gのチアミン塩酸塩、グリシン0.1gの1000xビタミンストック溶液を調製します。
- 1/2ムラシゲとスクーグ培地、1%スクロース、1.6%寒天、1xビタミン、pH= 5.8で構成される成長培地を調製します。オートクレーブとそれを冷却することができます。
- 滅菌式のクリーンベンチで、ヒンジ付きプラスチックボックス(約5.2cm x 5.2 cm x 3 cm)を70%エタノールに15分間浸漬して殺菌します。
- 滅菌、クリーンベンチでは、培地が耐えられる暖かさになったら、N6-ベンジラジンを最終濃度200nMに加え、1/1,000 PPM(植物防腐剤混合物)をよく混ぜます。滅菌箱を培地で約半分の深さに充填します。
3. SAMの解剖
- 花序をカットし、肉眼でそれらを見るのが難しいまで、ペダンクルの基部の花を剥がすことによって鋭い鉗子で古い花芽を取り除きます。
- 鉗子で解剖皿のアガロースにスリットを作成し、厚い寒天に花序ベースを植えます。これは、SAMを公開するために、若い花の更なる細かい解剖のための良好な固体サポートを与えます。
- SAMが見えるまで、最も古い、順番に解剖顕微鏡の下で若い段階に進行する鉗子でそれらを押し下げることによって、残りの花芽を取り除きます。SAMは通常、ステージ6〜7までの古い花が取り除かれると露出します。SAM が公開されたら、次のステップに素早く移動してサンプルの脱水を避けます。
4. 培養されたSAMの移転と成長
- セクション1で詳述したように解剖したばかりのサンプルを、中表面の上に露出したSAMを持つ長方形のプラスチックヒンジ培養ボックスの成長培地に植えます。培養ボックスの端に滅菌脱イオン水を数滴加え、蓋を閉じて箱の中の湿度を維持します。追加した水が SAM を覆わないことを確認します。
- 蓋を閉め、マイクロポアテープで箱を包みます。成長ボックスを 22 °C の長い日または連続日の条件に置き、SAM が解剖手順から回復し、培養条件に適応できるように 12- 24 時間成長します。
5. SAM のイメージング
- SAMを含む培養ボックスに無菌脱イオン水を充填して、サンプルを覆います。解剖顕微鏡で確認し、1 mLピペットでサンプルに向けられた水を強く噴霧して気泡を取り除きます。
- 培養ボックスを直立した共焦点顕微鏡のステージに置きます。培養ボックスが顕微鏡の目的に接触しないように注意してください。カバーガラスを使用しないイメージングに最適な、数値絞り0.8-1の長距離40xまたは60x水浸漬レンズを使用してください。
- 水に目的を下げ、目的のフロントレンズに形成された気泡を確認します。ステージを下げ、光学組織でレンズを静かに拭き取り、水に浸漬する前にパスツールピペットで目的のフロントレンズに少量の水を加えることによって、気泡を取り除きます。
- コンフォーカル顕微鏡のGFPフィルターとエピイルミネーションモジュールを使用して、XYコントローラを調整してサンプルを見つけます。眼の位置を調整し、サムを光源の下に置き、頂点が配置されるまで Z 軸に沿って焦点を合わせます。
注:紫外線を直接見ないでください。 - サンプルが見つかったら、GFP(すなわち、488 nmまたは496 nmレーザー光源)が可能なレーザーを使用してそれを照らします。全体のSAMとステージ1花のプリモディアが視野に入るように顕微鏡の光学ズームを調整します。さらに、最適な信号対雑音比を確保するために、レーザー出力とゲイン設定のパワーを調整します。
注:レーザーの強度が高いと、サンプルの写真の漂白が発生します。露出不足と露出過多パレットは、これらの設定をより適切に調整するのに役立ちます。 - サンプルを2〜5分間落ち着かせる。約0.3μmピクセルサイズの分解能で、0.25 μm-0.5 μm Zスライス間隔でサンプルの共焦点Zスタックを取得します。1つのサンプルのZスタックを取得するのに必要な総イメージング時間が、サンプルが水に浸された時点から取得が完了するまで10分を超えないようにしてください。
- すぐに水を取り除き、培養箱を成長室に戻します。サンプルを水中に長時間保管すると、細胞の浸透状態に影響を与えます。
6. SAM のマイクロメカニカル摂動
- セクション5に記載されているようにイメージング条件を設定し、皮質微小管組織の画像積み重ね画像を取得します。
- 文化皿の中の水をデカントします。きれいな注射針(0.4 mm x 20 mm)でアブレーションを行います。
- 解剖顕微鏡を使用して、慎重に針を保持し、ゆっくりとSAMに近づきます。
注:ゆったりとしたグリップで針を持ち、取り扱う息は揺れを避けるのに役立ちます。 - サムドームに針先を持って簡単に連絡し、アブレーションが行われたことを確認します。好ましくは、SAMの周囲にアブレーションを行い、ドームの中央領域における組織化されていない皮質微小管の挙動および移行を可視化することを可能にする。
- 解剖顕微鏡を使用して、慎重に針を保持し、ゆっくりとSAMに近づきます。
- 培養皿に無菌脱イオン水を補充し、ピピジウム・イドジド(10μg/mL)を加えます。GFP皮質微小管信号をモニタリングすることに加えて、別のチャネルを用いてヨウ化プロピジウムを可視化することで、アブレートされた細胞の領域を明確にマークすることができます。ヨウ化プロピジウムは、561 nmまたは600-650 nmの間で記録された放出を有する他の適切なレーザーを使用して照らされる。
- アブレーション直後に画像スタックを取得し(セクション6を参照)、取得プロセスを2時間ごとに6時間繰り返します。培養皿をサンプルと共に、各タイムポイント後にインキュベーションチャンバーに戻します。培養培地に水が残っていることを確認し、乾燥を防ぐために培養皿をマイクロポアテープで包みます。
7. データの可視化と定量化
- このようなMORPHOGRAPHX11、フィジー12、またはマクロサーフカット13などの自由に利用可能なソフトウェアを使用して表面投影を生成します。
- フィジーでFibrilTool14 マクロを使用して皮質微小管異方性の抽出を行う。
注: ソフトウェア使用のための詳細なプロトコルは、それぞれの引用から入手することができます。
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Representative Results
図1は、ドームの中心に組織化されていない皮質微小管を含む細胞を有するMBD-GFP線から得られた典型的な投影画像と、周分布を有する周辺の細胞(図1A,B)を示す一方、境界ドメイン細胞には細胞の長い軸に平行に整列した皮状微小管が含まれている。これらの観察は、SAMの異なる領域における皮質微小管の空間分布の違いを示す。時間経過イメージングは、切断の6時間以内に、非常に乱れたアレイからより組織化されたアレイに変化する皮質微小管アライメントを示した(図1C,D)。FibrilToolを用いて生成されたテンソルは、皮質微小管画像に重ね合わせることができる。長いテンソルは異方性の程度が高いことを表した。テンソルはまた、皮質微小管の整列の長軸を示した。抽出された情報は、平均異方性を経時にポッティングすることによって表すことができる(図1E)15。試験する必要がある治療または遺伝子型ごとに4〜5のサンプルサイズが推奨されます。結果は、6時間の期間内に皮質微小管異方性の漸進的な増加を示し、我々は、SAMの力学への変調は、皮質微小管組織の同時変化をもたらすと結論付けることを可能にした。
図1:シロイヌナズナシスSAMにおける皮質微小管異方性定量および機械的切り出しの結果の例。(A) 35S の表面投影: MBD-GFP SAM Z スタック。(B)赤のネマチックテンソルは、中央および境界ドメイン内の手動でセグメント化された細胞の皮質微小管異方性を示す。(C,D)アブレーション実験からの皮質微小管時間経過データの表面投影。(D)(C)から拡大画像は、個々の細胞の線学的テンソル情報で重ね合わせたアブレーション(赤いアスタリスク)の部位付近の皮質微小管の再整列を示す。(E)0-6時間から切除後に変化した皮質微小管異方性は、平均値を表す円と95%の信頼区間を示すバーを有するCの線学的テンソル標識領域から定量した。スケールバー= 25 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
メカノ知覚と伝達経路に関与する分子調節因子を特定するには、機械的信号伝達事象の評価が重要です。ここで説明するプロトコルは、シロイヌナズナズムのこのようなプロセスの読み出しとして皮質微小管応答を使用して、このような事象の定量的なビューを提供する。ここで説明する手順は、様々な組織タイプ16、17、18、19のいくつかの研究で日常的に使用されています。微小管異方性の有意な増加は、全ての組織タイプにおいて4時間の範囲で観察される。
プロトコルの最も重要なステップは、それ自身の水が細胞のturgor圧力の増加をもたらすので、水中の長期の水没のために微小管への変更が起こらないことを保証することです。したがって、撮像時間を最小限に抑える必要があります。これにより、画像の解像度が損なわれますが、摂動結果をより正確に読み取ることができます。2番目に重要なステップは、SAMの慎重な解剖です。サイズが非常に小さいため、手順中に損傷を受ける可能性が非常に高いです。古い器官のペダンクルクルが完全に除去されない場合、臓器を取り除くのはより困難になります。最後に、解剖中に試料は、SAMの長時間の空気暴露のために乾燥させてはならない。これは、アクセスが困難な、または直径が 50 μm 未満のミュータント SAM を処理する場合に特に一般的です。解剖ステップ間のSAM上の水滴の頻繁な適用は、この問題を防ぎます。
この手順の制限は、アブスレート領域に対する実際の制御が存在しないということです。これは、異なる条件や遺伝子型で発生する変化を比較する際の問題です。したがって、比較のために同様の方法で調整SAMを使用する必要があります。別の代替は、パルス紫外線レーザー20を用いてより制御されたアブレーションを行う。また、アブレーションは機械的特性の変化を生じすることが広く知られているが、創傷誘発応答とある程度に関連している。このため、観測値6,9を確認するために機械的圧縮やturgor誘発摂動などの他のアプローチを行う必要があります。
機械的な力を操作する他の方法と比較して、この方法の重要な利点は、非常に基本的なツールを使用するが、微小管応答の堅牢な読み出しを提供することです。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
なし。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
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