Summary
यहां हम शूट एपिकल मेरिस्टेम में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुले साइटोस्केलेटन के लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और भौतिक ताकतों में परिवर्तन के प्रति इसकी प्रतिक्रिया की निगरानी करते हैं।
Abstract
ग्रोथ और मॉर्फोजेनेसिस के सेल और टिश्यू लेवल रेगुलेशन को समझना कई दशकों से बायोलॉजिकल रिसर्च में सबसे आगे रहा है । आणविक और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने हमें इस बारे में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति दी कि जैव रासायनिक संकेत मॉर्फोजेनेटिक घटनाओं को कैसे प्रभावित करते हैं। हालांकि, यह तेजी से स्पष्ट है कि जैव रासायनिक संकेतों के अलावा, यांत्रिक संकेत कोशिका और ऊतक विकास के कई पहलुओं को भी प्रभावित करते हैं। अरबीडोप्सिस शूट एपिकल मेरिस्टेम (एसएएम) एक गुंबद के आकार की संरचना है जो उपरोक्त सभी अंगों की पीढ़ी के लिए जिम्मेदार है। कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुले साइटोस्केलेटन का संगठन जो पौधों की कोशिकाओं में एपोप्लास्टिक सेल्यूलोज जमाव को मध्यस्थता करता है, स्थानिक रूप से अलग है। सैम में कोशिकाओं की जैव भौतिक प्रकृति को समझने के लिए कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल्स के पैटर्न का विज़ुअलाइज़ेशन और मात्रात्मक मूल्यांकन आवश्यक है, क्योंकि सेल्यूलोज पौधे की कोशिका दीवार का सबसे कठोर घटक है। कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल संगठन का टकसाली रूप भी सैम में मौजूद ऊतक-व्यापी शारीरिक बलों का परिणाम है। इन भौतिक ताकतों का क्षुभव और कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल संगठन की बाद की निगरानी मशीनो-धारणा और मध्यस्थता मध्यस्थता में शामिल उम्मीदवार प्रोटीन की पहचान के लिए अनुमति देती है। यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो ऐसी प्रक्रियाओं की जांच करने में मदद करता है।
Introduction
पौधों की कोशिकाएं पॉलीसैकराइड्स और ग्लाइकोप्रोटीन के एक बाहरी मैट्रिक्स से घिरी होती हैं जो यांत्रिक रूप से फाइबर प्रबलित समग्र सामग्री जैसा दिखता है जो गतिशील रूप से अपने यांत्रिक गुणों को बदलने में सक्षम है1। पौधों की कोशिकाओं में वृद्धि कोशिका में पानी के तेज से प्रेरित होती है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिका की दीवार पर तन्य बलों का सहवर्ती बिल्डअप होता है। ऐसी ताकतों के जवाब में, सेल दीवार की भौतिक स्थिति में संशोधन सेल विस्तार की अनुमति देता है। प्राथमिक दीवारों वाली कोशिकाएं मुख्य रूप से पॉलीसैकराइड्स की रासायनिक संरचना में अंतर के कारण कोशिकाओं वाली माध्यमिक कोशिका दीवार की तुलना में तेजी से विकास के दौर से गुजर रही हैं। प्राथमिक दीवार कोशिकाएं ग्लाइकोप्रोटीन के अलावा सेल्यूलोज, हेमीसेलुलोज और पेक्टिन से बनी होती हैं, और लिग्निन की कमी होती है, एक घटक जो माध्यमिक सेल दीवार2में मौजूद है। सेल्यूलोज, β-1,4 बांड के माध्यम से जुड़ा एक ग्लूकोज बहुलक, सेल दीवारों का प्रमुख घटक है। इसे फिब्रिलर संरचनाओं में व्यवस्थित किया जाता है जो सेल विकास के दौरान अनुभव की जाने वाली उच्च तन्य ताकतों को सहन करने में सक्षम हैं3. तन्य बलों को बर्दाश्त करने के अलावा, एक तरजीही दिशा के साथ यांत्रिक सुदृढीकरण के परिणामस्वरूप सेल्यूलोज माइक्रोफिब्रिल के शुद्ध अभिविन्यास के लिए एक धुरी लंबवत के साथ टर्गर-चालित विस्तार होता है। सेल्यूलोज माइक्रोफिब्रिल्स का संगठन कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुले साइटोस्केलेटन से प्रभावित होता है, क्योंकि वे प्लाज्मा झिल्ली4पर स्थित सेल्यूलोज-संश्लेषण परिसरों के दिशात्मक आंदोलन का मार्गदर्शन करते हैं। इसलिए, फ्लोरोसेंट अणु के साथ जुड़े माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन या ट्यूबलिन का उपयोग करके कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल संगठन की निगरानी करना पौधों की कोशिकाओं में सेल्यूलोज के ओवरलाइंग पैटर्न के अवलोकन के लिए प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है।
कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुले साइटोस्केलेटन का पैटर्निंग सेल और ऊतक आकृति विज्ञान व्युत्पन्न यांत्रिक बलों के नियंत्रण में है। कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल संगठन में सैम के शीर्ष पर स्थित कोशिकाओं में समय के साथ कोई तरजीही संगठन नहीं है, जबकि परिधि में कोशिकाओं और सैम और उभरते अंग के बीच की सीमा में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल्स5की एक स्थिर, अत्यधिक संगठित सुप्रासेलर सरणी है। कोशिकाओं की यांत्रिक स्थिति को शारीरिक रूप से परेशान करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। ऑस्मोटिक स्थिति में परिवर्तन, साथ ही कोशिका की दीवार की कठोरता को प्रभावित करने वाले औषधीय यौगिकों के साथ उपचार के परिणामस्वरूप सेल6,7द्वारा अनुभवी तन्य बलों में बाद में परिवर्तन हो सकते हैं। ऊतकों द्वारा अनुभव की जाने वाली संपीड़न बलों में क्रमिक वृद्धि की अनुमति देने वाले कॉन्ट्रापशन का उपयोग एक औरविकल्पहै । कोशिकाओं के साथ बिना किसी शारीरिक संपर्क के यांत्रिक बलों को प्रभावित करने के लिए अपकेंद्रित्रबलोंका उपयोग भी दिखाया गया है । हालांकि, कोशिकाओं के एक समूह में दिशात्मक ताकतों को बदलने का सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला साधन इस तथ्य का लाभ उठाते हैं कि सभी एपिडर्मल कोशिकाएं तनाव में हैं और कोशिकाओं का शारीरिक एब्लेशन स्थानीय रूप से टर्गर दबाव को खत्म करेगा और साथ ही सेल-टू-सेल आसंजन को बाधित करेगा, जिससे पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा अनुभवी तन्य बलों को संशोधित किया जा सकेगा। यह या तो एक उच्च स्तरीय स्पंदित पराबैंगनी लेजर को लक्षित करके या एक ठीक सुई के माध्यम से किया जाता है।
यहां हम एसएएम में यांत्रिक क्षोभ के लिए कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबल व्यवहार की इमेजिंग और आकलन की प्रक्रिया के बारे में विस्तार से बताते हैं।
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Protocol
1. पौधों का विकास
- मिट्टी पर10 हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एमबीडी-जीएफपी) के साथ जुड़े माइक्रोट्यूबुले बाध्यकारी डोमेन को व्यक्त करते हुए अरबीडोप्सिस बीज बोएं और अंकुरण के लिए 1 सप्ताह के लिए 20 डिग्री सेल्सियस/6 डिग्री सेल्सियस की स्थिति में लंबे दिन (16 घंटे दिन/8 घंटे की स्थिति) रखें ।
- अंकुरण के बाद, मजबूत वनस्पति विकास की अनुमति देने के लिए पर्याप्त विकास स्थान के साथ नए बर्तनों में रोपण स्थानांतरित करें। पौधों को कम दिन (8 घंटे दिन /16 घंटे रात), 20 डिग्री सेल्सियस/16 डिग्री सेल्सियस की स्थिति 3-5 सप्ताह तक रखें।
- पौधों को लंबे दिन (16 घंटे दिन /8 घंटे की रात), 20 डिग्री सेल्सियस/16 डिग्री सेल्सियस की स्थिति में स्थानांतरित करें और पौधों को बोल्ट (2-3 सप्ताह) तक रखें। फूलों को 2-5 सेमी तक बढ़ने दें।
2. मध्यम तैयारी
- छोटे पेट्री व्यंजन (लगभग 5.5 सेमी चौड़ा, 1.5 सेमी गहरा) को 2% एगर उठे के साथ लगभग आधा गहराई में भरकर विच्छेदन व्यंजन तैयार करें। विच्छेदन व्यंजन भी एकल समय बिंदु इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- ग्रोथ मीडियम तैयार करें।
- 5 ग्राम मायो-इनोसिटोल, 0.05 ग्राम निकोटीनिक एसिड, 0.05 ग्राम पाइरिडॉक्सिन हाइड्रोक्लोराइड, 0.5 ग्राम थियामाइन हाइड्रोक्लोराइड और 0.1 ग्राम ग्लाइसिन के साथ 1,000x विटामिन स्टॉक समाधान की 50 मिलियन पीएल तैयार करें।
- विकास माध्यम तैयार करें, 1/2 मुरशिगे और स्कूग माध्यम से बना, 1% सुक्रोज, 1.6% एगर, 1x विटामिन, पीएच = 5.8। ऑटोक्लेव और इसे ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं।
- एक बाँझ, साफ बेंच पर, 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में विसर्जित करके टिका प्लास्टिक बक्से (लगभग 5.2 सेमी x 5.2 सेमी x 3 सेमी) को स्टरलाइज करें।
- एक बाँझ, स्वच्छ पीठ पर, एक बार माध्यम सहने योग्य गर्मी पर है, २०० एनएम की अंतिम एकाग्रता के लिए N6-बेंजीलाडेनिन जोड़ें, और 1/1,000 पीपीएम (संयंत्र परिरक्षक मिश्रण) और अच्छी तरह से मिश्रण । बाँझ बक्से को माध्यम के साथ लगभग आधा उनकी गहराई तक भरें।
3. सैम का विच्छेदन
- फूलों को काटें और पैरों की उंगलियों के आधार पर फूलों को छीलकर तेज संदंश के साथ पुराने फूलों की कलियों को हटा दें जब तक कि उन्हें नग्न आंखों से देखना मुश्किल न हो।
- संदंश के साथ विच्छेदन पकवान में एगर उठी में एक भट्ठा बनाएं और मोटी आगर में इनफ्लोरेसेंस बेस लगाएं। यह सैम को बेनकाब करने के लिए युवा फूलों के आगे ठीक विच्छेदन के लिए अच्छा ठोस समर्थन देता है।
- शेष फूल कलियों को सबसे पुराने और क्रमिक रूप से एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत छोटे चरणों में प्रगति के साथ शुरू करने वाले संदंश के साथ धक्का देकर तब तक निकालें जब तक कि सैम दिखाई न दे। सैम आमतौर पर उजागर किया जाता है जब 6 से 7 चरण तक पुराने फूल हटा दिए जाते हैं। एक बार सैम उजागर हो जाने के बाद, अगले चरण में जल्दी से आगे बढ़कर नमूने के निर्जलीकरण से बचें।
4. संस्कारी एएसएम का स्थानांतरण और विकास
- आयताकार प्लास्टिक टिका संस्कृति बॉक्स में विकास माध्यम में धारा 1 में विस्तृत के रूप में हौसले से विच्छेदित नमूना संयंत्र सिर्फ मध्यम सतह के ऊपर उजागर सैम के साथ । संस्कृति बक्से के किनारों पर बाँझ deionized पानी की कुछ बूंदें जोड़ें और बॉक्स के अंदर आर्द्रता बनाए रखने के लिए ढक्कन बंद करें। सुनिश्चित करें कि जोड़ा गया पानी सैम को कवर नहीं करता है।
- ढक्कन को बंद करें और बॉक्स को माइक्रोपोर टेप से लपेटें। लंबे दिन या निरंतर दिन की स्थिति में 22 डिग्री सेल्सियस पर विकास बॉक्स रखें और 12-24 घंटे के लिए बढ़ने के लिए सैम विच्छेदन प्रक्रिया से उबरने और संस्कृति की स्थिति के लिए अनुकूल करने के लिए अनुमति देते हैं ।
5. सैम की इमेजिंग
- नमूना कवर करने के लिए बाँझ deionized पानी के साथ सैम युक्त संस्कृति बॉक्स भरें । विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जांच करें और 1 एमएल पिपेट के साथ नमूने पर निर्देशित पानी को जबरदस्ती छिड़ककर किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें।
- संस्कृति बॉक्स को एक ईमानदार कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें। ध्यान रखें कि संस्कृति बॉक्स माइक्रोस्कोप उद्देश्यों से संपर्क नहीं करता है। संख्यात्मक अपर्चर 0.8-1 के लंबी दूरी के 40x या 60x पानी सूई लेंस का उपयोग करें जो कवर ग्लास के बिना इमेजिंग के लिए इष्टतम है।
- उद्देश्य को पानी में कम करें और उद्देश्य के सामने लेंस पर गठित हवा के बुलबुले की जांच करें। मंच को कम करके किसी भी बुलबुले को हटा दें और धीरे-धीरे लेंस को ऑप्टिकल ऊतक के साथ पोंछते हैं और पानी में पुनर्मौस होने से पहले पाश्चुर पिपेट के साथ उद्देश्य के सामने के लेंस में थोड़ी मात्रा में पानी जोड़ते हैं।
- कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के जीएफपी फिल्टर और ईईपी-रोशनी मॉड्यूल का उपयोग करके, नमूने का पता लगाने के लिए XY नियंत्रक को समायोजित करें। नेत्र की स्थिति को समायोजित करना, सैम को सीधे प्रकाश स्रोत के नीचे रखें और शीर्ष स्थित होने तक जेड अक्ष के साथ ध्यान केंद्रित करें।
नोट: पराबैंगनी प्रकाश पर सीधे मत देखो। - एक बार नमूना मिल जाने के बाद, इसे रोमांचक जीएफपी (यानी, 488 एनएम या 496 एनएम लेजर स्रोत) में सक्षम लेजर का उपयोग करके रोशन करें। माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल जूम को एडजस्ट करें ताकि पूरा सैम और स्टेज 1 फ्लोरल प्राइमोर्डिया देखने के क्षेत्र में हो। इसके अलावा लेजर आउटपुट की शक्ति को समायोजित करें और इष्टतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात सुनिश्चित करने के लिए सेटिंग्स हासिल करें।
नोट: लेजर की उच्च तीव्रता के परिणामस्वरूप नमूने की फोटो ब्लीचिंग होगी। अंडर-एंड ओवरएक्सपोजर पैलेट इन सेटिंग्स का बेहतर समायोजन सुनिश्चित करने में मदद करता है। - नमूना 2-5 मिनट के लिए बसने के लिए अनुमति दें। लगभग 0.3 माइक्रोन पिक्सेल आकार के संकल्प पर 0.25 माइक्रोन-0.5 माइक्रोन जेड स्लाइस अंतराल पर नमूने के कॉन्फोकल जेड स्टैक प्राप्त करें। सुनिश्चित करें कि एक नमूने के लिए जेड स्टैक प्राप्त करने के लिए आवश्यक कुल इमेजिंग समय अधिग्रहण के पूरा होने तक नमूना पानी में डूबे होने के समय से 10 मिनट से अधिक नहीं है।
- तुरंत पानी निकालें और कल्चर बॉक्स को वापस ग्रोथ चैंबर में ट्रांसफर करें। नमूनों को लंबे समय तक पानी के नीचे रखने से कोशिकाओं की ऑस्मोटिक स्थिति प्रभावित होगी।
6. सैम के माइक्रोमैकेनिकल क्षर्तना
- सेक्शन 5 में वर्णित इमेजिंग शर्तों को सेट करें और कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबल संगठन के प्रीब्लेशन इमेज स्टैक प्राप्त करें।
- संस्कृति पकवान में पानी को डिकेंट करें। एक साफ सिरिंज सुई (0.4 मिमी x 20 मिमी) के साथ एब्लेशन करें।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, ध्यान से सुई पकड़ और धीरे से सैम दृष्टिकोण।
नोट: सांस पकड़ और एक आराम पकड़ के साथ सुई को संभालने में मदद करता है मिलाते हुए । - संक्षेप में सुई टिप के साथ सैम गुंबद से संपर्क करने की पुष्टि करने के लिए कि ablation किया जाता है। अधिमानतः सैम की परिधि पर एब्लेशन करते हैं, जो गुंबद के मध्य क्षेत्र में असंगठित कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबल के व्यवहार और संक्रमण के दृश्य की अनुमति देता है।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, ध्यान से सुई पकड़ और धीरे से सैम दृष्टिकोण।
- बाँझ deionized पानी के साथ संस्कृति पकवान फिर से भरना और प्रोपिडियम idodide (10 μg/mL) जोड़ें । जीएफपी कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुले सिग्नल की निगरानी के अलावा, एक अलग चैनल का उपयोग करके प्रोपिडियम आयोडाइड की कल्पना करना स्पष्ट रूप से एब्लेटेड कोशिकाओं के क्षेत्रों को चिह्नित कर सकता है। प्रोपिडियम आयोडाइड 600-650 एनएम के बीच दर्ज उत्सर्जन के साथ 561 एनएम या किसी अन्य उपयुक्त लेजर का उपयोग करके प्रकाशित किया जाता है।
- एब्लेशन के ठीक बाद छवि ढेर प्राप्त करें (धारा 6 देखें) और 6 घंटे की अवधि के लिए हर 2 घंटे में अधिग्रहण प्रक्रिया दोहराएं। हर बार बिंदु के बाद इनक्यूबेशन कक्ष में नमूना के साथ संस्कृति पकवान वापस। सुनिश्चित करें कि संस्कृति मीडिया पर कुछ पानी बचा है और आनंद को रोकने के लिए संस्कृति पकवान को माइक्रोपोर टेप के साथ लपेटें।
7. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और क्वांटिफिकेशन
- मॉर्फोग्राफएक्स 11 , फिजी 12 या मैक्रोसर्फकट13जैसे स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सतहअनुमानोंको उत्पन्न करें।
- फिजी में फिब्रिलटूल14 मैक्रो का उपयोग करके कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल एनिसोट्रोपी का निष्कर्षण करें।
नोट: सॉफ्टवेयर उपयोग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल संबंधित प्रशस्ति पत्र से प्राप्त किया जा सकता है।
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Representative Results
चित्रा 1 गुंबद के केंद्र में कोशिकाओं के साथ एमबीडी-जीएफपी लाइनों से प्राप्त विशिष्ट प्रक्षेपण छवियों को दिखाता है जिसमें अव्यवस्थित कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल्स होते हैं, और परिधि में कोशिकाओं में एक परिधि वितरण(चित्रा 1,बी)होता है, जबकि सीमा डोमेन कोशिकाओं में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल होते हैं जो कोशिका की लंबी धुरी के समानांतर संरेखित होते हैं। ये टिप्पणियां सैम के विभिन्न डोमेन में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबल्स के स्थानिक वितरण में अंतर दिखाती हैं। टाइम लैप्स इमेजिंग ने कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल अलाइनमेंट को अत्यधिक अव्यवस्थित सरणी से बदलकर एब्लेशन के 6 एच(चित्रा 1सी, डी)के भीतर अधिक संगठित सरणी में बदल दिया। फिब्रिलटूल का उपयोग करके उत्पन्न टेनर्स को कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल छवि पर आरोपित किया जा सकता है। एक लंबा टेनर एनिसोट्रोपी की डिग्री का प्रतिनिधित्व करता था। टेनर्स ने कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबल्स के अलाइनमेंट की प्रमुख धुरी को भी दिखाया । निकाली गई जानकारी का प्रतिनिधित्व समय के साथ मतलब एनिसोट्रोपी(चित्र 1ई)15से किया जा सकता है । उपचार या जीनोटाइप के अनुसार चार से पांच के नमूना आकार की सिफारिश की जाती है जिसका परीक्षण किया जाना चाहिए। परिणामों ने 6 घंटे की अवधि के भीतर कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल एनिसोट्रोपी में क्रमिक वृद्धि दिखाई और हमें यह निष्कर्ष निकालने की अनुमति दी कि सैम के यांत्रिकी के लिए मॉडुलन कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल संगठन में समवर्ती परिवर्तनों में परिणाम देता है।
चित्रा 1: अरबीडोप्सिस सैम में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल एनिसोट्रोपी क्वांटिफिकेशन और मैकेनिकल एब्लेशन का उदाहरण परिणाम। (A)35S की सतह प्रक्षेपण: एमबीडी-जीएफपी सैम जेड स्टैक। (ख)लाल रंग में नेमैटिक टेनर जो केंद्रीय और सीमा डोमेन में मैन्युअल रूप से खंडित कोशिकाओं की कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल एनिसोट्रोपी दिखाते हैं । (C,D)। एब्लेशन प्रयोग से कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल समय चूक डेटा के सतह अनुमान। (घ)से बढ़ाया छवियों(C)ablation (लाल तारक) की साइट के पास कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल पुनर्संरेखण दिखा व्यक्तिगत कोशिकाओं की नेमैटिक tensor जानकारी के साथ मढ़ा । (ङ)कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुले एनिसोट्रोपी 0-6 एच से एब्लेशन के बाद बदल गया, जो सी में नेमैटिक टेनर लेबल वाले क्षेत्र से निर्धारित है, जिसमें मतलब मूल्य का प्रतिनिधित्व करने वाले सर्कल और 95% विश्वास अंतराल का संकेत देने वाली सलाखों के साथ। स्केल बार = 25 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
मेकानो-परसेप्शन और ट्रांसडक्शन रास्तों में शामिल आणविक नियामकों की पहचान करने के लिए यांत्रिक सिग्नल ट्रांसडक्शन इवेंट्स का आकलन महत्वपूर्ण है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल अरबीडोप्सिस एसएएमएस में ऐसी प्रक्रिया के लिए एक readout के रूप में कॉर्टिकल माइक्रोट्यूबुल प्रतिक्रिया का उपयोग करके ऐसी घटनाओं का मात्रात्मक दृश्य प्रदान करता है। यहां वर्णित प्रक्रिया का नियमित रूप से विभिन्न ऊतक प्रकार 16 ,17,18,19में कई अध्ययनों में उपयोग कियाजाताहै । माइक्रोट्यूबुल एनिसोट्रोपी में एक महत्वपूर्ण वृद्धि सभी ऊतकों में 4 घंटे की सीमा में देखी जाती है।
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि माइक्रोट्यूबल में परिवर्तन पानी में लंबे समय तक डूबने के कारण नहीं होते हैं, क्योंकि अपने दम पर पानी के परिणामस्वरूप कोशिकाओं के टर्गोर दबाव में वृद्धि होती है । इसलिए इमेजिंग टाइम को कम से कम किया जाना चाहिए। यह छवि संकल्प समझौता कर सकते हैं, लेकिन यह क्षोभ परिणामों का एक अधिक सटीक readout प्रदान करता है । दूसरा सबसे महत्वपूर्ण कदम सैम का सावधानीपूर्वक विच्छेदन है। इसके बहुत छोटे आकार के कारण, प्रक्रिया के दौरान इसके क्षतिग्रस्त होने की संभावना है। यदि पुराने अंगों के पेडकल्स पूरी तरह से नहीं हटाए जाते हैं तो अंगों को हटाना अधिक कठिन हो जाता है। अंत में, विच्छेदन के दौरान नमूना सैम के लंबे समय तक हवा के संपर्क के कारण बाहर सूखने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए । यह विशेष रूप से आम है जब उत्परिवर्ती SAMs है कि उपयोग करने के लिए कठिन है या कि व्यास में ५० μm से छोटे है संभाल । विच्छेदन चरणों के बीच सैम पर पानी की बूंदों का लगातार आवेदन इस मुद्दे को रोकता है।
इस प्रक्रिया की एक सीमा यह है कि एब्लेटेड क्षेत्र पर कोई वास्तविक नियंत्रण नहीं है। यह विभिन्न परिस्थितियों और जीनोटाइप में होने वाले परिवर्तनों की तुलना करने में एक मुद्दा है । इसलिए, तुलना के लिए इसी तरह से बेफिक्र नियंत्रण SAMs का उपयोग करना आवश्यक है। एक अन्य विकल्प स्पंदित पराबैंगनी लेजर20का उपयोग करके अधिक नियंत्रित एब्लेशन का प्रदर्शन कर रहा है। इसके अलावा, जबकि एब्लेशन व्यापक रूप से यांत्रिक गुणों में परिवर्तन पैदा करने के लिए जाना जाता है, यह घाव-प्रेरित प्रतिक्रियाओं के साथ एक निश्चित डिग्री से भी जुड़ा हुआ है। इस कारण से, अन्य दृष्टिकोण, जैसे यांत्रिक संपीड़न और टर्गोर-प्रेरित क्षोभ6,9टिप्पणियों की पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किए जाने की आवश्यकता है।
यांत्रिक बलों में हेरफेर करने के अन्य तरीकों की तुलना में इस विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह बहुत बुनियादी उपकरणों का उपयोग करता है फिर भी माइक्रोट्यूबुल प्रतिक्रिया का एक मजबूत रीडआउट प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
कोई नहीं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
- Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
- Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
- Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).
- Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
- Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
- Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
- Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
- Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
- Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036 (2019).
- Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
- Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).
