Summary
여기서 우리는 촬영 에 피질 미세 투하 세포 골격의 살아있는 세포 이미징을위한 프로토콜을 설명하고 물리적 인 힘의 변화에 대한 반응을 모니터링.
Abstract
성장과 형태 발생의 세포 및 조직 수준 조절을 이해하는 것은 수십 년 동안 생물학적 연구의 최전선에 있었습니다. 분자 및 이미징 기술의 발전으로 생화학 적 신호가 형태 유전학 적 사건에 미치는 영향에 대한 통찰력을 얻을 수있었습니다. 그러나 생화학 적 신호 외에도 기계적 단서가 세포 및 조직 성장의 여러 측면에 영향을 미친다는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다. 아라비도시스 는 모든 지상 장기의 생성을 담당하는 돔 모양의 구조입니다. 식물 세포에서 아포가소성 셀룰로오스 증착을 중재하는 피질 미세 투덜유 세포 골격의 조직은 공간적으로 구별된다. 셀룰로오스는 식물 세포벽의 가장 단단한 성분이기 때문에 피질 마이크로투블러의 패턴의 시각화 및 정량적 평가가 SAM에서 세포의 생물물리학적 특성을 이해하는 데 필요합니다. 피질 마이크로투룰 조직의 고정관형 형태는 SAM에 존재하는 조직 전체의 물리적 힘의 결과이기도 합니다. 이러한 물리적 힘의 왜곡과 피질 마이크로 투튜브 조직의 후속 모니터링은 메카노 지각 및 트랜스포메이션을 중재하는 데 관련된 후보 단백질의 식별을 가능하게 합니다. 여기에서는 이러한 프로세스를 조사하는 데 도움이 되는 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
식물 세포는 기계적으로 기계적 으로 변경할 수있는 섬유 강화 복합 재료와 유사한 다당류및 당단백질의 세포외 매트릭스에 의해포위된다 1. 식물 세포의 성장은 세포로 물의 섭취에 의해 구동되며, 이는 세포 벽에 인장력의 수반되는 축적을 초래합니다. 이러한 힘에 대응하여 세포벽의 물리적 상태를 수정하면 세포 팽창이 가능합니다. 1차 벽을 가진 세포는 주로 내다당류의 화학적 조성의 차이로 인해 세포를 포함하는 이차 세포벽에 비해 급속한 성장을 이룰 수 있다. 1차 벽세포는 당단백질 이외에 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴으로 구성되며, 이차 세포벽2에존재하는 성분인 리그닌이 결여된다. 셀룰로오스, β-1,4 결합을 통해 연결 된 포도 당 고분자, 세포벽의 주요 구성 요소. 세포 성장3에서 경험된 높은 인장력을 견딜 수 있는 세브릴라 구조로 구성됩니다. 인장력을 견딜 뿐만 아니라, 우대 방향을 따라 기계적 보강은 셀룰로오스 마이크로피브릴의 순 방향에 수직인 축을 따라 터고 구동 팽창을 초래한다. 셀룰로오스 마이크로피브릴의 조직은 혈장 막4에위치한 셀룰로오스 합성 복합체의 방향 이동을 안내하기 때문에 피질 미세 투덜어 사이토스켈레톤에 의해 영향을 받습니다. 따라서, 형광 분자와 융합된 마이크로투룰관련 단백질 또는 튜룰린을 이용한 피질 마이크로투룰 조직을 모니터링하는 것은 식물 세포에서 셀룰로오스의 과열 패턴을 관찰하기 위한 프록시역할을 한다.
피질 미세 투하 세포 골격의 패터닝은 세포 및 조직 형태 유래 기계적 힘의 통제 하에 있다. 피질 마이크로튜버 조직은 SAM의 정점에 위치한 세포에서 시간이 지남에 따라 어떤 우대 조직이 없는 반면, 주변의 세포와 SAM과 신흥 기관 사이의 경계는 피질 마이크로튜브5의안정적이고 고도로 조직된 수퍼셀룰러 배열을 갖는다. 몇몇 접근은 세포의 기계적 상태를 물리적으로 왜곡하기 위하여 개발되었습니다. 삼투성 상태에 대한 변화뿐만 아니라 세포벽의 강성에 영향을 미치는 약리학적 및 효소 화합물로 치료하는 것은 세포 에 의해 경험된 인장력의 후속 변화를 초래할 수있다6,7. 조직에 의해 경험되는 압축력의 점진적 증가를 허용하는 진기한의 사용은 또 다른 대안8이다. 원심력의 적용은 또한세포(9)와의물리적 접촉 없이 기계적 힘에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 그러나, 세포의 그룹에서 방향력을 변화시키는 가장 널리 사용되는 수단은 모든 표피 세포가 세포의 장력 및 물리적 절제 하에 있다는 사실을 활용하여 로컬로 터고 압력을 제거하고 세포 대 세포 접착을 방해하여 이웃 세포에 의해 경험되는 인장력을 수정합니다. 이것은 고성능 펄스 자외선 레이저를 대상으로 하거나 미세 한 바늘을 통해 수행됩니다.
여기서 우리는 SAM에서 기계적 혼란을 위한 피질 미세 투벌 거동을 이미징하고 평가하는 과정에 대해 자세히 설명합니다.
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Protocol
1. 식물 성장
- 뿌리 아라비도시스 씨앗은 녹색 형광 단백질 (MBD-GFP)10과 융합 된 미세 투불 결합 도메인을 토양에10 및 긴 하루 (16 h day / 8 박 밤), 발아를 위한 1 주일 동안 20 °C /6 °C 조건에 보관하십시오.
- 발아 후, 강력한 식물 성장을 허용하기에 충분한 성장 공간을 가진 새로운 냄비에 묘목을 전송합니다. 짧은 하루 (8 시간 /16 박 밤), 3-5 주 동안 20 ° C / 16 ° C 조건에 식물을 유지합니다.
- 긴 하루 (16 시간 / 8 박), 20 ° C / 16 ° C 조건으로 식물을 전송하고 식물 볼트 (2-3 주)까지 유지합니다. 꽃피는 2-5cm 길이까지 자랄 수 있습니다.
2. 중간 준비
- 작은 페트리 요리(폭 약 5.5cm, 깊이 1.5cm)를 2% 아가로즈로 깊이의 약 절반으로 채우어 해부 요리를 준비합니다. 해부 요리는 또한 단일 시간 포인트 이미징에 사용될 수 있습니다.
- 성장 매체를 준비합니다.
- 1,000x 비타민 스톡 용액 50mL, 니코티네산 0.05g, 피리독신 염산염 0.05g, 티아민 염산염 0.5g, 글리신 0.1g을 준비한다.
- 무라시게와 스쿠그 배지, 1%자당, 1.6% 천, 1x 비타민, pH = 5.8로 구성된 성장 배지를 준비한다. 오토클레이브를 식히십시오.
- 멸균, 깨끗한 벤치에, 15 분 동안 70 %의 에탄올에 침지하여 힌지 플라스틱 상자 (약 5.2cm x 5.2 cm x 3cm)를 살균합니다.
- 멸균, 깨끗한 벤치에, 일단 매체는 견딜 수있는 따뜻함에, 200 nM의 최종 농도에 N6 벤질 라데닌을 추가하고, 1/1,000 PPM (식물 방부제 혼합물) 잘 혼합. 멸균 상자를 중간으로 깊이의 약 절반으로 채웁니다.
3. SAM의 해부
- 꽃집을 자르고 구단의 기지에서 꽃을 벗겨 내어 날카로운 집게로 오래된 꽃 봉오리를 제거하여 육안으로 보기가 어려울 때까지 제거하십시오.
- 해부 접시에 아가로즈에 슬릿을 만들고 집게로 꽃무오리 베이스를 두꺼운 한천에 심습니다. 이것은 SAM을 노출하는 젊은 꽃의 추가 미세 해부에 대한 좋은 견고한 지원을 제공합니다.
- SAM이 보일 때까지 해부 현미경으로 가장 오래되고 순차적으로 진행되는 집게로 시작하여 나머지 꽃 싹을 제거하십시오. SAM은 일반적으로 6단계에서 7단계까지의 오래된 꽃을 제거할 때 노출됩니다. SAM이 노출되면 다음 단계로 빠르게 이동하여 샘플의 탈수를 피하십시오.
4. 배양 된 SAM의 전송 및 성장
- SAM이 중간 표면 위에 노출된 직사각형 플라스틱 힌지 배양 상자의 성장 배지에 1절에 자세히 설명된 대로 갓 해부된 샘플을 심는다. 배양 상자의 가장자리에 멸균 된 물 몇 방울을 추가하고 상자 내부의 습도를 유지하기 위해 뚜껑을 닫습니다. 추가된 물이 SAM을 커버하지 않는지 확인합니다.
- 뚜껑을 닫고 마이크로포어 테이프로 상자를 감쌉니다. 성장 상자를 22°C에서 장기간 또는 연속적인 하루 조건에 배치하고 SAM이 해부 절차에서 회복되고 문화 조건에 적응할 수 있도록 12-24h로 성장한다.
5. 샘의 이미징
- SAM을 포함하는 배양 상자를 멸균 된 물로 채우고 샘플을 덮습니다. 해부 현미경아래에서 확인하고 1mL 파이펫으로 샘플을 향하도록 물을 강제로 분사하여 기포를 제거하십시오.
- 컬쳐 박스를 똑바로 공초점 현미경 단계에 놓습니다. 문화 상자는 현미경 목표에 연락하지 않는 주의하십시오. 커버 글래스 없이 이미징에 최적 수치 조리개 0.8-1의 장거리 40x 또는 60x 물 디핑 렌즈를 사용합니다.
- 목표를 물 속으로 낮추고 목표의 전면 렌즈에 형성된 기포를 확인합니다. 스테이지를 낮추고 광학 조직으로 렌즈를 부드럽게 닦아내고 파스퇴르 파이펫으로 목표의 전면 렌즈에 소량의 물을 추가하여 거품을 제거한 후 물에 재진입하십시오.
- 공초점 현미경의 GFP 필터 및 에피 조명 모듈을 사용하여 XY 컨트롤러를 조정하여 샘플을 찾습니다. 안구의 위치를 조정하고, SAM을 광원 아래에 직접 넣고 정점을 배치할 때까지 Z 축을 따라 초점을 맞춥니다.
참고: 자외선을 직접 바라지 마십시오. - 샘플이 발견되면, 흥미 진진한 GFP (즉, 488 nm 또는 496 nm 레이저 소스)가 가능한 레이저를 사용하여 조명하십시오. 현미경의 광학 줌을 조정하여 전체 SAM과 스테이지 1 플로럴 프리모르디아가 시야에 있도록 합니다. 또한 최적의 신호 대 잡음 비율을 보장하기 위해 레이저 출력 및 게인 설정의 힘을 조정합니다.
참고 : 레이저의 고강도는 샘플의 사진 표백을 초래할 것이다. 노출 부족 및 과다 노출 팔레트는 이러한 설정을 더 잘 조정할 수 있도록 도와줍니다. - 샘플을 2-5분 동안 정산하도록 허용합니다. 약 0.3 μm 픽셀 크기의 해상도로 0.25 μm-0.5 μm Z 슬라이스 간격으로 시료의 공초점 Z 스택을 획득합니다. 한 샘플에 대한 Z 스택을 획득하는 데 필요한 총 이미징 시간이 수집완료될 때까지 샘플이 물에 담근 시점으로부터 10분을 초과하지 않도록 합니다.
- 즉시 물을 제거하고 재배 챔버로 다시 문화 상자를 전송합니다. 물 아래에 오랜 시간 동안 샘플을 유지하는 것은 세포의 삼투력 상태에 영향을 미칠 것입니다.
6. SAM의 미세 기계적 동요
- 섹션 5에 설명된 바와 같이 이미징 조건을 설정하고 피질 마이크로튜블러 조직의 예절 이미지 스택을 획득한다.
- 문화 요리에 물을 데산. 깨끗한 주사기 바늘(0.4mm x 20mm)으로 절제작업을 수행합니다.
- 해부 현미경을 사용하여 조심스럽게 바늘을 잡고 천천히 SAM에 접근하십시오.
참고: 바늘을 여유로운 그립으로 잡고 핸들링하면 흔들림을 방지할 수 있습니다. - SAM 돔에 바늘 끝으로 간략하게 연락하여 절제가 완료되는지 확인합니다. 바람직하게는 돔의 중앙 영역에서 조직되지 않은 피질 마이크로투블러의 동작과 전환을 허용하는 SAM의 주변에 절제를 수행한다.
- 해부 현미경을 사용하여 조심스럽게 바늘을 잡고 천천히 SAM에 접근하십시오.
- 배양 접시를 멸균 제열물로 리필하고 프로피듐 이도디드(10 μg/mL)를 추가합니다. GFP 피질 마이크로투룰 신호를 모니터링하는 것 외에도, 별도의 채널을 사용하여 오오드를 시각화하면 축약된 세포의 영역을 명확하게 표시할 수 있다. 프로피듐 요오드 (Propidium 요오드)는 600-650 nm 사이에 기록 된 방출이있는 561 nm 또는 기타 적합한 레이저를 사용하여 조명됩니다.
- 절제 직후 이미지 스택을 획득(섹션 6 참조) 6시간 동안 2시간마다 획득 프로세스를 반복합니다. 매 시간 포인트 후 배양 실에 샘플과 함께 문화 접시를 반환합니다. 문화 매체에 남은 물이 있는지 확인하고 건조를 방지하기 위해 마이크로 포어 테이프로 문화 접시를 포장하십시오.
7. 데이터 시각화 및 정량화
- MORPHOGRAPHX11,FIJI12또는 매크로 서프컷13과같은 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 표면 프로젝션을 생성합니다.
- 피지에서 피브릴툴14 매크로를 사용하여 피질 미세 투필 이소트로피의 추출을 수행합니다.
참고: 소프트웨어 사용에 대한 자세한 프로토콜은 각 인용에서 얻을 수 있습니다.
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Representative Results
도 1은 무질서한 피질 마이크로투풀을 포함하는 돔의 중심에 세포가 있는 MBD-GFP 선에서 얻은 일반적인 투영 영상을 나타내며, 주변의 세포는 일주분포(도 1A,B)를가지는 반면 경계 도메인 세포는 세포의 긴 축과 평행하게 정렬된 피질 마이크로튜브를 포함한다. 이러한 관측은 SAM의 다른 영역에서 피질 마이크로튜브의 공간 분포의 차이를 보여줍니다. 시간 경과 이미징은 고도로 무질서한 어레이에서 절제6 h(도 1C, D)내의 조직된 배열로 변화하는피질마이크로투블러 정렬을 보여 주었다. FibrilTool을 사용하여 생성된 텐서가 피질 마이크로튜블 이미지에 중첩될 수 있습니다. 더 긴 텐서는 이소트로피의 더 높은 정도를 나타냈다. 텐서는 또한 피질 마이크로투블러의 정렬의 주요 축을 보여주었다. 추출된 정보는 시간이 지남에 따라 평균 이소성축을 포팅하여 나타낼 수있다(도 1E)15. 4~5의 샘플 크기는 시험해야 하는 치료 또는 유전자형 당 권장됩니다. 결과는 6 h의 기간 안에 피질 microtubule anisotropy에 있는 점진적인 증가를 보여주었고 우리가 SAM의 역학에 변조가 피질 microtubule 조직에 있는 동시 변경귀착된다는 결론을 내릴 수 있었습니다.
도 1: 아비도시스 SAM에서 피질 미세투알 이소트로피 정량화 및 기계적 절제의 예 결과. (A)35S의 표면 투영: MBD-GFP SAM Z 스택. (B)중앙 및 경계 영역에서 수동으로 분할된 세포의 피질 미세tubule 이산화를 나타내는 빨간색의 네매틱 텐서. (C,D). 절제 실험에서 피질 미세 투하 시간 경과 데이터의 표면 투영. (D)개별 세포의 네매텐서 정보로 겹쳐진 절제(적별별) 부위 근처의 피질 미세관 재정렬을 보여주는(C)확대된 이미지. (E)관형 미세투막 이소트로피는 0-6 h에서 절제 후 변경되었으며, C의 네매틱 텐서 표시 영역으로부터 정량화되어 평균 값과 95% 신뢰 구간을 나타내는 막대를 나타내는 원을 나타낸다. 스케일 바 = 25 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
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Discussion
기계 신호 변환 이벤트의 평가는 메카노 지각 및 트랜스듀션 경로에 관련된 분자 조절기를 식별하는 데 매우 중요합니다. 여기서 설명된 프로토콜은 아기도시스 SAM에서 이러한 프로세스에 대한 판독으로 피질 마이크로튜뮬 반응을 사용하여 이러한 이벤트에 대한 정량적 보기를 제공한다. 여기서 설명된절차는 다양한 조직유형(16, 17,18,19)에서여러 연구에서 일상적으로 사용된다. microtubule anisotropy에 있는 중요한 증가는 모든 조직 모형에 있는 4 시간의 범위에서 관찰됩니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 자체 물이 세포의 터고 압력의 증가를 초래하기 때문에 미세 투부에 대한 변경이 물에 장기간 침수로 인해 발생하지 않도록하는 것입니다. 따라서 이미징 시간을 최소화해야 합니다. 이렇게 하면 이미지 해상도가 손상될 수 있지만 중단 결과를 보다 정확하게 읽을 수 있습니다. 두 번째로 가장 중요한 단계는 SAM의 주의 깊은 해부입니다. 크기가 매우 작기 때문에 시술 중에 손상될 가능성이 큽습니다. 장기의 페달삼촌이 완전히 제거되지 않으면 장기를 제거하기가 더 어려워집니다. 마지막으로, 해부 도중 SAM의 장기간 공기 노출로 인해 시료가 건조할 수 없습니다. 이는 접근하기 어렵거나 직경 50μm 미만의 돌연변이 SAM을 처리할 때 특히 일반적입니다. 해부 단계 사이에 SAM에 물 방울을 자주 적용하면 이 문제가 발생하지 않습니다.
이 절차의 제한은 ablated 영역에 대한 실제 제어가 없다는 것입니다. 이것은 다른 조건 및 유전자형에서 생기는 변경을 비교에 있는 문제점입니다. 따라서 비교를 위해 유사한 방식으로 어설픈 제어 SAM을 사용해야 합니다. 또 다른 대안은 펄스 자외선레이저(20)를사용하여 보다 제어된 절제를 수행하는 것이다. 또한 절제는 기계적 특성에 변화를 일으키기 위해 널리 알려져 있지만, 또한 상처 유발 반응과 어느 정도 연관된다. 이러한 이유로, 기계적 압축 및 터고 유도 된 동요와 같은 다른 접근 방식은 관측6,9를확인하기 위해 수행되어야한다.
기계력을 조작하는 다른 방법에 비해 이 방법의 중요한 장점은 매우 기본적인 도구를 사용하지만 미세 수염 반응의 강력한 판독을 제공한다는 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
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