Summary
Aquí describimos un protocolo para la toma de imágenes de células vivas del citoesqueleto de microtúbulo cortical en el brote de meristem apical y el seguimiento de su respuesta a los cambios en las fuerzas físicas.
Abstract
Comprender la regulación a nivel celular y tisular del crecimiento y la morfogénesis ha estado a la vanguardia de la investigación biológica durante muchas décadas. Los avances en tecnologías moleculares y de imagen nos permitieron obtener información sobre cómo las señales bioquímicas influyen en los eventos morfogenéticos. Sin embargo, es cada vez más evidente que aparte de las señales bioquímicas, las señales mecánicas también afectan a varios aspectos del crecimiento celular y tisular. El arabidopsis shoot apical meristem (SAM) es una estructura en forma de cúpula responsable de la generación de todos los órganos sobre el suelo. La organización del citoesqueleto de microtúbulo cortical que media la deposición de celulosa apoplástica en las células vegetales es espacialmente distinta. La visualización y evaluación cuantitativa de patrones de microtúbulos corticales son necesarias para comprender la naturaleza biofísica de las células en el SAM, ya que la celulosa es el componente más rígido de la pared celular de la planta. La forma estereotipada de la organización de microtúbulos corticales también es una consecuencia de las fuerzas físicas de todo el tejido existentes en el SAM. La perturbación de estas fuerzas físicas y el posterior seguimiento de la organización de microtúbulos corticales permite la identificación de proteínas candidatas implicadas en la mediación de la mecano-percepción y transducción. Aquí describimos un protocolo que ayuda a investigar tales procesos.
Introduction
Las células vegetales están rodeadas por una matriz extracelular de polisacáridos y glicoproteínas que se asemeja mecánicamente a un material compuesto reforzado con fibra capaz de cambiar dinámicamente sus propiedades mecánicas1. El crecimiento de las células vegetales es impulsado por la absorción de agua en la célula, lo que resulta en una acumulación concomitante de fuerzas de tracción en la pared celular. En respuesta a tales fuerzas, las modificaciones en el estado físico de la pared celular permiten la expansión de la célula. Las células con paredes primarias son capaces de experimentar un crecimiento rápido en comparación con la pared celular secundaria que contiene células principalmente debido a las diferencias en la composición química de los polisacáridos en su interior. Las células de la pared primaria se componen de celulosa, hemicelulosa y pectina además de glicoproteínas, y carecen de lignina, un componente que está presente en la pared celular secundaria2. La celulosa, un polímero de glucosa unido a través de enlaces β-1,4, es el componente principal de las paredes celulares. Se organiza en estructuras fibrilares que son capaces de soportar las fuerzas de alta tracción experimentadas durante el crecimiento celular3. Además de soportar las fuerzas de tracción, el refuerzo mecánico a lo largo de una dirección preferencial da como resultado una expansión impulsada por el turgor a lo largo de un eje perpendicular a la orientación neta de la microfibrilla de celulosa. La organización de las microfibrillas de celulosa está influenciada por el citoesqueleto de microtúbulo cortical, ya que guían el movimiento direccional de los complejos de celulosa-sintetización situados en la membrana plasmática4. Por lo tanto, el monitoreo de la organización de microtúbulos corticales utilizando una proteína o tubulina asociada a microtúbulos fusionada con una molécula fluorescente sirve como un proxy para la observación de patrones excesivos de celulosa en las células vegetales.
El patrón del citoesqueleto de microtúbulo cortical está bajo el control de las fuerzas mecánicas derivadas de la morfología celular y tisular. La organización de microtúbulos corticales no tiene ninguna organización preferencial a lo largo del tiempo en las células situadas en el ápice del SAM, mientras que las células de la periferia y el límite entre el SAM y el órgano emergente tienen una matriz supracelular estable y altamente organizada de microtúbulos corticales5. Se han desarrollado varios enfoques para perturbar físicamente el estado mecánico de las células. Los cambios en el estado osmótico, así como el tratamiento con compuestos farmacológicos y enzimáticos que influyen en la rigidez de la pared celular pueden dar lugar a cambios posteriores en las fuerzas de tracción experimentadas por la célula6,7. El uso de artilugios que permitan el aumento gradual de las fuerzas de compresión experimentadas por los tejidos es otra alternativa8. También se ha demostrado que la aplicación de fuerzas centrífugas influye en las fuerzas mecánicas sin ningún contacto físico con las células9. Sin embargo, los medios más utilizados para cambiar las fuerzas direccionales en un grupo de células aprovechan el hecho de que todas las células epidérmicas están bajo tensión y la ablación física de las células eliminará la presión del turgor localmente, así como la alteración de la adhesión de célula a célula, modificando así las fuerzas de tracción experimentadas por las células vecinas. Esto se realiza ya sea apuntando a un láser ultravioleta pulsado de alta potencia o por medio de una aguja fina.
Aquí profundizamos en el proceso de toma de imágenes y evaluación del comportamiento de los microtúbulos corticales para la perturbación mecánica en el SAM.
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Protocol
1. Crecimiento de la planta
- Cerda semillas de Arabidopsis que expresan el dominio de unión a microtúbulos fusionado con proteína fluorescente verde (MBD-GFP)10 en el suelo y mantener en largo día (16 h día /8 h noche), condiciones de 20 oC/6 oC durante 1 semana para la germinación.
- Después de la germinación, transfiera las plántulas a nuevas macetas con suficiente espacio de crecimiento para permitir un crecimiento vegetativo robusto. Mantener las plantas en día corto (8 h día /16 h noche), 20 oC/16 oC condiciones durante 3-5 semanas.
- Transferir las plantas a un día largo (16 h día /8 h noche), condiciones de 20 oC/16 oC y mantener hasta que las plantas se atornillen (2-3 semanas). Deje que la inflorescencia crezca hasta 2-5 cm de largo.
2. Preparación media
- Preparar los platos diseccionados llenando pequeños platos de Petri (aproximadamente 5,5 cm de ancho, 1,5 cm de profundidad) a aproximadamente la mitad de su profundidad con 2% de agarosa. Los platos diseccionados también se pueden utilizar para imágenes de punto de tiempo único.
- Preparar el medio de crecimiento.
- Preparar 50 ml de una solución de 1.000x de vitaminas con 5 g de myo-inositol, 0,05 g de ácido nicotínico, 0,05 g de clorhidrato de piridoxina, 0,5 g de clorhidrato de tiamina y 0,1 g de glicina.
- Preparar el medio de crecimiento, compuesto por 1/2 Murashige y Skoog medio, 1% sacarosa, 1,6% de agar, 1x vitaminas, pH a 5,8. Autoclave y dejar que se enfríe.
- En un banco estéril y limpio, esteriliza las cajas de plástico con bisagras (aproximadamente 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) sumergiendo en etanol al 70% durante 15 min.
- En un banco estéril y limpio, una vez que el medio esté a calor soportable, agregue N6-benzyladenine a una concentración final de 200 nM, y 1/1,000 PPM (mezcla conservante vegetal) y mezcle bien. Llene las cajas estériles hasta aproximadamente la mitad de su profundidad con el medio.
3. Disección del SAM
- Cortar la inflorescencia y eliminar los brotes de flores más antiguos con fórceps afilados pelando las flores en la base de los pedúnculos hasta que sea difícil verlos a simple vista.
- Crea una hendidura en la agaria en el plato diseccionado con fórceps y planta la base de inflorescencia en el agar grueso. Esto proporciona un buen soporte sólido para una mayor disección fina de flores más jóvenes para exponer el SAM.
- Retire los cogollos de flores restantes empujándolos hacia abajo con los fórceps comenzando con los más antiguos y avanzando secuencialmente a las etapas más jóvenes bajo un microscopio diseccionante hasta que el SAM sea visible. El SAM generalmente se expone cuando se retiran flores más viejas hasta la etapa 6 a 7. Una vez expuesto el SAM, evite la deshidratación de la muestra moviéndose rápidamente al siguiente paso.
4. Transferencia y crecimiento de SAM cultivados
- Plantar la muestra recién diseccionada como se detalla en la sección 1 en el medio de crecimiento en la caja de cultivo con bisagras de plástico rectangular con el SAM justo expuesto por encima de la superficie media. Agregue unas gotas de agua estéril desionizada a los bordes de las cajas de cultivo y cierre la tapa para mantener la humedad dentro de la caja. Asegúrese de que el agua añadida no cubra el SAM.
- Cierre la tapa y envuelva la caja con cinta adhesiva de microprés. Colocar la caja de crecimiento en condiciones de día largo o continuo a 22oC y crecer durante 12-24 h para permitir que el SAM se recupere del procedimiento de disección y se adapte a las condiciones de cultivo.
5. Imágenes del SAM
- Llene la caja de cultivo que contiene el SAM con agua desionizada estéril para cubrir la muestra. Compruebe bajo el microscopio de disección y retire cualquier burbuja de aire pulverizando con fuerza el agua dirigida a la muestra con una pipeta de 1 ml.
- Coloque la caja de cultivo en una etapa vertical del microscopio confocal. Tenga cuidado de que la caja de cultivo no se ponga en contacto con los objetivos del microscopio. Utilice una lente de inmersión de agua de larga distancia de 40x o 60x de apertura numérica 0.8-1 que sea óptima para la toma de imágenes sin un cristal de cubierta.
- Baje el objetivo en el agua y compruebe si hay burbujas de aire formadas en la lente frontal del objetivo. Retire cualquier burbuja bajando el escenario y limpiando suavemente la lente con un tejido óptico y añadiendo una pequeña cantidad de agua a la lente frontal del objetivo con una pipeta Pasteur antes de reimmersionar al agua.
- Con el filtro GFP y el módulo de epi-iluminación del microscopio confocal, ajuste el controlador XY para localizar la muestra. Ajustando la posición de los oculares, coloque el SAM directamente debajo de la fuente de luz y enfoque a lo largo del eje Z hasta que se encuentre el ápice.
NOTA: No mire directamente a la luz ultravioleta. - Una vez encontrada la muestra, iluminízla usando un láser capaz de hacer una GFP emocionante (es decir, una fuente láser de 488 nm o 496 nm). Ajuste el zoom óptico del microscopio para que todo el SAM y la etapa 1 primordia floral estén en el campo de visión. Ajuste aún más la potencia de la salida láser y los ajustes de ganancia para garantizar una relación señal-ruido óptima.
NOTA: La alta intensidad del láser dará lugar al blanqueo fotográfico de la muestra. La paleta de subexposición y sobreexposición ayuda a garantizar un mejor ajuste de estos ajustes. - Deje que la muestra se asiente durante 2-5 min. Adquiera pilas Z confocales de la muestra a intervalos de rodajas Z de 0,25 m-0,5 m a una resolución de aproximadamente 0,3 m de tamaño de píxel. Asegúrese de que el tiempo total de imágenes necesario para adquirir pilas Z para una muestra no exceda de 10 minutos desde el momento en que la muestra se sumerge en agua hasta la finalización de la adquisición.
- Retire inmediatamente el agua y transfiera la caja de cultivo de vuelta a la cámara de crecimiento. Mantener las muestras durante mucho tiempo bajo el agua influirá en el estado osmótico de las células.
6. Perturbación micromecánica del SAM
- Configure las condiciones de imagen como se describe en la sección 5 y adquiera pilas de imágenes de preablación de la organización de microtúbulos corticales.
- Decantar el agua en el plato de cultivo. Realice la ablación con una aguja de jeringa limpia (0,4 mm x 20 mm).
- Con un microscopio de disección, sostenga cuidadosamente la aguja y acérquese lentamente al SAM.
NOTA: La respiración y el manejo de la aguja con un agarre relajado ayudan a evitar el temblor. - Póngase en contacto brevemente con la cúpula de SAM con la punta de la aguja para confirmar que la ablación está hecha. Preferiblemente realizar la ablación en la periferia del SAM, que permite la visualización del comportamiento y la transición de microtúbulos corticales no organizados en la región central de la cúpula.
- Con un microscopio de disección, sostenga cuidadosamente la aguja y acérquese lentamente al SAM.
- Rellene el plato de cultivo con agua estéril desionizada y añada propidium idodide (10 g/ml). Además de monitorear la señal de microtúbulo cortical GFP, visualizar el yoduro propidium utilizando un canal separado puede marcar claramente las regiones de las células abladas. El yoduro de propídium se ilumina utilizando el 561 nm o cualquier otro láser adecuado con emisión registrada entre 600-650 nm.
- Adquiera pilas de imágenes justo después de la ablación (ver sección 6) y repita el proceso de adquisición cada 2 h durante un período de 6 h. Devuelva el plato de cultivo junto con la muestra a la cámara de incubación después de cada punto de tiempo. Asegúrese de que quede algo de agua en los medios de cultivo y envuelva el plato de cultivo con cinta adhesiva de micropore para evitar la desicación.
7. Visualización y cuantificación de datos
- Genere proyecciones de superficie utilizando software de libre acceso como MORPHOGRAPHX11,FIJI12o macro SurfCut13.
- Realizar la extracción de anisotropía de microtúbulo cortical utilizando FibrilTool14 macro en FIJI.
NOTA: Los protocolos detallados para el uso del software se pueden obtener de las respectivas citas.
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Representative Results
La Figura 1 muestra imágenes de proyección típicas obtenidas de líneas MBD-GFP con celdas en el centro de la cúpula que contienen microtúbulos corticales desorganizados, y celdas en la periferia que tienen una distribución circunferencial (Figura 1A,B), mientras que las celdas de dominio de límite contienen microtúbulos corticales alineados paralelos al eje largo de la célula. Estas observaciones muestran diferencias en la distribución espacial de los microtúbulos corticales en los diferentes dominios del SAM. Las imágenes de lapso de tiempo mostraron que la alineación de los microtúbulos corticales cambiaba de una matriz altamente desordenada a una matriz más organizada dentro de las 6 h de ablación (Figura 1C,D). Los tensores generados con FibrilTool podrían superponerse a la imagen cortical de los microtúbulos. Un tensor más largo representaba un mayor grado de anisotropía. Los tensores también mostraron el eje principal de alineación de los microtúbulos corticales. La información extraída se puede representar mediante la maceta de la anisotropía media a lo largo del tiempo (Figura 1E)15. Se recomienda un tamaño de muestra de cuatro a cinco por tratamiento o genotipo que se debe probar. Los resultados mostraron un aumento gradual de la anisotropía de microtúbulos corticales en un período de 6 h y nos permitieron concluir que la modulación a la mecánica del SAM da lugar a cambios simultáneos en la organización de microtúbulos corticales.
Figura 1: Ejemplo de resultado de la cuantificación de la anisotropía de microtúbulo cortical y la ablación mecánica en Arabidopsis SAM. (A) Proyección de superficie de 35S: pilas MBD-GFP SAM Z. (B) Tensores nemáticos en rojo que muestran anisotropía de microtúbulo cortical de celdas segmentadas manualmente en el dominio central y límite. (C,D). Proyecciones superficiales de datos de lapso de tiempo de microtúbulo cortical de un experimento de ablación. (D) Imágenes magnificadas de (C) que muestran realineación de microtúbulos corticales cerca del sitio de ablación (asterisco rojo) superpuestas con información de tensor nemático de celdas individuales. (E) La anisotropía de microtúbulo cortical cambió después de la ablación de 0-6 h, cuantificada desde la región de tensor nemático etiquetada en C con el círculo que representa el valor medio y las barras que indican el intervalo de confianza del 95%. Barras de escala a 25 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La evaluación de los eventos de transducción de señales mecánicas es crucial para identificar los reguladores moleculares involucrados en las vías de mecanoso-percepción y transducción. El protocolo descrito aquí proporciona una visión cuantitativa de tales eventos utilizando la respuesta de microtúbulo cortical como lectura para dicho proceso en los SAM de Arabidopsis. El procedimiento descrito aquí se utiliza habitualmente en varios estudios en diversos tipos de tejidos16,17,18,19. Se observa un aumento significativo de la anisotropía de microtúbulos en el rango de 4 h en todos los tipos de tejidos.
El paso más crítico en el protocolo es asegurar que las alteraciones en los microtúbulos no se produzcan debido a la inmersión prolongada en el agua, porque el agua por sí sola resulta en un aumento de la presión turgorí de las células. Por lo tanto, el tiempo de imagen debe minimizarse. Esto puede comprometer la resolución de la imagen, pero proporciona una lectura más precisa de los resultados de perturbación. El segundo paso más crucial es la disección cuidadosa del SAM. Debido a su tamaño muy pequeño, es muy probable que se dañe durante el procedimiento. Los órganos se vuelven más difíciles de extirpar si los pedúnculos de los órganos más antiguos no se extraen por completo. Por último, durante la disección no se debe permitir que la muestra se seque debido a la exposición prolongada al aire del SAM. Esto es especialmente común cuando se manipulan SAM mutantes de difícil acceso o que tienen un diámetro inferior a 50 m. La aplicación frecuente de las gotas de agua en el SAM entre los pasos de la disección previene este problema.
Una limitación de este procedimiento es que no hay un control real sobre el área ablada. Este es un problema en la comparación de los cambios que ocurren en diferentes condiciones y genotipos. Por lo tanto, es necesario utilizar SAM de control perturbados de una manera similar para la comparación. Otra alternativa es realizar una ablación más controlada utilizando un láser ultravioleta pulsado20. Además, mientras que la ablación es ampliamente conocida para crear cambios en las propiedades mecánicas, también se asocia en cierto grado con respuestas inducidas por heridas. Por esta razón, es necesario realizar otros enfoques, como la compresión mecánica y las perturbaciones inducidas por turgor para confirmar las observaciones6,9.
Una ventaja significativa de este método en comparación con otras formas de manipular las fuerzas mecánicas es que utiliza herramientas muy básicas pero proporciona una lectura robusta de la respuesta de microtúbulos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
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