Summary
Här beskriver vi ett protokoll för levande cell imaging av den kortikala microtubule cytoskeleton vid skjuta apikala meristem och övervakning dess svar på förändringar i fysiska krafter.
Abstract
Förstå cell-och vävnadsnivå reglering av tillväxt och morfogenes har varit i spetsen för biologisk forskning i många decennier. Framsteg inom molekylär- och bildteknik gjorde det möjligt för oss att få insikter i hur biokemiska signaler påverkar morfogetiska händelser. Det är dock allt tydligare att bortsett från biokemiska signaler, mekaniska ledtrådar också påverka flera aspekter av cell-och vävnadstillväxt. Arabidopsisen skjuter apikal meristem (SAM) är en kupol-formad struktur ansvarig för generation av alla ovan jord organ. Organisationen av den kortikala mikrotubuli cytoskelett som förmedlar apoplastiskt cellulosa nedfall i växtceller är rumsligt distinkt. Visualisering och kvantitativ bedömning av mönster av när mikrotubuli är nödvändiga för att förstå biofysiska karaktär av celler vid SAM, som cellulosa är den styvaste komponenten i anläggningen cellväggen. Den stereotypa formen av när mikrotubuli organisation är också en följd av vävnadsomfattande fysiska krafter som finns vid SAM. Perturbation av dessa fysiska krafter och efterföljande övervakning av när mikrotubuli organisation möjliggör identifiering av kandidat proteiner som deltar i medla mechano-perception och transduktion. Här beskriver vi ett protokoll som hjälper till att undersöka sådana processer.
Introduction
Växtceller omges av en extracellulär matris av polysackarider och glykoproteiner som mekaniskt liknar ett fiberförstärkta kompositmaterial som kan dynamiskt ändra dess mekaniska egenskaper1. Tillväxt i växtceller drivs av upptaget av vatten i cellen, vilket resulterar i en samtidig uppbyggd av dragkrafter på cellväggen. Som svar på sådana krafter möjliggör modifieringar av cellväggens fysiska tillstånd cellexpansion. Celler med primära väggar är kapabla att genomgå snabb tillväxt jämfört med sekundär cellvägg som innehåller celler främst på grund av skillnader i den kemiska sammansättningen av polysackarider inom. Primära väggceller är sammansatta av cellulosa, hemicellulosa, och pektin förutom glykoproteiner, och saknar lignin, en komponent som finns i den sekundäracellväggen 2. Cellulosa, en glukospolymer som är β-1,4 obligationer, är den viktigaste komponenten i cellväggarna. Den är organiserad i fibrillarstrukturer som klarar av att motstå höga dragkrafter som upplevs under celltillväxt3. Förutom att motstå dragkrafter, mekanisk förstärkning längs en förmånsvis riktning resulterar i turgor-driven expansion längs en axel vinkelrätt mot netto orientering av cellulosa microfibril. Organisationen av cellulosa mikrofibriller påverkas av den kortikala mikrotubulicytoskeletten, eftersom de styr riktningsrörelsen för de cellulosa-syntetiserande komplex som ligger vid plasmamembranet4. Därför, övervakning när mikrotubuli organisation med hjälp av en microtubule-associerade protein eller tubulin smält med en fluorescerande molekyl fungerar därför som en proxy för observation av överlyckliga mönster av cellulosa i växtceller.
Mönstningen av den kortikala mikrotubulicytoskeletten är under kontroll av cell- och vävnadsmorfologi härledda mekaniska krafter. Kortikala mikrotubuli organisation har inte någon förmånlig organisation över tiden i celler som ligger vid spetsen av SAM, medan celler i periferin och gränsen mellan SAM och det framväxande organet har en stabil, mycket organiserad överstatlig array av kortikala mikrotubuli5. Flera tillvägagångssätt har utvecklats för att fysiskt perturb den mekaniska status av cellerna. Förändringar av osmotisk status, samt behandling med farmakologiska och enzymatiska föreningar som påverkar styvheten i cellväggen kan resultera i efterföljande förändringar i de dragkrafter som upplevs avcellen 6,7. Användningen av contraptions som möjliggör den gradvisa ökningen av tryckkrafter upplevs av vävnader är ett annat alternativ8. Applicering av centrifugalkrafter har också visat sig påverka de mekaniska krafterna utan någon fysisk kontakt med cellerna9. Men de mest använda sätten att ändra riktningskrafter i en grupp celler dra nytta av det faktum att alla epidermal celler är under spänning och fysisk ablation av celler kommer att eliminera turgor tryck lokalt samt störa cell-till-cell adhesion, och därmed modifiera de dragkrafter upplevs av de angränsande cellerna. Detta utförs antingen genom att rikta en kraftfull pulsad ultraviolett laser eller med hjälp av en fin nål.
Här utvecklar vi på processen för bildbehandling och bedöma kortikalt mikrotubuli beteende för mekanisk perturbation vid SAM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Växttillväxt
- Sugga Arabidopsis frön uttrycker mikrotubuli bindande domän smält med grön fluorescerande protein (MBD-GFP)10 på jord och hålla i långa dag (16 h dag / 8 h natt), 20 °C/6 °C villkor för 1 vecka för groning.
- Efter groning, överför plantor till nya krukor med tillräckligt tillväxtutrymme för att möjliggöra robust vegetativ tillväxt. Håll växter i kort dag (8 h dag / 16 h natt), 20 °C/16 °C villkor för 3-5 veckor.
- Överför växter till lång dag (16 h dag /8 h natt), 20 °C/16 °C villkor och hålla tills växter bult (2-3 veckor). Låt blomställningen bli upp till 2-5 cm lång.
2. Medelhög förberedelse
- Förbered de dissekerande rätterna genom att fylla små petriskålar (cirka 5,5 cm breda, 1,5 cm djupa) till ungefär hälften av sitt djup med 2 % agaros. Den dissekera rätter kan också användas för enda tid punkt bildbehandling.
- Förbered tillväxtmediet.
- Bered 50 mL av en 1,000x vitamin stamlösning med 5 g av myo-inositol, 0,05 g nikotinsyra, 0,05 g pyridoxinhydroklorid, 0,5 g tiaminhydroklorid, och 0,1 g glycin.
- Förbered tillväxtmediet, sammansatt av 1/2 Murashige och Skoog medium, 1% sackaros, 1,6% agar, 1x vitaminer, pH = 5,8. Autoklav och låt den svalna.
- På en steril, ren bänk, sterilisera gångjärn plastlådor (ca 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) genom att puttra i 70% etanol i 15 min.
- På en steril, ren bänk, när mediet är på uthärdlig värme, tillsätt N6-benzyladenin till en slutlig koncentration av 200 nM, och 1/1,000 PPM (växt konserveringsmedel blandning) och blanda väl. Fyll de sterila lådorna till ungefär hälften av deras djup med mediet.
3. Dissekering av SAM
- Skär blomställningen och ta bort de äldre blomknopparna med vassa tuts med hjälp av flagningar av blommorna vid basen av peduncles tills det är svårt att se dem med blotta ögat.
- Skapa en slits i agarose i dissekering skålen med tärna och plantera blomställning bas i den tjocka agar. Detta ger bra fast stöd för ytterligare fina dissekering av yngre blommor för att exponera SAM.
- Ta bort de återstående blomknopparna genom att trycka ner dem med tänjarna som börjar med den äldsta och sekventiellt framåt till de yngre stadierna under ett dissekerande mikroskop tills SAM är synligt. SAM är oftast utsätts när äldre blommor upp till steg 6 till 7 tas bort. När SAM är utsatt, undvika uttorkning av provet genom att gå snabbt till nästa steg.
4. Överföring och tillväxt av odlade SAMs
- Plantera det nyligen dissekerade provet som detaljerat i avsnitt 1 i tillväxtmediet i den rektangulära plastgångjärnsförsedda odlingslådan med SAM bara exponerad ovanför medelytan. Tillsätt några droppar sterilt avjoniserat vatten till kanterna på odlingslådorna och stäng locket för att bibehålla luftfuktigheten inuti lådan. Se till att det tillsatta vattnet inte täcker SAM.
- Stäng locket och linda in lådan med mikroporstejp. Placera tillväxtlådan i långa dagar eller kontinuerliga dagförhållanden vid 22 °C och väx under 12-24 h för att SAM ska kunna återhämta sig från dissekeringsproceduren och anpassa sig till odlingsförhållandena.
5. Bildframställning av SAM
- Fyll odlingslådan som innehåller SAM med sterilt avjoniserat vatten för att täcka provet. Kontrollera under det dissekerande mikroskopet och avlägsna eventuella luftbubblor genom att med kraft spruta vatten riktat mot provet med en 1 mL-pipett.
- Placera odlingslådan på en upprätt konfokalmikroskopstadium. Var försiktig så att kulturlådan inte kontaktar mikroskopmålen. Använd en långdistans 40x eller 60x vattendoppningslins av numerisk bländare 0,8-1 som är optimal för bildtagning utan täckglas.
- Sänk målet i vattnet och kontrollera om luftbubblor bildas på målets främre lins. Ta bort eventuella bubblor genom att sänka scenen och försiktigt torka linsen med en optisk vävnad och lägga till en liten mängd vatten till den främre linsen av målet med en Pasteur pipett innan återsänkning i vattnet.
- Med hjälp av GFP-filtret och epi-belysningsmodulen i konfokalmikroskopet justerar du XY-styrenheten för att lokalisera provet. Justera läget för okulär, lägg SAM direkt under ljuskällan och fokus längs Z-axeln tills apexet är placerad.
OBS: Titta inte direkt på ultraviolett ljus. - När provet är hittat, belysa den med hjälp av en laser som kan spännande GFP (dvs. en 488 nm eller 496 nm laserkälla). Justera mikroskopets optiska zoom så att hela SAM och scenen 1 blommiga primordia är i synfältet. Justera laserutgångens effekt ytterligare och förstärkningsinställningarna för att säkerställa optimalt signal-brusförhållande.
OBS: Laserns höga intensitet kommer att resultera i fotoblekning av provet. Under- och överexponeringspaletten bidrar till att säkerställa bättre justering av dessa inställningar. - Låt provet slå sig ner i 2-5 min. Anskaffa konfokala Z-stackar av provet med 0,25 μm-0,5 μm Z-segmentsintervall med en upplösning på ungefär 0,3 μm pixelstorlek. Se till att den totala bildtid som krävs för att förvärva Z-stackar för ett prov inte överstiger 10 min från det att provet sänks ned i vatten fram till slutförandet av förvärvet.
- Omedelbart ta bort vattnet och överföra kulturlådan tillbaka till tillväxtkammaren. Att hålla proverna under lång tid under vatten kommer att påverka cellernas osmotiska status.
6. Mikromekanisk perturbation av SAM
- Ställa in bildframställning villkor som beskrivs i avsnitt 5 och skaffa preablation bild stackar av när mikrotubuli organisation.
- Dekantera vattnet i kulturrätten. Utför ablationen med en ren sprutnål (0,4 mm x 20 mm).
- Med hjälp av ett dissekerande mikroskop, håll försiktigt nålen och närma dig långsamt SAM.
OBS: Andan håller och hanterar nålen med ett avslappnat grepp hjälper till att undvika skakningar. - Kort kontakta SAM-kupolen med nålspetsen för att bekräfta att ablationen är gjord. Helst utföra ablation på periferin av SAM, som möjliggör visualisering av beteende och övergång av oorganiserade när mikrotubuli i den centrala regionen av kupolen.
- Med hjälp av ett dissekerande mikroskop, håll försiktigt nålen och närma dig långsamt SAM.
- Fyll på odlingsfatet med sterilt avjoniserat vatten och tillsätt propidium idodide (10 μg/mL). Förutom att övervaka GFP när mikrotubulisignal, visualisera propidiumodid med hjälp av en separat kanal kan tydligt markera regioner av ablated celler. Propidium-iodid belyses med hjälp av 561 nm eller någon annan lämplig laser med utsläpp som registrerats mellan 600-650 nm.
- Förvärva bildstaplar direkt efter ablation (se avsnitt 6) och upprepa förvärvsprocessen var 2 h under en period av 6 h. Returnera odlingsfatet tillsammans med provet i inkubationskammaren efter varje tidspunkt. Se till att det finns lite vatten kvar på kulturmedia och linda kulturskålen med mikroporstejp för att förhindra uttorkning.
7. Datavisualisering och kvantifiering
- Generera ytprojektioner med hjälp av fritt tillgänglig programvara som MORPHOGRAPHX11, FIJI12, eller makro SurfCut13.
- Utför utvinning av kortikal mikrotubuli anisotropi med hjälp av FibrilTool14 makro i FIJI.
OBS: Detaljerade protokoll för användning av programvara kan erhållas från respektive citeringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bild 1 visar typiska projektionsbilder som erhållits från MBD-GFP-linjer med celler i mitten av kupolen som innehåller oorganiserade när mikrotubuli och celler i periferin som har en cirkumferential fördelning (Figur 1A,B), medan gränsdomänens celler innehåller när mikrotubuler som är inriktade parallellt med cellens långa axel. Dessa observationer visar skillnader i den rumsliga fördelningen av när mikrotubuli i de olika domänerna av SAM. Time lapse imaging visade när mikrotubuli anpassning ändras från en mycket oordnad array till en mer organiserad array inom 6 h av ablation (Figur 1C,D). Tensorerna som genereras med FibrilTool kan läggas ovanpå den kortikala mikrotubulibilden. En längre tensor representerade en högre grad av anisotropi. Tensorerna visade också den stora axeln av anpassning av när mikrotubuli. Den extraherade informationen kan representeras genom att den genomsnittliga anisotropin krutsar över tiden (figur 1E)15. En provstorlek på fyra till fem rekommenderas per behandling eller genotyp som måste testas. Resultaten visade en gradvis ökning av när mikrotubuli anisotropi inom en period av 6 h och tillät oss att dra slutsatsen att modulering till mekanik av SAM resulterar i samtidiga förändringar i när mikrotubuli organisation.
Figur 1: Exempelresultat av kortikala mikrotubulianisotropikvantifiering och mekanisk ablation i Arabidopsis SAM. (A) Ytprojektion av 35S: MBD-GFP SAM Z-staplar. (B) Nematiska tensors i rött som visar kortikal mikrotubulianisotropi av manuellt segmenterade celler i den centrala och gränsdomänen. (C,D). Ytprojektioner av kortikala mikrotubulitid förfaller data från ett ablationsexperiment. (D) Förstorade bilder från (C) som visar när mikrotubuli omjustering nära platsen för ablation (röd asterisk) överlagrad med nematic tensor information av enskilda celler. (E) Kortikal mikrotubuli anisotropi förändrats efter ablation från 0-6 h, kvantifieras från nematic tensor märkt region i C med cirkeln som representerar medelvärdet och staplarna som anger 95% konfidensintervall. Skala barer = 25 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bedömningen av mekaniska signaltransduktionshändelser är avgörande för att identifiera molekylära regulatorer som är involverade i mekanosuppfattningen och transduktionsvägarna. Protokollet som beskrivs här ger en kvantitativ vy av sådana händelser genom att använda svaret för när mikrotubuli som en avläsning för en sådan process i Arabidopsis SAMs. Det förfarande som beskrivs här används rutinmässigt i flera studier i olika vävnadstyper16,17,18,19. En signifikant ökning av mikrotubuli anisotropi observeras i intervallet 4 h i alla vävnadstyper.
Det mest kritiska steget i protokollet är att se till att förändringar av mikrotubuli inte sker på grund av långvarig nedsänkelse i vatten, eftersom vatten på egen hand resulterar i en ökning av cellernas turgor tryck. Därför ska avbildningstiden minimeras. Detta kan äventyra bildupplösningen, men det ger en mer exakt avläsning av perturbationresultaten. Det näst mest avgörande steget är noggrann dissekering av SAM. På grund av sin mycket ringa storlek är det mycket sannolikt att skadas under förfarandet. Organen blir svårare att ta bort om de äldre organens pedunler inte helt avlägsnas. Slutligen, under dissekering provet inte bör tillåtas att torka ut på grund av långvarig luftexponering av SAM. Detta är särskilt vanligt vid hantering av muterade SAMs som är svåra att komma åt eller som är mindre än 50 μm i diameter. Frekvent applicering av vattendroppar på SAM mellan dissektionsstegen förhindrar det här problemet.
En begränsning av detta förfarande är att det inte finns någon verklig kontroll över det ablated området. Detta är ett problem i att jämföra förändringar som sker i olika förhållanden och genotyper. Därför är det nödvändigt att använda kontroll-SAMs störd på ett liknande sätt för jämförelse. Ett annat alternativ är att utföra en mer kontrollerad ablation med hjälp av en pulsad ultraviolett laser20. Dessutom, medan ablation är allmänt känt för att skapa förändringar i mekaniska egenskaper, det är också förknippat med en viss grad med sår-inducerad svar. Av denna anledning måste andra tillvägagångssätt, såsom mekanisk kompression och turgor-inducerad störingsfall utföras för att bekräftaobservationerna 6,9.
En betydande fördel med denna metod jämfört med andra sätt att manipulera mekaniska krafter är att den använder mycket grundläggande verktyg ännu ger en robust avläsning av mikrotubuli svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| micropore tape | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019 | ||
| myo-inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-benzyladenine | Sigma | B3408 | |
| nicotinic acid | Sigma | N4126 | |
| plastic hinged box | Electron microscopy sciences | 64312 | |
| PPM (Plant Preservative Mixture) | Plant Cell Technology | PPM | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| pyridoxine hydrochloride | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| thiamine hydrochloride | Sigma | T4625 |
References
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).
- Burgert, I. Exploring the micromechanical design of plant cell walls. American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).
- Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules. Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Kierzkowski, D., et al. Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem. Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).
- Heisler, M. G., et al. Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport. PLoS Biology. 8 (10), e1000516 (2010).
- Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline. Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).
- Nakayama, N., et al. Mechanical regulation of auxin-mediated growth. Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).
- Marc, J., et al. A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells. Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).
- Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX. Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks. BMC Biology. 17 (1), 38 (2019).
- Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), (2019).
- Hervieux, N., et al. A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis. Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).
- Sampathkumar, A., et al. Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells. Elife. 3, e01967 (2014).
- Sampathkumar, A., et al. Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth. Development. 146 (10), dev179036 (2019).
- Uyttewaal, M., et al. Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis. Cell. 149 (2), 439-451 (2012).
- Hamant, O., et al. Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis. Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).
