माउस कॉर्निया और कंजक्टिवा की लाइव इमेजिंग के लिए एक कस्टम मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी प्लेटफॉर्म
Summary
यहां प्रस्तुत लाइव माउस ऑक्यूलर सरफेस इमेजिंग के लिए एक मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपिक प्लेटफॉर्म है। फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक माउस नेत्र सतह के भीतर कोशिका नाभिक, कोशिका झिल्ली, तंत्रिका फाइबर और केशिकाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है। कोलेजनस संरचनाओं से प्राप्त गैर-रैखिक दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी के संकेत स्ट्रोमल आर्किटेक्चर के लिए लेबल-मुक्त इमेजिंग प्रदान करते हैं।
Abstract
पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण और सेल कल्चर सिस्टम वीवो शारीरिक और पैथोलॉजिकल गतिशीलता में पूरी तरह से अनुकरण करने के लिए अपर्याप्त हैं। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी (एमपीएम) वीवो में सेलुलर स्तरों पर जैव चिकित्सा अध्ययन के लिए सबसे लोकप्रिय इमेजिंग तौर-तरीकों में से एक बन गया है, लाभों में उच्च संकल्प, गहरे ऊतक प्रवेश और न्यूनतम फोटोटोक्सिसिटी शामिल हैं। हमने एक एमपीएम इमेजिंग प्लेटफॉर्म तैयार किया है जिसमें एक कस्टमाइज्ड माउस आई होल्डर और वीवो में इमेजिंग ऑक्यूलर सरफेस के लिए स्टीरियोटैक्सिक स्टेज है । दोहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर माउस नेत्र सतह के भीतर कोशिका नाभिक, कोशिका झिल्ली, तंत्रिका फाइबर और केशिकाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है। मल्टीफोटोन फ्लोरेसेंस संकेतों के अलावा, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) प्राप्त करना एक साथ कोलेजनस स्ट्रोमल वास्तुकला के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। इस मंच को कॉर्निया और कंजक्टिवा सहित पूरे नेत्र सतह में सटीक स्थिति के साथ इंट्राविटल इमेजिंग के लिए नियोजित किया जा सकता है।
Introduction
कॉर्निया और कंजक्टिवा सहित नेत्र सतह संरचनाएं बाहरी गड़बड़ी से अन्य गहरे नेत्र ऊतकों की रक्षा करती हैं। कॉर्निया, आंखों का पारदर्शी सामने का हिस्सा, आंखों में प्रकाश को निर्देशित करने और एक सुरक्षात्मक बाधा के रूप में अपवर्तक लेंस के रूप में कार्य करता है। कॉर्नियल एपिथेलियम कॉर्निया की सबसे बाहरी परत है और इसमें सतही कोशिकाओं, पंख कोशिकाओं और बेसल कोशिकाओं की अलग-अलग परतें होती हैं। कॉर्नियल स्ट्रोमा केराटोसाइट्स के साथ एम्बेडेड परिष्कृत रूप से पैक किए गए कोलेजनस लैमेले से बना है। कॉर्नियल एंडोथेलियम, फ्लैट हेक्सागोनल कोशिकाओं की एक परत, अपने पंपिंग कार्यों के माध्यम से अपेक्षाकृत निर्जलित राज्य में कॉर्निया स्ट्रोमा रखकर कॉर्निया की पारदर्शिता बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है1। लिम्बस कॉर्निया और कंजक्टिवा के बीच की सीमा बनाता है, और कॉर्नियल एपिथेलियल स्टेम सेल2का जलाशय है। अत्यधिक संवहनी संविवाह बलगम और आँसू का उत्पादन करके आंखों को चिकनाई करने में मदद करता है3.
कॉर्नियल सतह संरचनाओं की सेल गतिशीलता पारंपरिक रूप से या तो हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण या इन विट्रो सेल संस्कृति द्वारा अध्ययन की जाती है, जो वीवो सेल गतिशीलता में पर्याप्त रूप से अनुकरण नहीं कर सकती है। एक गैर आक्रामक लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण, इसलिए, इस तरह के अंतर को पाटने कर सकते हैं । इसके फायदों के कारण, जिसमें उच्च संकल्प, न्यूनतम फोटोडैमेज और गहरी इमेजिंग गहराई शामिल है, एमपीएम जैविक अनुसंधान,,4, 5,6,7,8के विविध क्षेत्रों में एक शक्तिशाली मोडलि मोडलि मोडल बन गया है।,5, कॉर्नियल इमेजिंग के लिए, एमपीएम इंट्रासेल्युलर एनएडी (पी)एच से प्राप्त आंतरिक ऑटोफ्लोरेसेंस से सेलुलर जानकारी प्रदान करता है। फेमटोसेकंड लेजर स्कैनिंग के तहत गैर-सेंट्रोमममेमसिक प्रकार I कोलेजन फाइबर से प्राप्त दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) संकेत अतिरिक्त धुंधला प्रक्रियाओं के बिना कोलेजनस स्ट्रोमल संरचनाएं प्रदान करता है9। पहले , हमने और अन्य समूहों ने पशु और मानव कॉर्निया 9 , 10 , 11 ,12,,,13,14,,15की इमेजिंगकेलिए एमपीएम का शोषण किया है ।1215
विशिष्ट कोशिका आबादी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रदर्शन करने वाली ट्रांसजेनिक माउस लाइनों का व्यापक रूप से सेल जीव विज्ञान में विभिन्न अध्ययनों के लिए उपयोग किया गया है, जिसमें विकास, ऊतक होमोस्टेसिस, ऊतक उत्थान और कार्सिनोजेनेसिस शामिल हैं। हमने एमपीएमद्वारा कॉर्निया9,10,बालों के रोम 10 और एपिडर्मिस10 के वीवो इमेजिंग में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किए गए ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों का उपयोग किया।, टीडीटोमाटो और ईजीएफपी के साथ टैग किए गए सेल न्यूक्लियस के साथ लेबल की गई कोशिका झिल्ली के साथ दोहरी फ्लोरोसेंट माउस तनाव दो माउस उपभेदों से पैदा होता है: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)। 26Sortm1Ytchn/J,#021847)16 और mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP,#007676)17। R26R-जीआर ट्रांसजेनिक माउस लाइन में एक दोहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर स्ट्रगल होता है, जिसमें एक एच2बी-ईजीएफपी फ्यूजन जीन और mCherry-GPI एंकर सिग्नल फ्यूजन जीन शामिल है, जो जीटी (रोजा) 26Sor लोकस में डाला गया है । MT-mG ट्रांसजेनिक तनाव एक सेल झिल्ली लक्षित tdTomato और EGFP फ्लोरोसेंट क्रे रिपोर्टर चूहों है । क्रे रीकॉम्बिनेशन से पहले, टीडीटोमा फ्लोरेसेंस अभिव्यक्ति के साथ कोशिका झिल्ली प्रोटीन विभिन्न कोशिकाओं में व्यापक रूप से मौजूद है। यह ट्रांसजेनिक माउस तनाव हमें क्रे उत्तेजन के बिना टीडीटोमाटो के साथ नाभिक-ईजीएफपी और झिल्ली की कल्पना करने में सक्षम बनाता है। प्रयोगों के लिए पर्याप्त चूहों का उत्पादन करने के लिए दो महिलाओं (R26R-GR+/+)और एक पुरुष (mT-mG+/+)ट्रांसजेनिक माउस को एक साथ पैदा किया गया था । इस अध्ययन में R26R-GR +/-;mT-mG+/-जीनोटाइप, दोहरी फ्लोरोसेंट चूहों के तनाव के साथ उनकी संतानों का उपयोग किया गया था ।+/- एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस लाइन के साथ तुलना में जैसा कि पहले9,,10वर्णित है, यह दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस तनाव हमें इमेजिंग समय के 50% कम अधिग्रहण के साथ प्रदान करता है।
इस काम में, हम अपने इमेजिंग प्लेटफॉर्म और दोहरे फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके कदम-दर-कदम तरीके से नेत्र सतह के वीवो इमेजिंग में एक विस्तृत तकनीकी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ इस कस्टम-निर्मित एमपीएम इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग माउस एपिथेलियल अंगों के इंट्राविटल इमेजिंग के लिए किया गया था, जिसमें त्वचा10,बाल कूप10 और नेत्र सतह<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, से अनुदान सहायता का शुक्रिया अदा करते हैं, 108-2628-बी-002-023, 108-2628-बी-002-023), नेशनल ताइवान यूनिवर्सिटी अस्पताल (NTUH108-T17) और चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल, ताइवान (सीएमआरपीजी3जी1621, सीएमआरपीजी3जी1623) ।
Materials
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36 | |
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
References
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