مخصص متعدد الصور المجهر منصة للتصوير الحي من القرنية ماوس وConjunctiva
Summary
هنا هو منصة مجهرية متعددة الصور للتصوير حية سطح العين الماوس. الماوس الفلوري المحورة تمكن من تصور نواة الخلية، أغشية الخلية، والألياف العصبية والشعيرات الدموية داخل سطح العين. توفر إشارات الجيل التوافقي الثاني غير الخطي المشتقة من الهياكل الكولاجينية تصويرًا خاليًا من التسمية لبنيات ال stromal.
Abstract
التحليل النسيجي التقليدي ونظم زراعة الخلايا غير كافية لمحاكاة في الحركية الفسيولوجية والمرضية تماما. أصبح المجهر متعدد الصور (MPM) واحدة من أكثر طرائق التصوير شعبية لدراسة الطب الحيوي في المستويات الخلوية في الجسم الحي، وتشمل مزايا عالية الدقة، اختراق الأنسجة العميقة والحد الأدنى من السمية الضوئية. لقد قمنا بتصميم منصة تصوير MPM مع حامل عين الماوس المخصصة ومرحلة ستيريو لسطح العين التصوير في الجسم الحي. يتيح الماوس ثنائي البروتين الفلوري تصور نواة الخلية وأغشية الخلايا والألياف العصبية والشعيرات الدموية داخل سطح العين. بالإضافة إلى إشارات الفلورس متعددة الصور، واكتساب الجيل التوافقي الثاني (SHG) يسمح في وقت واحد لتوصيف بنية السترومال الكولاجينية. يمكن استخدام هذه المنصة للتصوير داخل الرحم مع تحديد المواقع الدقيقة عبر سطح العين بأكمله، بما في ذلك القرنية والملتحمة.
Introduction
تحمي هياكل سطح العين، بما في ذلك القرنية والملتحمة، الأنسجة الأخرى الأعمق من الاضطرابات الخارجية. تعمل القرنية، الجزء الأمامي الشفاف للعين، كعدسة انكسارية لتوجيه الضوء إلى العين وكحاجز وقائي. ظهارة القرنية هي الطبقة الخارجية من القرنية وتتكون من طبقات متميزة من الخلايا السطحية وخلايا الجناح والخلايا القاعدية. يتكون القرنية ستروما من اللامي كولاجينوسي معبأة متطورة جزءا لا يتجزأ من القرنية. إن بطانة القرنية، وهي طبقة واحدة من الخلايا سداسية مسطحة، لها دور مهم في الحفاظ على شفافية القرنية من خلال الحفاظ على السترما القرنية في حالة جفاف نسبي من خلال وظائف الضخ1. ليفوس يشكل الحدود بين القرنية والملتحمة، وهو خزان الخلايا الجذعية الظهارية القرنية2. تساعد الملتحمة الوعائية العالية على تليين العينين عن طريق إنتاج المخاط والدموع3.
تتم دراسة ديناميات الخلايا في هياكل سطح القرنية بشكل تقليدي إما عن طريق التحليل النسيجي أو في زراعة الخلايا في المختبر ، والتي قد لا تحاكي بشكل كاف ديناميات الخلايا الحية. وبالتالي، فإن نهج التصوير الحي غير الغازي يمكن أن يسد هذه الفجوة. نظرا لمزاياها، والتي تشمل دقة عالية، والحد الأدنى من الصور وعمق عمق التصوير، MPM أصبحت طريقة قوية في مجالات مختلفة من البحوث البيولوجية4،5،6،7،8. بالنسبة لتصوير القرنية، توفر MPM معلومات خلوية من الفلورا الذاتية الجوهرية المستمدة من NAD (P)H داخل الخلايا. الجيل التوافقي الثاني (SHG) إشارات المستمدة من نوع غير centrosymmetric أنا ألياف الكولاجين تحت femtosecond ليزر المسح يوفر هياكل السترومال الكولاجين دون إجراءات تلطيخ إضافية9. في السابق، ونحن وغيرها من الجماعات قد استغلت MPM لتصوير القرنيات الحيوانية والبشرية9،10،11،12،13،14،15.
خطوط الماوس المعدلة وراثيا عرض البروتينات الفلورية في مجموعات خلايا محددة وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسات مختلفة في بيولوجيا الخلية, بما في ذلك التنمية, الأنسجة التوازن, تجديد الأنسجة, وتولد السرطان. استخدمنا سلالات الماوس المعدلة وراثيا وصفت مع البروتينات الفلورية لفي التصوير في مجال المعلومات الحية من القرنيات9،10، بصيلات الشعر10 والبشرة10 بواسطة MPM. يتم تربيت سلالة الماوس الفلورية المزدوجة مع غشاء الخلية المسمى مع tdTomato ونواة الخلية الموسومة مع EGFP من سلالات الماوس اثنين: R26R-GR (B6؛ 129-gt (روزا) 26Sortm1Ytchn/J،#021847)16 وmT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP،#007676) 17. يحتوي خط الماوس المعدل وراثيا R26R-GR على ثنائية الفلورسنت البروتين مراسل ينبني، بما في ذلك الجينات الانصهار H2B-EGFP ومشري-GPI مرساة مرساة مرساة الجينات الانصهار إشارة، إدراجها في gt (روزا) 26Sor locus. سلالة mT-mG المعدلة وراثيا هي tdTomato غشاء الخلية المستهدفة وGFP الفئران الفلورسنت كري مراسل. قبل إعادة الكومبينيشن Cre، بروتين غشاء الخلية مع tdTomato التعبير المفلور موجود على نطاق واسع في مختلف الخلايا. هذه السلالة الماوس المعدلة وراثيا تمكننا من تصور nuclei-EGFP والغشاء مع tdTomato دون الإثارة Cre. ولدت اثنين من الإناث (R26R-GR+/+) و ذكر واحد (mT-mG+/+)الماوس المعدل وراثيا معا لإنتاج فئران كافية للتجارب. ذريتهم مع R26R-GR+/-mT-mG+/- النمط الجيني، سلالة الفئران الفلورية المزدوجة، استخدمت في هذه الدراسة. بالمقارنة مع واحد الفلورسنت خط الماوس مراسل كما هو موضح سابقا9،10، وهذا مزدوج الفلورسنت المصابيح الماوس سلالة يوفر لنا 50 ٪ تخفيض الحصول على وقت التصوير.
في هذا العمل، نحن وصف بروتوكول تقني مفصل للتصوير في الجسم الحي من سطح العين بطريقة خطوة بخطوة باستخدام منصة التصوير لدينا والفئران المعدلة وراثيا الفلورسنت المزدوج.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام هذه المنصة التصويرية MPM المبنية خصيصًا مع برنامج تحكم للتصوير داخل الرحم للأعضاء الظهارية للماوس ، بما في ذلك الجلد10، بصيلات الشعر10 وسطح العين9،10 (الشكل 1A). تم استخدام النظام المصنوع خصيصًا لمرونته في تغ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر دعم المنحة من وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (106-2627-M-002-034، 107-2314-B-182A-089، 108-2628-B-002-023، 108-2628-B-002-023)، مستشفى جامعة تايوان الوطنية (NTUH108-T17) ومستشفى تشانغ جونج التذكاري، تايوان (CMRPG3G1621، CMRPG3G1622، CMRPG3G1623).
Materials
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36 | |
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, 101-108 (1989).
- Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
- Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).
- Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).
- Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).
- Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
- Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. , (2019).
- Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).
- Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).
- Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).
- Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).
- Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).
- Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
- Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).
- Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
- Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
- Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).
- Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
- Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).
- Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).
- Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
