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Bioengineering

マウス角膜と結膜のライブイメージングのためのカスタム多光子顕微鏡プラットフォーム

Published: May 17, 2020
doi:
10.3791/60944
, , , ,
1Department of Biomedical Engineering,National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine,National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center,National Taiwan University, 4Department of Dermatology,National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine,National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology,Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine,Chang Gung University

Summary

ここでは、生きたマウス眼球表面イメージング用の多光子顕微鏡プラットフォームを紹介します。蛍光トランスジェニックマウスは、細胞核、細胞膜、神経線維および毛細血管を眼表面内で可視化します。コラーゲン構造に由来する非線形第二高調波生成信号は、間質アーキテクチャにラベルフリーイメージングを提供します。

Abstract

従来の組織学的解析および細胞培養システムは、生体内の生理学的および病理学的ダイナミクスを完全にシミュレートするには不十分である。多光子顕微鏡(MPM)は、生体内の細胞レベルでの生物医学的研究のための最も一般的なイメージングモダリティの1つとなっており、利点は、高解像度、深部組織の浸透および最小限の光毒性を含む。私たちは、カスタマイズされたマウスアイホルダーと生体内で眼表面をイメージングするための立体的なステージを備えたMPMイメージングプラットフォームを設計しました。二重蛍光タンパク質レポーターマウスは、細胞核、細胞膜、神経線維、および眼表面内の毛細血管の可視化を可能にします。多光子蛍光シグナルに加えて、第2高調波発生(SHG)を同時に取得することで、コラーゲン間質アーキテクチャの特性解析が可能になります。このプラットフォームは、角膜や結膜を含む眼表面全体にわたって正確な位置を持つ生体内イメージングに使用できます。

Introduction

角膜や結膜を含む眼表面構造は、外部の障害から他のより深い眼組織を保護します。角膜は眼の透明な前部であり、眼に光を向ける屈折レンズとしても、防護壁としても機能する。角膜上皮は角膜の最外層であり、表面細胞、翼細胞および基底細胞の別個の層から成っている。角膜のストロマは、角質細胞を埋め込んだ洗練されたコラーゲン状のラメラで構成されています。角膜内皮は、平らな六角形細胞の単層であり、そのポンプ機能1を通じて比較的脱水状態で角膜間質を保つことによって角膜の透明性を維持する上で重要な役割を有する。リンブスは角膜と結膜との境界を形成し、角膜上皮幹細胞2の貯留部である。高血管化結膜は粘液と涙を作り出すことによって目を潤滑するのに役立つ 3.

角膜表面構造の細胞ダイナミクスは、従来、組織学的解析またはインビトロ細胞培養によって研究されており、in vivo細胞ダイナミクスを十分にシミュレートできない可能性があります。非侵襲的なライブイメージングアプローチは、したがって、そのようなギャップを埋めることができます。高解像度、最小限の光ダメージ、より深いイメージング深さを含むその利点のために、MPMは,生物学的研究4、5、6、7、85,6の多様4な分野で強力なモダリティとなっています。7,8角膜イメージングの場合、MPMは細胞内NAD(P)Hに由来する内在性自己蛍光からの細胞情報を提供する。フェムト秒レーザースキャン下での非中心対称型I型コラーゲン繊維に由来する第2高調波発生(SHG)信号は、追加の染色手順9を伴わないコラーゲン間質構造を提供する。以前は、私たちや他のグループは、動物やヒトの角膜,,99、10、11、12、13、14、1510,11のイメージングのためにMPMを15利用してきました。13,1412

特定の細胞集団に蛍光タンパク質を示すトランスジェニックマウスラインは、細胞生物学において、発達、組織恒常性、組織再生、発がんなど様々な研究に広く用いられている。我々は、角膜99、10、毛包10および表皮10の生体内イメージングに蛍光タンパク質で標識されたトランスジェニックマウス株を10MPMで用いた。TdTomatoとEGFPでタグ付けされた細胞核を有する二重蛍光マウス株は、R26R-GR(B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1Ytchn/J、#021847)16および16mT-mG(GT(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP、#00767617)ACTB-tdTomato-EGFP17R26R-GRトランスジェニックマウスラインは、H2B-EGFP融合遺伝子およびmCherry-GPIアンカーシグナル融合遺伝子を含む二重蛍光タンパク質レポーター構築物を含み、Gt(ROSA)26Sor遺伝子に挿入される。mT-mGトランスジェニック株は、細胞膜標的tdTomatoおよびEGFP蛍光クレレポーターマウスである。Cre組み換えの前に、tdTomato蛍光発現を有する細胞膜タンパク質は、様々な細胞に広く存在している。このトランスジェニックマウス株は、Cre励起なしでtdTomatoで核-EGFPと膜を可視化することを可能にします。2匹の雌(R26R-GR+/+)と1匹の雄(mT-mG+/+)トランスジェニックマウスを共に飼育し、実験に十分なマウスを産生した。R26R-GR +–;mT-mG+/-+/-遺伝子型、二重蛍光マウス株を有する彼らの子孫は、この研究で使用された。+/-前述の99,1010のような1つの蛍光レポーターマウスラインと比較して、この二重蛍光レポーターマウス株は、画像化時間の取得を50%短縮します。

本研究では、イメージングプラットフォームとデュアル蛍光トランスジェニックマウスを用いて、眼表面のインビボイメージングに関する詳細な技術プロトコルを段階的に説明する。

Protocol

すべての動物実験は、国立台湾大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)とチャンガン記念病院によって承認された手順に従って行われました。 1. 多光子顕微鏡のセットアップ 水浸漬20x 1.00 NA目標を持つ直立顕微鏡をベースにしたシステムを構築します(図1A)。 Ti:サファイアレーザー(調整可能な波長)を励起源として使用してください。EGFP…

Representative Results

このライブイメージングプラットフォームを使用して、マウスの眼表面を細胞レベルで可視化することができる。眼表面の個々の単一細胞を可視化するために、細胞膜に発現する核およびtdTomatoに発現するEGFPを有する二重蛍光トランスジェニックマウスを用いた。コラーゲンが豊富な角膜間質は、SHG信号によって強調された。 角膜上皮において、表在細胞、翼細胞およ?…

Discussion

このカスタム構築されたMPMイメージングプラットフォームは、コントロールソフトウェアを用いて、皮膚10、毛包10および眼表面9、10を含むマウス上皮10器官の生体内イメージングに9使用された(図1A)。10プロジェクトの開始以来、様々な実験のための光学部品を変更する柔軟性のために、カ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

台湾の科学技術省からの助成金支援に感謝します (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023,108-2628-B-002-023),国立台湾大学病院(NTUH108-T17)、台湾チャンガン記念病院(CMRPG3G1621,CMRPG3G3G1622,CMRPG3G1622,CMRPG3G1622,CMRPG3G1623)。

Materials

AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831
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Wu, Y., Ye, R., Pan, M., Lin, S., Tan, H. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).
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