En anpassad Multiphoton Mikroskopi plattform för Live Imaging av Mus Hornhinna och Bindhinna
Summary
Presenteras här är en multiphoton mikroskopisk plattform för levande mus okulär yta imaging. Fluorescerande transgen mus möjliggör visualisering av cellkärnor, cellmembran, nervfibrer och kapillärer inom den okulära ytan. Icke-linjära andra harmoniska generationen signaler som härrör från kollagenous strukturer ger etikett-fri bildbehandling för stromal arkitekturer.
Abstract
Konventionella histologiska analys och cellodling system är otillräckliga för att simulera in vivo fysiologiska och patologiska dynamik helt. Multiphoton mikroskopi (MPM) har blivit en av de mest populära bildframställning modaliteter för biomedicinsk studie på cellulära nivåer in vivo, fördelar inkluderar hög upplösning, djup vävnad penetration och minimal fototoxicitet. Vi har utformat en MPM imaging plattform med en anpassad mus öga hållare och en stereotaxic skede för bildbehandling okulär yta in vivo. Dual fluorescerande protein reporter mus möjliggör visualisering av cellkärnor, cellmembran, nervfibrer, och kapillärer inom okulär yta. Förutom multifoton fluorescens signaler, förvärva andra harmoniska generationen (SHG) samtidigt möjliggör karakterisering av kollagenös stromal arkitektur. Denna plattform kan användas för intravital avbildning med noggrann positionering över hela okulär yta, inklusive hornhinna och bindhinna.
Introduction
De okulär ytstrukturer, inklusive hornhinnan och bindhinnan, skyddar andra djupare okulär vävnader från yttre störningar. Hornhinnan, den genomskinliga främre delen av ögat, fungerar både som en brytningslins för att rikta ljus in i ögat och som en skyddande barriär. Hornhinnans epitel är det yttersta lagret av hornhinnan och består av distinkta lager av ytliga celler, vingceller och basala celler. Hornhinnans stroma består av sofistikerat packade kollagenhlamlas inbäddade med keratocyter. Hornhinnans endotel, ett enda lager av platta sexkantiga celler, har en viktig roll i att upprätthålla insynen i hornhinnan genom att hålla hornhinnans stroma i ett relativt uttorkad stat genom sin pumpfunktioner1. Limbus bildar gränsen mellan hornhinnan och bindhinnan, och är reservoaren av hornhinnans epitelceller2. Den starkt vascularized bindhinna hjälper till att smörja ögonen genom att producera slem och tårar3.
Celldynamiken i hornhinnans ytstrukturer studeras konventionellt genom antingen histologisk analys eller in vitro-cellkultur, som kanske inte på ett tillfredsställande sätt simulerar in vivo-celldynamiken. En icke-invasiv levande bildbehandling strategi kan därför överbrygga en sådan klyfta. På grund av dess fördelar, som inkluderar hög upplösning, minimal fotoskador och djupare bildframställning djup, MPM har blivit en kraftfull modalitet i olika områden av biologisk forskning4,5,6,7,8. För hornhinnans bildbehandling, MPM ger cellulär information från inneboende autofluorescens som härrör från den intracellulära NAD(P)H. Andra harmoniska generationens (SHG) signaler som härrör från den icke-centrosymmetriska typ I kollagen fibrer under femtosecond laserscanning ger kollagen stromal strukturer utan ytterligare färgning förfaranden9. Tidigare har vi och andra grupper utnyttjat MPM för bildframställning av djur- och människoklinner9,10,11,12,13,14,15.
Transgena muslinjer som uppvisar fluorescerande proteiner i specifika cellpopulationer har använts i stor utsträckning för olika studier inom cellbiologi, inklusive utveckling, vävnadshomeostas, vävnadsregenerering och carcinogenes. Vi använde transgen mus stammar märkta med fluorescerande proteiner för in vivo bildframställning av hornhinnor9,10, hårsäckar10 och epidermis10 av MPM. Den dubbla fluorescerande musstammen med cellmembranet märkt med tdTomato och cellkärna märkta med EGFP är uppfödd från två musstammar: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 och mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgen mus linje innehåller en dubbel fluorescerande protein reporter konstruktioner, inklusive en H2B-EGFP fusion gen och mCherry-GPI ankare signal fusion gen, införas i Gt (ROSA)26Sor locus. Den transgena stammen mT-mG är en cellmembran-riktad tdTomato och EGFP fluorescerande Cre-reporter möss. Före Cre rekombination är cellmembranprotein med tdTomato fluorescensuttryck allmänt närvarande i olika celler. Denna transgena musstam gör det möjligt för oss att visualisera atomkärnor-EGFP och membran med tdTomato utan Cre-excitation. Två honor (R26R-GR+/+) och en hane (mT-mG+/+) var transgen mus uppfödda tillsammans för att producera tillräckliga möss för experiment. Deras avkomma med R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotyp, en dubbel fluorescerande möss stam, användes i denna studie. Jämfört med en fluorescerande reporter muslinje som tidigare beskrivits9,10, denna dubbla fluorescerande reporter mus stam ger oss en 50% minskad förvärvning av bildtagning tid.
I detta arbete beskriver vi ett detaljerat tekniskt protokoll för in vivo-avbildning av okulär ytan i ett steg-för-steg-sätt med hjälp av vår bildframställning plattform och dubbla fluorescerande transgena möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna specialbyggda MPM imaging plattform med en kontroll programvara användes för intravital avbildning av mus epitelial organ, inklusive huden10, hårsäcken10 och okulär yta9,10 (Figur 1A). Det specialbyggda systemet användes för sin flexibilitet i att ändra de optiska komponenterna för olika experiment, sedan början av vårt projekt. Denna bildmetodik är mångsidig för kom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar bidragsstödet från ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) och Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).
Materials
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36 | |
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, 101-108 (1989).
- Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
- Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).
- Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).
- Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).
- Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
- Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. , (2019).
- Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).
- Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).
- Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).
- Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).
- Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).
- Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
- Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).
- Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
- Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
- Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).
- Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
- Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).
- Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).
- Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
