Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Fare Kornea ve Konjonktiva Canlı Görüntüleme için Özel Multifoton Mikroskop platformu

doi: 10.3791/60944 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Burada sunulan canlı fare oküler yüzey görüntüleme için bir multifoton mikroskobik platformdur. Floresan transgenik fare hücre çekirdekleri, hücre zarları, sinir lifleri ve oküler yüzey içinde kılcal damarların görüntülenmesi sağlar. Kolaj nasyonal yapılardan elde edilen doğrusal olmayan ikinci harmonik nesil sinyalleri stromal mimariler için etiketsiz görüntüleme sağlar.

Abstract

Konvansiyonel histolojik analiz ve hücre kültürü sistemleri in vivo fizyolojik ve patolojik dinamikleri tamamen simüle etmek için yeterli değildir. Multifoton mikroskopi (MPM) in vivo hücresel düzeyde biyomedikal çalışma için en popüler görüntüleme yöntemlerinden biri haline gelmiştir, avantajları yüksek çözünürlük, derin doku penetrasyonu ve minimal fototoksisite içerir. Biz özelleştirilmiş fare göz tutucu ve in vivo oküler yüzey görüntüleme için stereotaksik bir sahne ile bir MPM görüntüleme platformu tasarladık. Çift floresan protein muhabiri fare hücre çekirdekleri görselleştirme sağlar, hücre zarları, sinir lifleri, ve oküler yüzey içinde kılcal damarlar. Multifoton floresan sinyallerine ek olarak, ikinci harmonik nesil (SHG) elde etmek aynı anda kolajnöz stromal mimarinin karakterizasyonuna olanak sağlar. Bu platform kornea ve konjonktiva da dahil olmak üzere tüm oküler yüzey, doğru konumlandırma ile intravital görüntüleme için kullanılabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kornea ve konjonktiva da dahil olmak üzere oküler yüzey yapıları, dış bozukluklar diğer derin oküler dokuları korumak. Gözün saydam ön kısmı olan kornea, ışığı göze yönlendirmek için hem kırılma lensi hem de koruyucu bariyer işlevi görür. Kornea epitelkorenin en dış tabakasıdır ve yüzeysel hücrelerin, kanat hücrelerinin ve bazal hücrelerin farklı katmanlarından oluşur. Kornea stroma keratositler ile gömülü sofistike paketlenmiş kolajnöz lamellae oluşur. Kornea endotel, düz altıgen hücrelerin tek bir tabaka, onun pompalama fonksiyonları ile nispeten susuz durumda kornea stroma tutarak kornea şeffaflığını korumak önemli bir role sahiptir1. Limbus kornea ve konjonktiva arasındaki sınırı oluşturur, ve kornea epitel kök hücrelerinin rezervuar2. Yüksek vaskülarize konjonktiva mukus ve gözyaşı üreterek gözleri yağlamak için yardımcı olur3.

Kornea yüzeyyapılarının hücre dinamiği geleneksel olarak histolojik analiz veya in vitro hücre kültürü ile incelenir ve bu dinamikler in vivo hücre dinamiklerini yeterince simüle etmeyebilir. Non-invaziv canlı görüntüleme yaklaşımı, bu nedenle, böyle bir boşluğu köprü olabilir. Yüksek çözünürlük, minimal fotohasar ve daha derin görüntüleme derinliği içeren avantajları nedeniyle, MPM biyolojik araştırma4,5,,6,,7,8çeşitli alanlarda güçlü bir modalite haline gelmiştir. Kornea görüntüleme için, MPM hücre içi NAD (P)H türetilen içsel otofloresan hücresel bilgi sağlar. Femtosecond lazer tarama altında non-centrosimetrik tip I kollajen liflerden elde edilen ikinci harmonik nesil (SHG) sinyalleri ek boyama prosedürleri olmadan kolajnöz stromal yapılar sağlar9. Daha önce, biz ve diğer gruplar hayvan ve insan kornea görüntüleme için MPM istismar var9,10,11,12,13,14,15.

Belirli hücre popülasyonlarında floresan proteinleri sergileyen transgenik fare hatları, hücre biyolojisi alanında gelişim, doku homeostazları, doku rejenerasyonu ve karsinogenez gibi çeşitli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Biz kornea9,,10,saç folikülleri10 ve epidermis10 MPM tarafından in vivo görüntüleme için floresan proteinleri ile etiketlenmiş transgenik fare suşları kullanılır. TDTomato ve hücre çekirdeği ile etiketlenmiş hücre zarı ile çift floresan fare suşu iki fare suşlarından üretilir: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 ve mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgenik fare hattı, Gt (ROSA)26Sor lokusuna yerleştirilen H2B-EGFP füzyon geni ve mCherry-GPI çapa sinyali füzyon geni de dahil olmak üzere çift floresan protein muhabiri yapısı içerir. mT-mG transgenik türü hücre zarı hedefli tdTomato ve EGFP floresan Cre-reporter farelerdir. Cre rekombinasyon dan önce, tdTomato floresan ekspresyonu ile hücre zarı proteini çeşitli hücrelerde yaygın olarak bulunur. Bu transgenik fare suşları, cre uyarma olmadan tdTomato ile çekirdek-EGFP ve membranı görselleştirmemizi sağlar. İki dişi (R26R-GR+/+) ve bir erkek (mT-mG+/+) transgenik fare deneyler için yeterli fare üretmek için birlikte yetiştirildi. Bu çalışmada r26R-GR+/-;mT-mG+/- genotip, çift floresan fare türü olan yavruları kullanıldı. Daha önce açıklandığı gibi bir floresan muhabir fare hattı ile karşılaştırıldığında9,10, Bu çift floresan muhabir fare suşu görüntüleme süresi% 50 azaltılmış edinme ile bize sağlar.

Bu çalışmada, görüntüleme platformumuz ve çift floresan transgenik farelerimizi kullanarak oküler yüzeyin in vivo görüntülemesi için ayrıntılı bir teknik protokolü adım adım açıklıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Tayvan Üniversitesi ve Chang Gung Memorial Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak yapılmıştır.

1. Multifoton mikroskopi kurulumu

  1. Su daldırma 20x 1.00 NA hedefi(Şekil 1A)ile dik bir mikroskobu temel alan bir sistem oluşturun.
  2. Uyarma kaynağı olarak Ti: Safir lazer (dalga boyunda) kullanın. Lazer çıkış dalga boyunu EGFP için 880 nm ve tdTomato için 940 nm olarak ayarlayın (Şekil 1A).
  3. SHG/EGFP ve EGFP/tdTomato(Şekil 1A)ayrımı için iki dikroik ayna (495 nm ve 580 nm) ekleyin. Spektronik ayrı SHG sinyalleri, EGFP ve tdTomato bandpass filtreleri 434/17nm, 510/84nm ve 585/40nm(Şekil 1A).
  4. Görüntü kalitesini optimize etmek ve fotobeyazrlama ve doku hasarını önlemek için lazer gücünü korneanın görüntülenmesi için yaklaşık 35 mW, limbus için 50 mW olarak ayarlayın. Lazer optik sistemi geçmeden önce lazer gücünü ölçün. Örneklerde tam lazer gücü yaklaşık 8-9 mW'dır. Tam mikroskobik tasarım Şekil 1A'dagösterilmiştir.
    NOT: Lazer gücünün üst sınırı, fotoğraf beyazlatma ve doku hasarını önlemek için 70 mW olarak ayarlanır.

2. Canlı görüntüleme için hayvan hazırlığı

  1. Deney için 8-12 haftalık fareler kullanın. Genel anestezi için 50-80 mg/kg kiremitamin HCl ve zolazepam HCl enjekte edin. Bir ayak çimdikleme tarafından çekilme refleks yanıt eksikliği olup olmadığını kontrol edin. Stabil solunum hızı nın izlenmesi için yeterli anestezi önemlidir.
    NOT: 8 haftalık ve üzeri fareler, göz bebekleri olgunlaştığı için önerilir.
  2. Fareyi ısıtılmış bir sahnede anestezi altına alın ve sıcaklık izleme probunu anüse yerleştirin.
    DİkKAT: Prob, ısıtıcının aşırı ısınmasını ve sıcak çarpmasının indüksiyonunu önlemek için havaya maruz kalmadan anal kaviteye tam olarak yerleştirilmelidir.

3. Göz yüzeyinin canlı görüntülemesi için göz tutma

  1. Oküler yüzeyin canlı görüntülemesi için, iki bölümden oluşan özel olarak tasarlanmış stereotaksik fare tutucuyu kullanın: baş tutucuyu stabilize etmek için bir kafa tutucu ve göz kapaklarını geri çekmek ve tüm oküler yüzeyi ortaya çıkarmak için bir göz tutucu(Şekil 1B-D).
  2. Dış işitsel meatus içine kulak çubukları yerleştirin ve baş tutucunun üç noktalı fiksasyon korumak(Şekil 1B,D).
  3. Topikal salin% 0.4 oksibuprokain hidroklorür bir çözüm uygulayın ve oküler yüzeyanestezik için 3 dakika bekletin.
  4. Göz küresinin uygun manuel göz kapağı geri çekilmesi ile çıkıntılı olduğundan emin olun. Aksi takdirde, iskemi ve göz küresi kanaması oluşabilir.
  5. Dikkatle göz kapağı nın polietilen tüp göz kapağı marjı boyunca oküler yüzeyi ortaya çıkarmak için bir döngü yerleştirin. Polietilen tüp(Şekil 1C,D)döngü ile kaplı uçları ile bir No 5 Dumont forceps oluşan göz tutucusu ile göz küresi stabilize.
  6. Göz tutucunun distal forceps bir topun kullanarak Vida forceps göz küresi kararlı tutmak için(Şekil 1D).
  7. Oküler yüzeyin nemini her saat korumak için kornea yüzeyine 1.338 kırılma indisi ile bir göz jeli uygulayın. Buna ek olarak, görüntüleme sırasında her saat göz jeli düzenli uygulama kornea da bulutlama önlemek.
  8. Merkezi korneadan çevre bölgeye tüm kornea yüzeyinde görüntüleme için step motorlu sahnede kilitli tutucu ile göz küresini döndürün(Şekil 1C,D).
    DİkKAT: Göz jeli hem fazla hem de yetersiz miktarda görüntüleme sırasında görüntülerin kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, düzenli olarak yüzeynemli tutmak için her saat göz jeli takviyesi görüntüleme için önemlidir.

4. Z-seri görüntü edinimi

NOT: Bırakma hareketi yapıtlarını azaltmak için her yığındaki ilk ve son slaytı ayarlayın.

  1. Görüntüleri çekmeden önce, bir cıva ışık kaynağı ile hedefleme alanı görüntü.
  2. Yazılımı açmak için mikroskop yazılımının simgesini tıklatın.
  3. Oküler yüzeydeki hücresel yapıyı görselleştirmek için uygun PMT kazancını ve dijital kazancı seçin.
  4. Bir yığın elde etmek için ilk slaydı ve son slaydı ayarlayın.
  5. Görüntü çözünürlüğü ve z adımı için sayısal değerleri girin, örneğin 512 x 512 ve 1 μm z adımı olarak.
  6. Z-seri görüntüleri toplamak için Başlat düğmesine tıklayın.
  7. Aynı bölgede iki kez canlı görüntü elde edin, ilki SHG/EGFP sinyalleri için 880 nm uyarma ve EGFP/tdTomato sinyalleri toplama için 940 nm uyarma da ikinci.
    NOT: İki yığının birleşimi 3 kanal görüntüsü sağlar. Görüntü çözünürlüğü ve tbmkün boyutu sırasıyla 512 x 512 piksel ve 157 μm x157 m idi.

5. Görüntü işleme ve 3D rekonstrüksiyon

  1. Fiji yazılım18içine z-seri görüntüleri yükleyin.
  2. Arka plan gürültülerini azaltmak için Fiji'deki eklenti Median 3D filtresini seçin.
  3. Görüntüleri keskinleştirmek için Fiji'deki Paket Keskinliği Olmayan Maske filtresini seçin.
  4. Görüntülerin kalitesini otomatik olarak optimize etmek için parlaklık/kontrast olarak "Otomatik" seçeneğini tıklayın.
  5. Z-seri görüntüleri dışa aktarabilmek için görüntüleri görüntü dizileri olarak kaydedin.
  6. Z-seri görüntüleri, hacim oluşturma yı kullanarak 3D yeniden yapılandırma için ticari yazılımlara (örn. Avizo lite) yükleyin.
  7. Tüm MPM görüntülerinde sırasıyla egfp, tdTomato ve SHG sinyalleri sırasıyla sözde yeşil, kırmızı ve sesiz renktedir.
  8. Anlık görüntüye göre 3B yapı resimleri yakalayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu canlı görüntüleme platformu kullanılarak, fare oküler yüzey hücresel düzeyde görselleştirilmiş olabilir. Oküler yüzeydeki tek hücreleri görselleştirmek için, hücre zarında ifade edilen çekirdek ve tdTomato ile egfp ile çift floresan transgenik fareler kullandık. Kollajen açısından zengin kornea stroma SHG sinyalleri ile vurgulandı.

Kornea epitelinde yüzeyel hücreler, kanat hücreleri ve bazal hücreler(Şekil 2)görselleştirildi. Çift floresan transgenik farelerde, bazal tabakadan hem kornea hem de limbal epiteldeki yüzeysel tabakalara kadar tek hücreharitasınıçıkarabildik ( Şekil 2 ). Altıgen yüzeysel hücreler gözlendi (Şekil 2'debeyaz ok ucu). Hem nükleer boyut hem de bazal tabakadan dış tabakalara doğru nükleer aralıklar kornea epitelinde artmıştır (Şekil 2). TdTomato floresans sitoplazmik sinyalleri, Golgi aparatı, endoplazmik retikulum da dahil olmak üzere membran protein açısından zengin hücre içi vesiküler sistemin kanat hücrelerine dağıldığını göstermiştir(Şekil 2).

Kollajen stroma içinde, stellat şekilli keratositler çift floresan transgenik farelerde membran hedeflemeli tdTomato floresan tarafından özetlenmiştir (Şekil 3 ve Şekil 4'tesarı ok ucu). Kollajen stroma gömülü keratositler daha gevşek endotel hücrelerinden daha aralıklı edildi. Buna ek olarak, kornea stromaince dallanma sinirler de membran hedefleme tdTomato sinyalleri (Şekil 3beyaz ok ucu) ile görselleştirilmiş edildi. Kornea endotel hücrelerinin monotabakası, petekli bir desene bağlı nispeten homojen bir altıgen şekil gösterdi (Şekil 4'tebeyaz ok ucu). Limbal epitel 1-2 epitel hücrelerinin katmanlarından oluşuyordu(Şekil 5). Çift floresan muhabir transgenik fare suşu da konjonktiva içindeki kılcal damarları görüntülememizi sağladı (Şekil 6A). Kılcal damarların 3Boyutlu mimarisi vasküler endotel ana hatlarıyla yeniden inşa edilmiştir (Şekil 6B,6C).

Figure 1
Şekil 1: MPM ve dönen fare tutucunun kurulumu.
(A) MPM'nin kurulumu. (B) Fare tutucunun tasarımı. Fare tutucu, dönen bir kafa tutucu su ve göz tutucudan oluşur. (C) Fare göz tutucunun tasarımı. Göz tutucu kornea ve konjonktiva ortaya çıkarmak için plastik bir döngü ile göz kapakları geri çeker. Baş tutucu ve göz tutucu, oküler yüzeyin hassas ve kontrol edilebilir rotasyonve görüntülemesini sağlamak için sahnede (B) birbirine vidalanır. (D) Göz tutucu ile kornea görüntüleme için canlı fare fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Çift floresan transgenik farelerde kornea epitelinin canlı görüntülemesi.
Kornea epiteli yüzeysel hücreleri, kanat hücreleri ve bazal hücreleri içerecek şekilde katman katman görüntülendi. Yüzeysel hücreler beyaz bir ok ucu ile işaretlenir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (Z = epitelüst yüzeyinden derinlik (μm)). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Kornea stromasının canlı görüntülemesi.
Kornea stromaiçinde, keratositler (sarı ok ucu) ve sinir lifleri (beyaz ok ucu) kollajen stroma (sözde mavi renkte) gömülüidi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Orta korneada kornea endotel canlı görüntüleme.
Altıgen kornea endotel hücrelerinin monolayer (beyaz ok başı). Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Limbal epitelin canlı görüntülemesi.
Çift floresan transgenik farelerde limbal epitelcanlı görüntüleri vakuolated çekirdekleri gösterdi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Canlı görüntüleme ve konjonktivavasküler ağın üç boyutlu rekonstrüksiyonu.
(A) Konjonktiva stromasında kılcal damarlar görselleştirildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Ticari bir yazılım kullanılarak yapılan kılcal ağların 3Boyutlu rekonstrüksiyonu. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C,D) Panel b. Floresan vasküler endotel hücrelerinde gösterilen görüntünün büyütülmüş 3D görünümleri kılcal damarları (beyaz ve sarı ok başları) özetledi. C paneli = 6,26 μm ve D paneli için ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir kontrol yazılımı ile bu özel inşa MPM görüntüleme platformu fare epitel organlarının intravital görüntüleme için kullanılmıştır, deri dahil10, saç folikülü10 ve göz yüzeyi9,10 (Şekil 1A). Özel olarak üretilen sistem, projemizin başlangıcından bu yana çeşitli deneyler için optik bileşenleri değiştirme esnekliği için kullanılmıştır. Bu görüntüleme metodolojisi ticari MPM ürünleri için çok yönlüdür. Bu protokol, fare oküler yüzeyinin MPM görüntüleme platformu tarafından intravital görüntülemesi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Stereotaksik fare tutucu(Şekil 1B)kullanarak, tüm oküler yüzeyde farklı bölgeleri görselleştirmeyi başardık. Doğru konumlandırma yeteneği, belirli bir bölgedeki zamansal hücre dinamik değişikliklerini izlemeyi mümkün kılar.

Murine kornea MPM görüntüleme çeşitli çalışmalar in vivo19,20,,21,22bildirilmiştir rağmen , bir uzun bir süre boyunca sürekli görüntüleme elde etmek için üstesinden gelmek için gereken çeşitli teknik sınırlamalar vardır, istikrarlı bir pozisyonda göz küresi tutarak, görüntüleme sırasında hareket eserler azalan ve fotobleaching olmadan uzun bir süre görüntüleri elde. Göz yüzeyine nispeten sınırlı erişim ile in vivo kornea görüntüleme için tasarlanmış plastik göz fincanı ile karşılaştırıldığında20,göz tutucumuz sadece göz küresini tam açıkta tutmuyor, aynı zamanda tüm oküler yüzeyi objektif merceğe erişilebilir kılıyor(Şekil 1C).

Hayati boyalar veya problar rutin hücreleri etiketlemek için floresan muhabirler olarak kullanılan rağmen20,21,22, iğne enjeksiyonu invazivliği fizyolojik homeostatik devlet veya doku rejenerasyon işlemi sırasında organların doğal hücre dinamikleri bozabilir. R26R-GR transgenik fareler insuş hücre çekirdeğinde kararlı ve parlak yeşil floresan protein ifade eder ve hayalet lifleri kas dinamiyetlerinin hücre dinamiklerinin görselleştirilmesi için kullanılmıştır23. mT-mG muhabiri transgenik fare hattı epidermal hücrelerin inhomeostaz24farklılaşmasını analiz etmek için kullanıldı. Tek bir muhabir floresan transgenik fare hattı ile karşılaştırıldığında, bu çift floresan transgenik fare suşu aynı anda hem hücre çekirdeklerinin hem de hücre zarlarının hücre yapısı bilgilerini sağlayarak görüntü edinimi süresini yarıya indirdi. Fare tutucuyu döndürerek, hem endotel hem de kan hücrelerinin düz çekirdekleri vasküler lümen içinde çift floresan transgenik fare suşları kullanılarak görselleştirildi(Şekil 6). Bu nedenle, bu transgenik fare hattı gelecekte kılcal damarların hücre dinamiklerini araştırmak için kullanılabilir, hangi patolojik kornea nevasaskülarizasyonu için anahtardır. Buna ek olarak, bu in vivo görüntüleme platformu da farklı bağışıklık hücrelerinin floresan etiketleme tarafından kornea patolojilerinde bağışıklık yanıtları keşfetmek için kullanılabilir, gibi nötrofiller25, langerhans hücreleri26, düzenleyici T hücreleri (Tregs)27 ve mast hücreleri28.

Sonuç olarak, fare oküler yüzey çalışması için güçlü bir intravital MPM görüntüleme platformu gösterdik. Canlı MPM stereotaksik evresi ve özel floresan transgenik farelerin kombinasyonu kornea, limbus ve konjonktiva da dahil olmak üzere oküler yüzeyde farklı hücresel ve ekstrasellüler yapıların gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar. Bu intravital görüntüleme platformu göz yüzeyinin hücre dinamiklerini keşfetmek için yardımcı olabilir ve, daha fazla gelişme ile, potansiyel olarak gelecekte oftalmik ilaç taraması için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgments

Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Tayvan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi (NTUH108-T17) ve Chang Gung Memorial Hastanesi, Tayvan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMR3PG1623).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37, (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352, (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19, (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20, (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12, (2), 024013 (2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2, (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48, (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91, (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7, (9), 46171 (2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18, (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23, (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135, (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191, (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, (6), 973-984 (2011).
Fare Kornea ve Konjonktiva Canlı Görüntüleme için Özel Multifoton Mikroskop platformu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).More

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter