Uma plataforma personalizada de microscopia multifotn para imagens ao vivo de córnea de rato e conjuntiva
Summary
Apresentada aqui é uma plataforma microscópica multifotípica para imagens de superfície ocular de rato vivo. O camundongo transgênico fluorescente permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Sinais de segunda geração harmônica não lineares derivados de estruturas colágenas fornecem imagens sem rótulos para arquiteturas estromais.
Abstract
A análise histológica convencional e os sistemas de cultura celular são insuficientes para simular completamente a dinâmica fisiológica e patológica in vivo. A microscopia multifotônica (MPM) tornou-se uma das modalidades de imagem mais populares para estudo biomédico em níveis celulares in vivo, as vantagens incluem alta resolução, penetração de tecido profundo e fototoxicidade mínima. Projetamos uma plataforma de imagem MPM com suporte para olhos de mouse personalizado e um estágio estereotaxico para imagem de superfície ocular in vivo. O rato repórter de proteína fluorescente dupla permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Além dos sinais de fluorescência multifotônica, a aquisição de segunda geração harmônica (SHG) permite simultaneamente a caracterização da arquitetura estromal colágena. Esta plataforma pode ser empregada para imagens intravitais com posicionamento preciso em toda a superfície ocular, incluindo córnea e conjuntiva.
Introduction
As estruturas superficiais oculares, incluindo a córnea e a conjuntiva, protegem outros tecidos oculares mais profundos de distúrbios externos. A córnea, a parte frontal transparente do olho, funciona tanto como uma lente refrativa para direcionar a luz para o olho quanto como uma barreira protetora. O epitélio corneo é a camada mais externa da córnea e consiste em camadas distintas de células superficiais, células de asa e células basais. O estroma corneal é composto de lamellae colagenosa sofisticadamente embalada embutida com ceratocitos. O endotélio corneo, uma única camada de células hexagonais planas, tem um papel importante na manutenção da transparência da córnea, mantendo o estroma córnea em um estado relativamente desidratado através de suas funções de bombeamento1. Limbus forma a borda entre a córnea e a conjuntiva, e é o reservatório de células-tronco epiteliais da córnea2. A conjuntiva altamente vascularizada ajuda a lubrificar os olhos produzindo muco e lágrimas3.
A dinâmica celular das estruturas da superfície córnea é convencionalmente estudada pela análise histológica ou pela cultura celular in vitro, o que pode não simular adequadamente a dinâmica celular in vivo. Uma abordagem de imagem ao vivo não invasiva pode, portanto, preencher tal lacuna. Devido às suas vantagens, que incluem alta resolução, fotodamagem mínima e profundidade de imagem mais profunda, o MPM tornou-se uma modalidade poderosa em diversas áreas de pesquisa biológica4,,5,,6,,7,,8. Para imagens córneas, o MPM fornece informações celulares da autofluorescência intrínseca derivada do NAD intracelular(P)H). Sinais de segunda geração harmônica (SHG) derivados das fibras de colágeno tipo I não centrosimétricas sob a varredura a laser femtosegundo fornecem estruturas estromais colágenos sem procedimentos adicionais de coloração9. Anteriormente, nós e outros grupos exploramos MPM para imagens de córneas animais e humanas9,,10,,11,12,,13,,14,,15.
Linhas de camundongos transgênicos que exibem proteínas fluorescentes em populações de células específicas têm sido amplamente utilizadas para vários estudos em biologia celular, incluindo desenvolvimento, homeostase tecidual, regeneração tecidual e carcinogênese. Foram utilizadas cepas de camundongos transgênicos rotuladas com proteínas fluorescentes para imagem in vivo de córneas9,,10, folículos capilares10 e epiderme10 por MPM. A cepa de camundongo fluorescente duplo com membrana celular rotulada com tdTomato e núcleo celular marcado com EGFP é criada a partir de duas cepas de camundongos: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 e mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. A linha de camundongos transgênicos R26R-GR contém uma dupla proteína fluorescente, incluindo um gene de fusão H2B-EGFP e um gene de fusão de sinal de âncora mCherry-GPI, inserido no lócus gt (ROSA)26Sor. A cepa transgênica mT-mG é um tdTomato de membrana celular e ratos cre-repórter fluorescentes EGFP. Antes da recombinação da Cre, a proteína da membrana celular com expressão de fluorescência tdTomato está amplamente presente em várias células. Esta cepa de camundongos transgênicos nos permite visualizar núcleos-EGFP e membrana com tdTomato sem excitação cre. Duas fêmeas (R26R-GR+/+) e um macho (mT-mG+/+) foram criadas juntas para produzir camundongos suficientes para experimentos. Sua prole com R26R-GR+/-;mT-mG+/- genótipo, uma cepa de camundongos fluorescentes duplos, foi utilizada neste estudo. Comparado com uma linha de mouse de repórter fluorescente como descrito anteriormente9,10, esta cepa de mouse repórter fluorescente duplo nos fornece uma redução de 50% do tempo de imagem.
Neste trabalho, descrevemos um protocolo técnico detalhado para imagens in vivo da superfície ocular de forma passo a passo usando nossa plataforma de imagem e camundongos transgênicos fluorescentes duplos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta plataforma de imagem MPM personalizada com um software de controle foi usada para imagens intravitais de órgãos epiteliais de camundongos, incluindo pele10,folículo piloso10 e superfície ocular9,,10 (Figura 1A). O sistema personalizado foi usado por sua flexibilidade na alteração dos componentes ópticos para vários experimentos, desde o início do nosso projeto. Essa metodo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) e Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).
Materials
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36 | |
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
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