Una piattaforma di microscopia multifoto personalizzata per l'imaging dal vivo di Mouse Cornea e Conjunctiva
Summary
Qui è presentata una piattaforma microscopica multifoto per l’imaging della superficie oculare del mouse vivo. Il mouse transgenico fluorescente consente la visualizzazione di nuclei cellulari, membrane cellulari, fibre nervose e capillari all’interno della superficie oculare. I segnali di seconda generazione armonica non lineari derivati da strutture collagenose forniscono immagini senza etichette per architetture tropiche.
Abstract
L’analisi itologica convenzionale e i sistemi di coltura cellulare sono insufficienti per simulare completamente le dinamiche fisiologiche e patologiche in vivo. La microscopia multifotona (MPM) è diventata una delle modalità di imaging più popolari per lo studio biomedico a livelli cellulari in vivo, i vantaggi includono alta risoluzione, penetrazione dei tessuti profondi e fototossicità minima. Abbiamo progettato una piattaforma di imaging MPM con un supporto per gli occhi per mouse personalizzato e uno stadio stereotassico per l’imaging della superficie oculare in vivo. Il mouse reporter a doppia proteina fluorescente consente la visualizzazione di nuclei cellulari, membrane cellulari, fibre nervose e capillari all’interno della superficie oculare. Oltre ai segnali di fluorescenza multifotona, l’acquisizione di seconda generazione armonica (SHG) consente contemporaneamente la caratterizzazione dell’architettura stroa collagenos. Questa piattaforma può essere utilizzata per l’imaging intravitale con posizionamento accurato su tutta la superficie oculare, tra cui cornea e congiuntiva.
Introduction
Le strutture superficiali oculari, tra cui la cornea e la congiuntiva, proteggono altri tessuti oculari più profondi da disturbi esterni. La cornea, la parte anteriore trasparente dell’occhio, funziona sia come lente refrattiva per dirigere la luce nell’occhio sia come barriera protettiva. L’epitelio corneale è lo strato più esterno della cornea ed è costituito da strati distinti di cellule superficiali, cellule alali e cellule basali. Lo stroma corneale è composto da lamellae collagenose sofisticate e confezionate incastonate con cheratociti. L’endotelio corneale, un singolo strato di cellule esagonali piatte, ha un ruolo importante nel mantenere la trasparenza della cornea mantenendo lo stroma corneale in uno stato relativamente disidratato attraverso le sue funzioni dipompaggio 1. Limbus forma il confine tra la cornea e la congiuntiva, ed è il serbatoio delle cellule staminali epiteliali corneali2. La congiuntiva altamente vascolarizzata aiuta a lubrificare gli occhi producendo muco e lacrime3.
Le dinamiche cellulari delle strutture della superficie corneale sono convenzionalmente studiate dall’analisi sittologica o dalla coltura cellulare in vitro, che potrebbe non simulare adeguatamente le dinamiche cellulari in vivo. Un approccio non invasivo per l’imaging dal vivo può, pertanto, colmare tale lacuna. Grazie ai suoi vantaggi, che includono alta risoluzione, minimo fotodamage e profondità di imaging più profonda, MPM è diventato una potente modalità in diverse aree della ricerca biologica4,5,6,7,8. Per l’imaging corneale, MPM fornisce informazioni cellulari dall’autofluorescenza intrinseca derivata dal NAD(P)H intracellulare. I segnali di seconda generazione armonica (SHG) derivati dalle fibre di collagene di tipo I non centrosmimetriche sotto la scansione laser femtosecondi forniscono strutture stromali collagenose senza ulteriori procedure di colorazione9. In precedenza, noi e altri gruppi abbiamo sfruttato MPM per l’imaging di cornee animali e umane9,10,11,12,13,14,15.
Linee di topo transgenici che presentano proteine fluorescenti in specifiche popolazioni cellulari sono state ampiamente utilizzate per vari studi nella biologia cellulare, tra cui lo sviluppo, l’omeostasi dei tessuti, la rigenerazione dei tessuti e la carcinogenesi. Abbiamo usato ceppi di topi transgenici etichettati con proteine fluorescenti per l’imaging in vivo di cornee9,10, follicolipiliferi 10 ed epidermide10 da MPM. Il ceppo del topo a doppia fluorescente con membrana cellulare etichettata con tdTomato e nucleo cellulare etichettato con EGFP è allevato da due ceppi di topo: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 e mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. La linea di topi transgenici R26R-GR contiene un duplice costrutto di proteine fluorescenti, tra cui un gene di fusione H2B-EGFP e un gene di fusione del segnale di ancoraggio mCherry-GPI, inseriti nel locus Gt (ROSA)26Sor. Il ceppo transgenico mT-mG è un tdTomato mirato alla membrana cellulare e topi Cre-reporter fluorescenti EGFP. Prima della ricombinazione di Cre, la proteina della membrana cellulare con espressione di fluorescenza tdTomato è ampiamente presente in varie cellule. Questo ceppo di topo transgenico ci permette di visualizzare nuclei-EGFP e membrana con tdTomato senza eccitazione Cre. Due femmine (R26R-GR )eun topo transgenico maschio (mT-mG)sono state allevate insieme per produrre topi sufficienti per gli esperimenti. In questo studio sono stati utilizzati la loro prole con R26R-GR—;mT-mG-/- genotipo, un doppio ceppo di topi fluorescenti. Rispetto a una linea di topo fluorescente come descrittoin precedenza 9,10, questo ceppo di topo a doppio reporter fluorescente ci fornisce un 50% di acquisizione ridotta del tempo di imaging.
In questo lavoro, descriviamo un protocollo tecnico dettagliato per l’imaging in vivo della superficie oculare in modo passo-passo utilizzando la nostra piattaforma di imaging e i topi transgenici a doppia fluorescente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa piattaforma di imaging MPM personalizzata con un software di controllo è stata utilizzata per l’imaging intravitale degli organi epiteliali del topo, tra cuila pelle 10, il follicolopilifero 10 e la superficie oculare9,10 (Figura 1A). Il sistema su base su base è stato utilizzato per la sua flessibilità nel cambiare i componenti ottici per vari esperimenti, fin dall’inizio del…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il sostegno del Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) e Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1622, CMRPG3G1622).
Materials
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36 | |
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
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