Una plataforma de microscopía multifoto personalizada para imágenes en vivo de cornea de ratón y conjuntiva
Summary
Aquí se presenta una plataforma microscópica multifoto para imágenes de superficie ocular de ratón en vivo. El ratón fluorescente transgénico permite la visualización de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nerviosas y capilares dentro de la superficie ocular. Las señales no lineales de segunda generación armónica derivadas de estructuras de collagenounous proporcionan imágenes sin etiquetas para arquitecturas estromales.
Abstract
El análisis histológico convencional y los sistemas de cultivo celular son insuficientes para simular completamente la dinámica fisiológica y patológica in vivo. La microscopía multifototónica (MPM) se ha convertido en una de las modalidades de imagen más populares para el estudio biomédico a niveles celulares in vivo, las ventajas incluyen alta resolución, penetración profunda de tejido y fototoxicidad mínima. Hemos diseñado una plataforma de imágenes MPM con un soporte de ojo de ratón personalizado y una etapa estereotáctica para la imagen de la superficie ocular in vivo. El ratón reportero de proteínas fluorescentes duales permite la visualización de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nerviosas y capilares dentro de la superficie ocular. Además de las señales de fluorescencia multifoto, la adquisición de la segunda generación armónica (SHG) permite simultáneamente la caracterización de la arquitectura estromal colagenosa. Esta plataforma se puede emplear para imágenes intravitales con posicionamiento preciso en toda la superficie ocular, incluyendo córnea y conjuntiva.
Introduction
Las estructuras de la superficie ocular, incluyendo la córnea y la conjuntiva, protegen otros tejidos oculares más profundos de alteraciones externas. La córnea, la parte frontal transparente del ojo, funciona tanto como una lente refractiva para dirigir la luz hacia el ojo y como una barrera protectora. El epitelio corneal es la capa más externa de la córnea y consiste en distintas capas de células superficiales, células de las alas y células basales. El estroma corneal se compone de lamelas de colágeno sofisticadamente empacadas incrustadas con queratocitos. El endotelio corneal, una sola capa de células hexagonales planas, tiene un papel importante en el mantenimiento de la transparencia de la córnea manteniendo el estroma corneal en un estado relativamente deshidratado a través de sus funciones de bombeo1. Limbus forma el borde entre la córnea y la conjuntiva, y es el reservorio de células madre epiteliales corneales2. La conjuntiva altamente vascularizada ayuda a lubricar los ojos produciendo moco y lágrimas3.
La dinámica celular de las estructuras de la superficie corneal se estudia convencionalmente mediante análisis histológicos o cultivo celular in vitro, que podría no simular adecuadamente la dinámica celular in vivo. Por lo tanto, un enfoque de imágenes en vivo no invasivo puede salvar tal brecha. Debido a sus ventajas, que incluyen alta resolución, fotodatajo mínimo y profundidad de imagen más profunda, MPM se ha convertido en una poderosa modalidad en diversas áreas de investigación biológica4,,5,,6,,7,,8. Para las imágenes corneales, MPM proporciona información celular a partir de autofluorescencia intrínseca derivada de la NAD(P)H intracelular. Las señales de segunda generación armónica (SHG) derivadas de las fibras de colágeno no centrosimétricas tipo I bajo escaneo láser de femtosegundo proporcionan estructuras estromales collagenosas sin procedimientos de tinción adicionales9. Anteriormente, nosotros y otros grupos hemos explotado MPM para la toma de imágenes de córneas animales y humanas9,,10,,11,,12,,13,,14,,15.
Líneas transgénicas de ratón que exhiben proteínas fluorescentes en poblaciones celulares específicas se han utilizado ampliamente para diversos estudios en biología celular, incluyendo el desarrollo, homeostasis de tejido, regeneración de tejidos, y carcinogénesis. Utilizamos cepas transgénicas de ratón etiquetadas con proteínas fluorescentes para la toma de imágenes in vivo de córneas9,10, folículos pilosos10 y epidermis10 por MPM. La tensión fluorescente doble con membrana celular etiquetada con tdTomato y núcleo celular etiquetado con EGFP se cría a partir de dos cepas de ratón: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 y mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EG,#007676)17. La línea de ratón transgénico R26R-GR contiene construcciones de reportero de proteínas fluorescentes duales, incluyendo un gen de fusión H2B-EGFP y un gen de fusión de señal de anclaje mCherry-GPI, insertado en el locus Gt (ROSA)26Sor. La cepa transgénica mT-mG es un tdTomato dirigido a la membrana celular y ratones Cre-reporter fluorescentes EGFP. Antes de la recombinación de Cre, la proteína de membrana celular con expresión de fluorescencia tdTomato está ampliamente presente en varias células. Esta cepa de ratón transgénica nos permite visualizar núcleos-EGFP y membrana con tdTomato sin excitación Cre. Dos hembras (R26R-GR+/+) y un macho (mT-mG+/+) se criaron juntas para producir suficientes ratones para experimentos. Su descendencia con R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotipo, una cepa de ratones fluorescentes duales, se utilizaron en este estudio. En comparación con una línea de ratón reportero fluorescente como se describió anteriormente9,10, esta tensión de ratón reportero fluorescente doble nos proporciona una adquisición de 50% menos de tiempo de imagen.
En este trabajo, describimos un protocolo técnico detallado para la toma de imágenes in vivo de la superficie ocular de una manera paso a paso utilizando nuestra plataforma de imágenes y ratones transgénicos fluorescentes duales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta plataforma de imágenes MPM personalizada con un software de control se utilizó para la toma de imágenes intravitales de órganos epiteliales de ratón, incluyendo la piel10,el folículo piloso10 y la superficie ocular9,,10 (Figura 1A). El sistema personalizado se utilizó por su flexibilidad en el cambio de los componentes ópticos para varios experimentos, desde el comienzo de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo de las subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), Hospital Universitario Nacional de Taiwán (NTUH108-T17) y Chang Gung Memorial Hospital, Taiwán (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).
Materials
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36 | |
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
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