هنا هو منصة مجهرية متعددة الصور للتصوير حية سطح العين الماوس. الماوس الفلوري المحورة تمكن من تصور نواة الخلية، أغشية الخلية، والألياف العصبية والشعيرات الدموية داخل سطح العين. توفر إشارات الجيل التوافقي الثاني غير الخطي المشتقة من الهياكل الكولاجينية تصويرًا خاليًا من التسمية لبنيات ال stromal.
التحليل النسيجي التقليدي ونظم زراعة الخلايا غير كافية لمحاكاة في الحركية الفسيولوجية والمرضية تماما. أصبح المجهر متعدد الصور (MPM) واحدة من أكثر طرائق التصوير شعبية لدراسة الطب الحيوي في المستويات الخلوية في الجسم الحي، وتشمل مزايا عالية الدقة، اختراق الأنسجة العميقة والحد الأدنى من السمية الضوئية. لقد قمنا بتصميم منصة تصوير MPM مع حامل عين الماوس المخصصة ومرحلة ستيريو لسطح العين التصوير في الجسم الحي. يتيح الماوس ثنائي البروتين الفلوري تصور نواة الخلية وأغشية الخلايا والألياف العصبية والشعيرات الدموية داخل سطح العين. بالإضافة إلى إشارات الفلورس متعددة الصور، واكتساب الجيل التوافقي الثاني (SHG) يسمح في وقت واحد لتوصيف بنية السترومال الكولاجينية. يمكن استخدام هذه المنصة للتصوير داخل الرحم مع تحديد المواقع الدقيقة عبر سطح العين بأكمله، بما في ذلك القرنية والملتحمة.
تحمي هياكل سطح العين، بما في ذلك القرنية والملتحمة، الأنسجة الأخرى الأعمق من الاضطرابات الخارجية. تعمل القرنية، الجزء الأمامي الشفاف للعين، كعدسة انكسارية لتوجيه الضوء إلى العين وكحاجز وقائي. ظهارة القرنية هي الطبقة الخارجية من القرنية وتتكون من طبقات متميزة من الخلايا السطحية وخلايا الجناح والخلايا القاعدية. يتكون القرنية ستروما من اللامي كولاجينوسي معبأة متطورة جزءا لا يتجزأ من القرنية. إن بطانة القرنية، وهي طبقة واحدة من الخلايا سداسية مسطحة، لها دور مهم في الحفاظ على شفافية القرنية من خلال الحفاظ على السترما القرنية في حالة جفاف نسبي من خلال وظائف الضخ1. ليفوس يشكل الحدود بين القرنية والملتحمة، وهو خزان الخلايا الجذعية الظهارية القرنية2. تساعد الملتحمة الوعائية العالية على تليين العينين عن طريق إنتاج المخاط والدموع3.
تتم دراسة ديناميات الخلايا في هياكل سطح القرنية بشكل تقليدي إما عن طريق التحليل النسيجي أو في زراعة الخلايا في المختبر ، والتي قد لا تحاكي بشكل كاف ديناميات الخلايا الحية. وبالتالي، فإن نهج التصوير الحي غير الغازي يمكن أن يسد هذه الفجوة. نظرا لمزاياها، والتي تشمل دقة عالية، والحد الأدنى من الصور وعمق عمق التصوير، MPM أصبحت طريقة قوية في مجالات مختلفة من البحوث البيولوجية4،5،6،7،8. بالنسبة لتصوير القرنية، توفر MPM معلومات خلوية من الفلورا الذاتية الجوهرية المستمدة من NAD (P)H داخل الخلايا. الجيل التوافقي الثاني (SHG) إشارات المستمدة من نوع غير centrosymmetric أنا ألياف الكولاجين تحت femtosecond ليزر المسح يوفر هياكل السترومال الكولاجين دون إجراءات تلطيخ إضافية9. في السابق، ونحن وغيرها من الجماعات قد استغلت MPM لتصوير القرنيات الحيوانية والبشرية9،10،11،12،13،14،15.
خطوط الماوس المعدلة وراثيا عرض البروتينات الفلورية في مجموعات خلايا محددة وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسات مختلفة في بيولوجيا الخلية, بما في ذلك التنمية, الأنسجة التوازن, تجديد الأنسجة, وتولد السرطان. استخدمنا سلالات الماوس المعدلة وراثيا وصفت مع البروتينات الفلورية لفي التصوير في مجال المعلومات الحية من القرنيات9،10، بصيلات الشعر10 والبشرة10 بواسطة MPM. يتم تربيت سلالة الماوس الفلورية المزدوجة مع غشاء الخلية المسمى مع tdTomato ونواة الخلية الموسومة مع EGFP من سلالات الماوس اثنين: R26R-GR (B6؛ 129-gt (روزا) 26Sortm1Ytchn/J،#021847)16 وmT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP،#007676) 17. يحتوي خط الماوس المعدل وراثيا R26R-GR على ثنائية الفلورسنت البروتين مراسل ينبني، بما في ذلك الجينات الانصهار H2B-EGFP ومشري-GPI مرساة مرساة مرساة الجينات الانصهار إشارة، إدراجها في gt (روزا) 26Sor locus. سلالة mT-mG المعدلة وراثيا هي tdTomato غشاء الخلية المستهدفة وGFP الفئران الفلورسنت كري مراسل. قبل إعادة الكومبينيشن Cre، بروتين غشاء الخلية مع tdTomato التعبير المفلور موجود على نطاق واسع في مختلف الخلايا. هذه السلالة الماوس المعدلة وراثيا تمكننا من تصور nuclei-EGFP والغشاء مع tdTomato دون الإثارة Cre. ولدت اثنين من الإناث (R26R-GR+/+) و ذكر واحد (mT-mG+/+)الماوس المعدل وراثيا معا لإنتاج فئران كافية للتجارب. ذريتهم مع R26R-GR+/-mT-mG+/- النمط الجيني، سلالة الفئران الفلورية المزدوجة، استخدمت في هذه الدراسة. بالمقارنة مع واحد الفلورسنت خط الماوس مراسل كما هو موضح سابقا9،10، وهذا مزدوج الفلورسنت المصابيح الماوس سلالة يوفر لنا 50 ٪ تخفيض الحصول على وقت التصوير.
في هذا العمل، نحن وصف بروتوكول تقني مفصل للتصوير في الجسم الحي من سطح العين بطريقة خطوة بخطوة باستخدام منصة التصوير لدينا والفئران المعدلة وراثيا الفلورسنت المزدوج.
تم استخدام هذه المنصة التصويرية MPM المبنية خصيصًا مع برنامج تحكم للتصوير داخل الرحم للأعضاء الظهارية للماوس ، بما في ذلك الجلد10، بصيلات الشعر10 وسطح العين9،10 (الشكل 1A). تم استخدام النظام المصنوع خصيصًا لمرونته في تغ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر دعم المنحة من وزارة العلوم والتكنولوجيا، تايوان (106-2627-M-002-034، 107-2314-B-182A-089، 108-2628-B-002-023، 108-2628-B-002-023)، مستشفى جامعة تايوان الوطنية (NTUH108-T17) ومستشفى تشانغ جونج التذكاري، تايوان (CMRPG3G1621، CMRPG3G1622، CMRPG3G1623).
AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36 | |
Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
Zoletil | Virbac | VR-2831 |