Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva

doi: 10.3791/60944 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Hier gepresenteerd is een multiphoton microscopisch platform voor live muis oculaire oppervlakte beeldvorming. Fluorescerende transgene muis maakt de visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels en haarvaten binnen het oculaire oppervlak mogelijk. Niet-lineaire tweede harmonische generatie signalen afgeleid van collageen structuren bieden label-vrije beeldvorming voor stromal architecturen.

Abstract

Conventionele histologische analyse- en celkweeksystemen zijn onvoldoende om in vivo fysiologische en pathologische dynamiek volledig te simuleren. Multiphoton microscopie (MPM) is uitgegroeid tot een van de meest populaire beeldvorming modaliteiten voor biomedische studie op cellulaire niveaus in vivo, voordelen zijn hoge resolutie, diepe weefsel penetratie en minimale fototoxiciteit. We hebben een MPM imaging platform ontworpen met een aangepaste muis ooghouder en een stereotaxic fase voor beeldvorming oculair oppervlak in vivo. Dubbele fluorescerende eiwit reporter muis maakt visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels, en haarvaten binnen het oculaire oppervlak. Naast multifoton fluorescentie signalen, het verwerven van de tweede harmonische generatie (SHG) tegelijkertijd zorgt voor de karakterisering van collageen stromal architectuur. Dit platform kan worden gebruikt voor intravital imaging met nauwkeurige positionering over het gehele oculaire oppervlak, inclusief hoornvlies en bindvlies.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De oculaire oppervlaktestructuren, waaronder het hoornvlies en het bindvlies, beschermen andere diepere oculaire weefsels tegen externe verstoringen. Het hoornvlies, het transparante voorste deel van het oog, functioneert zowel als een brekingslens voor het richten van licht in het oog als als een beschermende barrière. Corneal epitheel is de buitenste laag van het hoornvlies en bestaat uit verschillende lagen van oppervlakkige cellen, vleugelcellen en basale cellen. Corneal stroma bestaat uit verfijnd verpakt collageen lamellen ingebed met keratocyten. Hoornvlies endotheel, een enkele laag van platte zeshoekige cellen, heeft een belangrijke rol in het behoud van de transparantie van het hoornvlies door het houden van hoornvlies stroma in een relatief uitgedroogde toestand door middel van haar pompen functies1. Limbus vormt de grens tussen het hoornvlies en het bindvlies, en is het reservoir van hoornvlies epitheelstamcellen2. Het sterk vasculaire bindvlies helpt om de ogen te smeren door slijm en tranen te produceren3.

Celdynamica van de hoornvliesoppervlaktestructuren worden conventioneel bestudeerd door histologische analyse of in vitrocelcultuur, die de in vivo celdynamiek mogelijk niet voldoende simuleert. Een niet-invasieve live imaging benadering kan dus de kloof overbruggen. Door de voordelen, waaronder hoge resolutie, minimale fotoschade en diepere beeldvormingsdiepte, is MPM een krachtige modaliteit geworden op diverse gebieden van biologisch onderzoek4,5,6,7,8. Voor hoornvliesbeeldvorming biedt MPM cellulaire informatie uit intrinsieke autofluorescentie afkomstig van de intracellulaire NAD(P)H. Tweede harmonische generatie (SHG) signalen afgeleid van de niet-centrosymmetrische type I collageen vezels onder femtosecond laser scanning biedt collageen stromal structuren zonder extra kleuring procedures9. Voorheen hebben wij en andere groepen MPM uitgebuit voor beeldvorming van dier- en menselijke hoornvliezen9,10,11,12,13,14,15.

Transgene muislijnen die fluorescerende eiwitten vertonen in specifieke celpopulaties zijn op grote schaal gebruikt voor verschillende studies in de celbiologie, waaronder ontwikkeling, weefselhomeostase, weefselregeneratie en carcinogenese. We gebruikten transgene muizenstammen gelabeld met fluorescerende eiwitten voor in vivo beeldvorming van hoornvliezen9,10, haarzakjes10 en opperhuid10 door MPM. De dubbele fluorescerende muisstam met celmembraan gelabeld met tdTomato en celkern gelabeld met EGFP is gefokt uit twee muisstammen: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 en mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgene muis lijn bevat een dubbele fluorescerende eiwit reporter constructies, met inbegrip van een H2B-EGFP fusie gen en mCherry-GPI anker signaal fusie gen, ingevoegd in de GT (ROSA)26Sor locus. De mT-mG transgene stam is een celmembraan-gerichte tdTomato en EGFP fluorescerende Cre-reporter muizen. Voorafgaand aan Cre recombinatie, celmembraan eiwit met tdTomato fluorescentie expressie is op grote schaal aanwezig in verschillende cellen. Deze transgene muisstam stelt ons in staat om kernen-EGFP en membraan te visualiseren met tdTomato zonder Cre excitatie. Twee vrouwtjes (R26R-GR+/+) en één mannelijke (mT-mG+/+) transgene muis werden samen gekweekt om voldoende muizen te produceren voor experimenten. Hun nakomelingen met R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotype, een dubbele fluorescerende muizensoort, werden in deze studie gebruikt. Vergeleken met een fluorescerende reporter muis lijn zoals eerder beschreven9,10, deze dubbele fluorescerende reporter muis stam biedt ons een 50% verminderde verwerving van beeldvorming tijd.

In dit werk beschrijven we een gedetailleerd technisch protocol voor in vivo beeldvorming van het oculaire oppervlak stapsgewijze wijze met behulp van ons imagingplatform en dubbele fluorescerende transgene muizen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de National Taiwan University en Chang Gung Memorial Hospital.

1. Multiphoton microscopie setup

  1. Bouw een systeem op basis van een rechtopstaande microscoop met wateronderdompeling 20x 1,00 NA doelstelling(figuur 1A).
  2. Gebruik Ti: Sapphire laser (met tunable golflengte) als de excitatiebron. Stel de golflengte van de laseroutput in op 880 nm voor EGFP en 940 nm voor tdTomato (figuur 1A).
  3. Neem twee dichroïsche spiegels (495 nm en 580 nm) op voor de scheiding van SHG/EGFP en EGFP/tdTomato (figuur 1A). Spectrally scheiden de SHG signalen, EGFP en tdTomato door bandpass filters 434/17nm, 510/84nm en 585/40nm (Figuur 1A).
  4. Om de beeldkwaliteit te optimaliseren en fotobleaching en weefselschade te voorkomen, stelt u de laserkracht in op ongeveer 35 mW voor beeldvormingsmalies en 50 mW voor limbus. Meet de laserkracht voordat de laser het optische systeem passeert. De exacte laser kracht op monsters is ongeveer 8-9 mW. Het volledige microscopische ontwerp is te zien in figuur 1A.
    OPMERKING: De bovengrens van laservermogen is ingesteld op 70 mW om fotobleken en weefselschade te voorkomen.

2. Voorbereiding van dieren op levende beeldvorming

  1. Gebruik 8-12 weken oude muizen voor het experiment. Intramusculair injecteren 50-80 mg/kg tiletamine HCl en zolazepam HCl voor algemene anesthesie. Controleer op het gebrek aan reactie op terugtrekking reflex door knijpen een teen. Voldoende verdovendering is belangrijk om een stabiele ademhalingsfrequentie monitoring mogelijk te maken.
    OPMERKING: Muizen op de leeftijd van 8 weken of ouder worden aanbevolen omdat hun oogbollen gerijpt zijn.
  2. Plaats de muis onder anesthesie op een verwarmd podium en steek de temperatuur monitoring sonde in de anus.
    LET OP: De sonde moet volledig in de anale holte worden geplaatst zonder blootstelling aan de lucht, om oververhitting van de kachel en inductie van een zonnesteek te voorkomen.

3. Ooghouden voor live beeldvorming van het oculaire oppervlak

  1. Voor live beeldvorming van het oculaire oppervlak, gebruik maken van de op maat ontworpen stereotaxic muishouder bestaande uit twee delen: een hoofdhouder om het hoofd te stabiliseren en een ooghouder om de oogleden in te trekken en bloot het gehele oculaire oppervlak (Figuur 1B-D).
  2. Steek de oorbalken in de externe auditieve meatus en houd de driepuntsfixatie van de hoofdhouder aan(figuur 1B,D).
  3. Breng lokaal een oplossing van 0,4% oxybuprocaine hydrochloride in zout en laat het gedurende 3 minuten om het oculaire oppervlak te verdoven.
  4. Zorg ervoor dat de oogbol wordt uitgestoken door de juiste handmatige ooglid intrekking. Anders kunnen ischemie en bloedingen van de oogbol optreden.
  5. Plaats voorzichtig een lus van de polyethyleenbuis van ooghouder langs de ooglidmarge om het oculaire oppervlak bloot te leggen. Stabiliseer de oogbol met de ooghouder samengesteld uit een No. 5 Dumont tang met zijn tips bedekt met de lus van polyethyleen buis (Figuur 1C, D).
  6. Schroef tangen met behulp van een knop in distale tangen van ooghouder om de oogbol stabiel te houden(Figuur 1D).
  7. Breng een ooggel aan met de brekingsindex van 1.338 op het hoornvliesoppervlak als onderdompelingsmedium om het vocht van het oculaire oppervlak elk uur te behouden. Bovendien, regelmatige toepassing van de ooggel elk uur voorkomen vertroebeling in het hoornvlies tijdens de beeldvorming.
  8. Draai de oogbol met de houder die vergrendeld op de stepper-gemotoriseerde podium voor beeldvorming over het gehele hoornvlies oppervlak van het centrale hoornvlies naar de perifere regio (Figuur 1C, D).
    LET OP: Zowel overtollige als onvoldoende hoeveelheden ooggel kunnen de kwaliteit van beelden tijdens de beeldvorming beïnvloeden. Daarom is het belangrijk om het oppervlak elk uur aan te vullen om het oppervlak regelmatig vochtig te houden voor beeldvorming.

4. Z-serieel beeldacquisitie

OPMERKING: Stel de eerste en laatste dia in elke stapel in om de bewegende artefacten te verminderen.

  1. Voordat u de foto's maakt, maakt u het doelveld met een kwiklichtbron in beeld.
  2. Klik op het symbool van de microscoopsoftware om de software in te schakelen.
  3. Selecteer de juiste PMT-versterking en digitale versterking om de cellulaire structuur in het oculaire oppervlak te visualiseren.
  4. Stel de eerste dia en de laatste dia in om een stapel te verwerven.
  5. Voer numerieke waarden in voor beeldresolutie en z-step, bijvoorbeeld 512 x 512 en 1 μm als z-stap.
  6. Klik op de startknop om z-serieafbeeldingen te verzamelen.
  7. Verzamel twee maal live beelden in hetzelfde gebied, eerst bij 880 nm excitatie voor SHG/EGFP-signalenverzameling en tweede bij 940 nm excitatie voor EGFP/tdTomato-signalenverzameling.
    OPMERKING: De combinatie van twee stapels biedt 3 kanalen beelden. De beeldresolutie en scanformaat waren respectievelijk 512 x 512 pixels en 157 μm x157 μm.

5. Beeldverwerking en 3D-reconstructie

  1. Laad de z-seriële afbeeldingen in Fiji software18.
  2. Selecteer het Plug-Median 3D-filter in Fiji om achtergrondgeluiden te verminderen.
  3. Selecteer het filter Onscherp masker voor pakketten in Fiji om de afbeeldingen te verscherpen.
  4. Klik op' Automatisch'in helderheid/contrast om automatisch de kwaliteit van afbeeldingen te optimaliseren.
  5. Sla de afbeeldingen op als beeldsequenties om de z-seriële afbeeldingen te kunnen exporteren.
  6. Laad z-seriële afbeeldingen in commerciële software (bijvoorbeeld Avizo lite) voor 3D-reconstructie met behulp van volumeweergave.
  7. In alle MPM-afbeeldingen worden respectievelijk EGFP-, tdTomato- en SHG-signalen in pseudo-groene, rode en cyaankleur aanwezig.
  8. Leg 3D-structuurfoto's vast aan de momentopname.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Met behulp van dit live imaging platform kan het muisoculaire oppervlak op cellulair niveau worden gevisualiseerd. Om individuele enkele cellen in het oculaire oppervlak te visualiseren, gebruikten we de dubbele fluorescerende transgene muizen met EGFP uitgedrukt in de kern en tdTomato uitgedrukt in het celmembraan. De collageen-rijke hoornvlies stroma werd benadrukt door SHG signalen.

In hoornvlieseptheel werden oppervlakkige cellen, vleugelcellen en basale cellen(figuur 2)gevisualiseerd. In de dubbele fluorescerende transgene muizen konden we enkele cellen van de basale laag in kaart brengen tot de oppervlakkige lagen in zowel hoornvlies- als limbeeleptheel(figuur 2). De zeshoekige oppervlakkige cellen werden waargenomen (witte pijlpunt in figuur 2). Zowel de nucleaire grootte als de interne afstand van de basale laag naar de buitenste lagen verhoogden in hoornvlieseptheel(figuur 2). De cytoplasmatische signalen van tdTomato fluorescentie gaven aan dat het membraan eiwitrijke intracellulaire vesiculaire systeem, met inbegrip van het Golgi-apparaat, endoplasmisch reticulum, verspreid was in de vleugelcellen (figuur 2).

Binnen de collageen stroma, de stellatische-vormige keratocyten werden geschetst door het membraan-gericht tdTomato fluorescentie in dubbele fluorescerende transgene muizen (gele pijlpunt in figuur 3 en figuur 4). De keratocyten ingebed in het collageen stroma waren meer los verdeeld dan de endotheelcellen. Bovendien werden dunne vertakkingszenuwen in hoornvliesstroma ook gevisualiseerd door membraan-gerichte tdTomato-signalen (witte pijlpunt in figuur 3). Monolaag van hoornvlies endotheelcellen toonde een relatief homogene zeshoekige vorm verbonden met een honinggekamd patroon (witte pijlpunt in figuur 4). Het limbale epitheel bestond uit 1-2 lagen epitheliale cellen (figuur 5). De dubbele fluorescerende reporter transgene muis stam stelde ons ook in staat om het beeld van de haarvaten binnen conjunctiva (Figuur 6A). 3D-architectuur van haarvaten werd gereconstrueerd door het schetsen van vasculair endotheel (Figuur 6B,6C).

Figure 1
Figuur 1: De installatie van MPM en roterende muishouder.
(A) De opzet van de MPM. (B) Het ontwerp van de muishouder. De muishouder bestaat uit een roterende hoofdhouder en een ooghouder. (C) Het ontwerp van de ooghouder van de muis. De ooghouder trekt oogleden in door een plastic lus om het hoornvlies en bindvlies bloot te leggen. De hoofdhouder en de ooghouder worden op het podium aan elkaar geschroefd (B) om een nauwkeurige en controleerbare rotatie en beeldvorming van het oculaire oppervlak mogelijk te maken. (D) Foto van levende muis voor hoornvliesbeeldvorming met ooghouder. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Live beeldvorming van hoornvlieseptheel bij dubbele fluorescerende transgene muizen.
Corneal epitheel werd laag voor laag afgebeeld, met oppervlakkige cellen, vleugelcellen en basale cellen. Oppervlakkige cellen zijn gemarkeerd met een witte pijlpunt. Schaalbalk = 50 μm. (Z = diepte vanaf het bovenste oppervlak van epitheel (μm)). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Live beeldvorming van het hoornvlies stroma.
Binnen de hoornvliesstroma, de keratocyten (gele pijlpunt) en de zenuwvezels (witte pijlpunt) werden ingebed in de collageen stroma (in pseudo-blauwe kleur). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Live beeldvorming van hoornvlies endotheel in het centrale hoornvlies.
Monolaag van zeshoekige hoornvlies endotheelcellen (witte pijlpunt). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Live beeldvorming van limbale epitheel.
Levende beelden van het limbale epitheel bij dubbele fluorescerende transgene muizen toonden vacuolated kernen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Live imaging en de driedimensionale reconstructie van het vasculaire netwerk in conjunctiva.
(A) Haarvaten in conjunctival stroma werden gevisualiseerd. Schaalbalk = 50 μm. (B) 3D-reconstructie van capillaire netwerken uitgevoerd met behulp van een commerciële software. Schaalbalk = 50 μm. (C,D) Vergroot 3D weergaven van de afbeelding weergegeven in paneel B. Fluorescerende vasculaire endotheelcellen schetsten de haarvaten (witte en gele pijlpunten). Schaalbalk voor paneel C = 6,26 μm en voor paneel D = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit op maat gemaakte MPM imaging platform met een besturingssoftware werd gebruikt voor intravital imaging van muis epitheelorganen, waaronder huid10,haarzakje10 en oculair oppervlak9,10 (Figuur 1A). Het op maat gemaakte systeem werd gebruikt voor zijn flexibiliteit in het veranderen van de optische componenten voor verschillende experimenten, sinds het begin van ons project. Deze beeldmethodologie is veelzijdig voor commerciële MPM-producten. Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor intravital imaging van het muisoculaire oppervlak door MPM imaging platform. Met behulp van een stereotaxic muishouder (Figuur 1B),waren we in staat om verschillende regio's te visualiseren over het hele oculaire oppervlak. De nauwkeurige positioneringsmogelijkheid maakt het mogelijk om temporele celdynamische veranderingen in een bepaald gebied te controleren.

Hoewel verschillende studies van murine hoornvlies MPM imaging zijn gemeld in vivo19,20,21,22, zijn er verschillende technische beperkingen die men moet overwinnen om continue beeldvorming te bereiken over een lange periode bijvoorbeeld, het houden van de oogbol in een stabiele positie, afnemende beweging artefacten tijdens beeldvorming en het verwerven van de beelden voor een lange periode zonder fotobleaching. Vergeleken met de plastic eyecup ontworpen voor hoornvlies beeldvorming in vivo met relatief beperkte toegang tot het oogoppervlak20,onze ooghouder houdt niet alleen de oogbol volledig blootgesteld, maar maakt ook het gehele oculaire oppervlak toegankelijk voor de objectieve lens(Figuur 1C).

Hoewel vitale kleurstoffen of sondes routinematig worden gebruikt als fluorescerende verslaggevers om cellen20,21,,22te labelen, kan de invasieve werking van naaldinjectie de natuurlijke celdynamiek van organen verstoren tijdens het fysiologische homeostatische toestand of weefselregeneratieproces. R26R-GR transgene muizen stam drukt stabiele en felgroene fluorescerende eiwitten in de celkern en is gebruikt voor de visualisatie van de celdynamiek van spierverervers in spookvezels23. mT-mG reporter transgene muislijn werd gebruikt om de differentiatie van epidermale cellen inhomeostase24te analyseren. Vergeleken met een enkele reporter fluorescerende transgene muislijn, deze dubbele fluorescerende transgene muis stam verminderde de tijd van beeld verwerving tot de helft door tegelijkertijd het verstrekken van de celstructuur informatie van zowel celkernen en celmembranen. Door het draaien van de muishouder werden platte kernen van zowel endotheel als bloedcellen in het vasculaire lumen gevisualiseerd met behulp van dubbele fluorescerende transgene muisstam(figuur 6). Daarom kan deze transgene muislijn worden gebruikt om de celdynamiek van haarvaten in de toekomst te onderzoeken, wat de sleutel is tot de pathologische hoornvlies neovascularisatie. Bovendien kan dit in vivo beeldvormingsplatform ook worden gebruikt om immuunreacties in hoornvliespathologieën te verkennen door fluorescerende etikettering van verschillende immuuncellen, zoals neutrofielen25, langerhanscellen26, regulerende T-cellen (Tregs)27 en mastcellen28.

Tot slot hebben we een krachtig intravital MPM-beeldvormingsplatform voor muisoculairoppervlak aangetoond. De combinatie van live MPM stereotaxic stadium en speciale fluorescerende transgene muizen maakt real-time visualisatie van verschillende cellulaire en extracellulaire structuren in het oculaire oppervlak, met inbegrip van hoornvlies, limbus en conjunctiva. Dit intravital imaging platform kan helpen om de celdynamiek van het oculaire oppervlak te verkennen en, met verdere ontwikkeling, kan potentieel worden gebruikt voor oogheelkundige drug screening in de toekomst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Wij danken de subsidie van het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) en Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRP3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37, (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, Pt 2 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, Pt 2 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352, (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19, (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20, (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12, (2), 024013 (2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2, (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48, (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91, (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7, (9), 46171 (2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18, (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23, (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135, (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191, (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, (6), 973-984 (2011).
Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).More

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter