Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva
Summary
Hier gepresenteerd is een multiphoton microscopisch platform voor live muis oculaire oppervlakte beeldvorming. Fluorescerende transgene muis maakt de visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels en haarvaten binnen het oculaire oppervlak mogelijk. Niet-lineaire tweede harmonische generatie signalen afgeleid van collageen structuren bieden label-vrije beeldvorming voor stromal architecturen.
Abstract
Conventionele histologische analyse- en celkweeksystemen zijn onvoldoende om in vivo fysiologische en pathologische dynamiek volledig te simuleren. Multiphoton microscopie (MPM) is uitgegroeid tot een van de meest populaire beeldvorming modaliteiten voor biomedische studie op cellulaire niveaus in vivo, voordelen zijn hoge resolutie, diepe weefsel penetratie en minimale fototoxiciteit. We hebben een MPM imaging platform ontworpen met een aangepaste muis ooghouder en een stereotaxic fase voor beeldvorming oculair oppervlak in vivo. Dubbele fluorescerende eiwit reporter muis maakt visualisatie van celkernen, celmembranen, zenuwvezels, en haarvaten binnen het oculaire oppervlak. Naast multifoton fluorescentie signalen, het verwerven van de tweede harmonische generatie (SHG) tegelijkertijd zorgt voor de karakterisering van collageen stromal architectuur. Dit platform kan worden gebruikt voor intravital imaging met nauwkeurige positionering over het gehele oculaire oppervlak, inclusief hoornvlies en bindvlies.
Introduction
De oculaire oppervlaktestructuren, waaronder het hoornvlies en het bindvlies, beschermen andere diepere oculaire weefsels tegen externe verstoringen. Het hoornvlies, het transparante voorste deel van het oog, functioneert zowel als een brekingslens voor het richten van licht in het oog als als een beschermende barrière. Corneal epitheel is de buitenste laag van het hoornvlies en bestaat uit verschillende lagen van oppervlakkige cellen, vleugelcellen en basale cellen. Corneal stroma bestaat uit verfijnd verpakt collageen lamellen ingebed met keratocyten. Hoornvlies endotheel, een enkele laag van platte zeshoekige cellen, heeft een belangrijke rol in het behoud van de transparantie van het hoornvlies door het houden van hoornvlies stroma in een relatief uitgedroogde toestand door middel van haar pompen functies1. Limbus vormt de grens tussen het hoornvlies en het bindvlies, en is het reservoir van hoornvlies epitheelstamcellen2. Het sterk vasculaire bindvlies helpt om de ogen te smeren door slijm en tranen te produceren3.
Celdynamica van de hoornvliesoppervlaktestructuren worden conventioneel bestudeerd door histologische analyse of in vitrocelcultuur, die de in vivo celdynamiek mogelijk niet voldoende simuleert. Een niet-invasieve live imaging benadering kan dus de kloof overbruggen. Door de voordelen, waaronder hoge resolutie, minimale fotoschade en diepere beeldvormingsdiepte, is MPM een krachtige modaliteit geworden op diverse gebieden van biologisch onderzoek4,5,6,7,8. Voor hoornvliesbeeldvorming biedt MPM cellulaire informatie uit intrinsieke autofluorescentie afkomstig van de intracellulaire NAD(P)H. Tweede harmonische generatie (SHG) signalen afgeleid van de niet-centrosymmetrische type I collageen vezels onder femtosecond laser scanning biedt collageen stromal structuren zonder extra kleuring procedures9. Voorheen hebben wij en andere groepen MPM uitgebuit voor beeldvorming van dier- en menselijke hoornvliezen9,10,11,12,13,14,15.
Transgene muislijnen die fluorescerende eiwitten vertonen in specifieke celpopulaties zijn op grote schaal gebruikt voor verschillende studies in de celbiologie, waaronder ontwikkeling, weefselhomeostase, weefselregeneratie en carcinogenese. We gebruikten transgene muizenstammen gelabeld met fluorescerende eiwitten voor in vivo beeldvorming van hoornvliezen9,10, haarzakjes10 en opperhuid10 door MPM. De dubbele fluorescerende muisstam met celmembraan gelabeld met tdTomato en celkern gelabeld met EGFP is gefokt uit twee muisstammen: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J, #021847)16 en mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR transgene muis lijn bevat een dubbele fluorescerende eiwit reporter constructies, met inbegrip van een H2B-EGFP fusie gen en mCherry-GPI anker signaal fusie gen, ingevoegd in de GT (ROSA)26Sor locus. De mT-mG transgene stam is een celmembraan-gerichte tdTomato en EGFP fluorescerende Cre-reporter muizen. Voorafgaand aan Cre recombinatie, celmembraan eiwit met tdTomato fluorescentie expressie is op grote schaal aanwezig in verschillende cellen. Deze transgene muisstam stelt ons in staat om kernen-EGFP en membraan te visualiseren met tdTomato zonder Cre excitatie. Twee vrouwtjes (R26R-GR+/+) en één mannelijke (mT-mG+/+) transgene muis werden samen gekweekt om voldoende muizen te produceren voor experimenten. Hun nakomelingen met R26R-GR+/-;mT-mG+/- genotype, een dubbele fluorescerende muizensoort, werden in deze studie gebruikt. Vergeleken met een fluorescerende reporter muis lijn zoals eerder beschreven9,10, deze dubbele fluorescerende reporter muis stam biedt ons een 50% verminderde verwerving van beeldvorming tijd.
In dit werk beschrijven we een gedetailleerd technisch protocol voor in vivo beeldvorming van het oculaire oppervlak stapsgewijze wijze met behulp van ons imagingplatform en dubbele fluorescerende transgene muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit op maat gemaakte MPM imaging platform met een besturingssoftware werd gebruikt voor intravital imaging van muis epitheelorganen, waaronder huid10,haarzakje10 en oculair oppervlak9,10 (Figuur 1A). Het op maat gemaakte systeem werd gebruikt voor zijn flexibiliteit in het veranderen van de optische componenten voor verschillende experimenten, sinds het begin van ons project. Deze beeld…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de subsidie van het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), National Taiwan University Hospital (NTUH108-T17) en Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRP3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).
Materials
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36 | |
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
References
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, 101-108 (1989).
- Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
- Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).
- Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).
- Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).
- Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
- Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. , (2019).
- Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).
- Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).
- Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).
- Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).
- Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).
- Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
- Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).
- Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
- Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
- Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).
- Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
- Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).
- Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).
- Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
