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Bioengineering

माउस कॉर्निया और कंजक्टिवा की लाइव इमेजिंग के लिए एक कस्टम मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी प्लेटफॉर्म

doi: 10.3791/60944 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत लाइव माउस ऑक्यूलर सरफेस इमेजिंग के लिए एक मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपिक प्लेटफॉर्म है। फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक माउस नेत्र सतह के भीतर कोशिका नाभिक, कोशिका झिल्ली, तंत्रिका फाइबर और केशिकाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है। कोलेजनस संरचनाओं से प्राप्त गैर-रैखिक दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी के संकेत स्ट्रोमल आर्किटेक्चर के लिए लेबल-मुक्त इमेजिंग प्रदान करते हैं।

Abstract

पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण और सेल कल्चर सिस्टम वीवो शारीरिक और पैथोलॉजिकल गतिशीलता में पूरी तरह से अनुकरण करने के लिए अपर्याप्त हैं। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी (एमपीएम) वीवो में सेलुलर स्तरों पर जैव चिकित्सा अध्ययन के लिए सबसे लोकप्रिय इमेजिंग तौर-तरीकों में से एक बन गया है, लाभों में उच्च संकल्प, गहरे ऊतक प्रवेश और न्यूनतम फोटोटोक्सिसिटी शामिल हैं। हमने एक एमपीएम इमेजिंग प्लेटफॉर्म तैयार किया है जिसमें एक कस्टमाइज्ड माउस आई होल्डर और वीवो में इमेजिंग ऑक्यूलर सरफेस के लिए स्टीरियोटैक्सिक स्टेज है । दोहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर माउस नेत्र सतह के भीतर कोशिका नाभिक, कोशिका झिल्ली, तंत्रिका फाइबर और केशिकाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है। मल्टीफोटोन फ्लोरेसेंस संकेतों के अलावा, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) प्राप्त करना एक साथ कोलेजनस स्ट्रोमल वास्तुकला के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। इस मंच को कॉर्निया और कंजक्टिवा सहित पूरे नेत्र सतह में सटीक स्थिति के साथ इंट्राविटल इमेजिंग के लिए नियोजित किया जा सकता है।

Introduction

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कॉर्निया और कंजक्टिवा सहित नेत्र सतह संरचनाएं बाहरी गड़बड़ी से अन्य गहरे नेत्र ऊतकों की रक्षा करती हैं। कॉर्निया, आंखों का पारदर्शी सामने का हिस्सा, आंखों में प्रकाश को निर्देशित करने और एक सुरक्षात्मक बाधा के रूप में अपवर्तक लेंस के रूप में कार्य करता है। कॉर्नियल एपिथेलियम कॉर्निया की सबसे बाहरी परत है और इसमें सतही कोशिकाओं, पंख कोशिकाओं और बेसल कोशिकाओं की अलग-अलग परतें होती हैं। कॉर्नियल स्ट्रोमा केराटोसाइट्स के साथ एम्बेडेड परिष्कृत रूप से पैक किए गए कोलेजनस लैमेले से बना है। कॉर्नियल एंडोथेलियम, फ्लैट हेक्सागोनल कोशिकाओं की एक परत, अपने पंपिंग कार्यों के माध्यम से अपेक्षाकृत निर्जलित राज्य में कॉर्निया स्ट्रोमा रखकर कॉर्निया की पारदर्शिता बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है1। लिम्बस कॉर्निया और कंजक्टिवा के बीच की सीमा बनाता है, और कॉर्नियल एपिथेलियल स्टेम सेल2का जलाशय है। अत्यधिक संवहनी संविवाह बलगम और आँसू का उत्पादन करके आंखों को चिकनाई करने में मदद करता है3.

कॉर्नियल सतह संरचनाओं की सेल गतिशीलता पारंपरिक रूप से या तो हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण या इन विट्रो सेल संस्कृति द्वारा अध्ययन की जाती है, जो वीवो सेल गतिशीलता में पर्याप्त रूप से अनुकरण नहीं कर सकती है। एक गैर आक्रामक लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण, इसलिए, इस तरह के अंतर को पाटने कर सकते हैं । इसके फायदों के कारण, जिसमें उच्च संकल्प, न्यूनतम फोटोडैमेज और गहरी इमेजिंग गहराई शामिल है, एमपीएम जैविक अनुसंधान,,4, 5,6,7,8के विविध क्षेत्रों में एक शक्तिशाली मोडलि मोडलि मोडल बन गया है।,5, कॉर्नियल इमेजिंग के लिए, एमपीएम इंट्रासेल्युलर एनएडी (पी)एच से प्राप्त आंतरिक ऑटोफ्लोरेसेंस से सेलुलर जानकारी प्रदान करता है। फेमटोसेकंड लेजर स्कैनिंग के तहत गैर-सेंट्रोमममेमसिक प्रकार I कोलेजन फाइबर से प्राप्त दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) संकेत अतिरिक्त धुंधला प्रक्रियाओं के बिना कोलेजनस स्ट्रोमल संरचनाएं प्रदान करता है9। पहले , हमने और अन्य समूहों ने पशु और मानव कॉर्निया 9 , 10 , 11 ,12,,,13,14,,15की इमेजिंगकेलिए एमपीएम का शोषण किया है ।1215

विशिष्ट कोशिका आबादी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रदर्शन करने वाली ट्रांसजेनिक माउस लाइनों का व्यापक रूप से सेल जीव विज्ञान में विभिन्न अध्ययनों के लिए उपयोग किया गया है, जिसमें विकास, ऊतक होमोस्टेसिस, ऊतक उत्थान और कार्सिनोजेनेसिस शामिल हैं। हमने एमपीएमद्वारा कॉर्निया9,10,बालों के रोम 10 और एपिडर्मिस10 के वीवो इमेजिंग में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किए गए ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों का उपयोग किया।, टीडीटोमाटो और ईजीएफपी के साथ टैग किए गए सेल न्यूक्लियस के साथ लेबल की गई कोशिका झिल्ली के साथ दोहरी फ्लोरोसेंट माउस तनाव दो माउस उपभेदों से पैदा होता है: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)। 26Sortm1Ytchn/J,#021847)16 और mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP,#007676)17। R26R-जीआर ट्रांसजेनिक माउस लाइन में एक दोहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर स्ट्रगल होता है, जिसमें एक एच2बी-ईजीएफपी फ्यूजन जीन और mCherry-GPI एंकर सिग्नल फ्यूजन जीन शामिल है, जो जीटी (रोजा) 26Sor लोकस में डाला गया है । MT-mG ट्रांसजेनिक तनाव एक सेल झिल्ली लक्षित tdTomato और EGFP फ्लोरोसेंट क्रे रिपोर्टर चूहों है । क्रे रीकॉम्बिनेशन से पहले, टीडीटोमा फ्लोरेसेंस अभिव्यक्ति के साथ कोशिका झिल्ली प्रोटीन विभिन्न कोशिकाओं में व्यापक रूप से मौजूद है। यह ट्रांसजेनिक माउस तनाव हमें क्रे उत्तेजन के बिना टीडीटोमाटो के साथ नाभिक-ईजीएफपी और झिल्ली की कल्पना करने में सक्षम बनाता है। प्रयोगों के लिए पर्याप्त चूहों का उत्पादन करने के लिए दो महिलाओं (R26R-GR+/+)और एक पुरुष (mT-mG+/+)ट्रांसजेनिक माउस को एक साथ पैदा किया गया था । इस अध्ययन में R26R-GR +/-;mT-mG+/-जीनोटाइप, दोहरी फ्लोरोसेंट चूहों के तनाव के साथ उनकी संतानों का उपयोग किया गया था ।+/- एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस लाइन के साथ तुलना में जैसा कि पहले9,,10वर्णित है, यह दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस तनाव हमें इमेजिंग समय के 50% कम अधिग्रहण के साथ प्रदान करता है।

इस काम में, हम अपने इमेजिंग प्लेटफॉर्म और दोहरे फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके कदम-दर-कदम तरीके से नेत्र सतह के वीवो इमेजिंग में एक विस्तृत तकनीकी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

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Protocol

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सभी पशु प्रयोग राष्ट्रीय ताइवान विश्वविद्यालय और चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार आयोजित किए गए थे ।

1. मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी सेटअप

  1. पानी विसर्जन 20x 1.00 NA उद्देश्य(चित्रा 1A)के साथ एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर आधारित एक प्रणाली का निर्माण करें।
  2. टीआई का उपयोग करें: उत्तेजन स्रोत के रूप में नीलमणि लेजर (ट्यूनेबल तरंगदैर्ध्य के साथ) । ईजीएफपी के लिए 880 एनएम पर लेजर आउटपुट तरंगदैर्ध्य और टीडीटोमाटो(चित्रा 1 ए)के लिए 940 एनएम निर्धारित करें।
  3. एसएचजी/ईजीएफपी और ईजीएफपी/टीडीटोमा(चित्रा 1 ए)के पृथक्करण के लिए दो डिक्रोइक मिरर (४९५ एनएम और ५८० एनएम) शामिल करें । स्पेक्टरैली एसएचजी सिग्नल, ईजीएफपी और टीडीटोमाटो को बैंडपास फिल्टर 434/17एनएम, 510/84एनएम और 585/40एनएम(चित्रा 1A)द्वारा अलग करता है ।
  4. छवि की गुणवत्ता को अनुकूलित करने और फोटोब्लैचिंग और ऊतक क्षति से बचने के लिए, लेजर पावर को इमेजिंग कॉर्निया के लिए लगभग 35 मिलियन और लिम्बस के लिए 50 मिलियन प्रति वर्ष निर्धारित करें। लेजर ऑप्टिकल सिस्टम से गुजरने से पहले लेजर पावर को मापें। नमूनों पर सटीक लेजर शक्ति के बारे में 8-9 mW है। पूरा सूक्ष्म डिजाइन चित्रा 1Aमें दिखाया गया है ।
    नोट: फोटो-ब्लीचिंग और ऊतक क्षति से बचने के लिए लेजर पावर की ऊपरी सीमा 70 मिलियन तक सेट है।

2. लाइव इमेजिंग के लिए पशु तैयारी

  1. प्रयोग के लिए 8-12 सप्ताह पुराने चूहों का प्रयोग करें। इंट्रामस्कुलर रूप से सामान्य संज्ञाहरण के लिए 50-80 मिलीग्राम/किलोग्राम तिलेटामाइन एचसीएल और जोलाजेपाम एचसीएल इंजेक्ट करें। एक अंगुली चुटकी द्वारा वापसी पलटा करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी के लिए जांच करें । स्थिर श्वास दर निगरानी की अनुमति देने के लिए पर्याप्त एनेस्थेटाइजेशन महत्वपूर्ण है।
    नोट: 8 सप्ताह या उससे अधिक उम्र में चूहों की सिफारिश की जाती है क्योंकि उनकी आंखों परिपक्व हो जाती है।
  2. माउस को एक गर्म चरण पर संज्ञाहरण के नीचे रखें और गुदा में तापमान निगरानी जांच डालें।
    सावधानी: जांच को हवा के संपर्क में आने के बिना पूरी तरह से गुदा गुहा में डाला जाना चाहिए, ताकि हीटर के ओवरहीटिंग और हीटस्ट्रोक को शामिल करने से बचा जा सके।

3. नेत्र सतह की लाइव इमेजिंग के लिए आंख पकड़

  1. नेत्र सतह की लाइव इमेजिंग के लिए, दो भागों से मिलकर कस्टम डिज़ाइन किए गए स्टीरियोटैक्सिक माउस धारक का उपयोग करें: एक हेड होल्डर सिर और एक नेत्र धारक को पलकों को वापस लेने और पूरी नेत्र सतह(चित्रा 1बी-डी)का पर्दाफाश करने के लिए स्थिर करने के लिए।
  2. बाहरी श्रवण मीटस में कान की सलाखों को डालें और हेड होल्डर(चित्रा 1बी, डी)के तीन सूत्री निर्धारण को बनाए रखें।
  3. सामयिक रूप से नमकीन में 0.4% ऑक्सीबुप्रोकेन हाइड्रोक्लोराइड का समाधान लागू करें और इसे 3 मिनट के लिए छोड़ दें ताकि नेत्र सतह को एनेस्थेटाइज किया जा सके।
  4. सुनिश्चित करें कि आंखों की पुतली उचित मैनुअल पलक पीछे हटने से फैला हुआ है। अन्यथा, इस्केमिया और आंखों की पुतली का रक्तस्राव हो सकता है।
  5. नेत्र सतह को बेनकाब करने के लिए पलक मार्जिन के साथ आंख धारक की पॉलीथीन ट्यूब का एक लूप सावधानी से रखें। पॉलीथीन ट्यूब(चित्रा 1सी, डी)के लूप के साथ कवर किए गए अपने सुझावों के साथ नंबर 5 ड्यूमोंट संदंश से बना नेत्र धारक के साथ आंखों की पुतली को स्थिर करें।
  6. आंखों की पुतली को स्थिर रखने के लिए आंखों के डिस्टल फोर्सप्स में घुंडी का उपयोग करके स्क्रू संदंश(चित्रा 1D)।
  7. हर घंटे नेत्र सतह की नमी बनाए रखने के लिए विसर्जन माध्यम के रूप में कॉर्नियल सतह पर 1.338 के अपवर्तक सूचकांक के साथ एक आंख जेल लागू करें। इसके अलावा, हर घंटे आंख जेल के नियमित रूप से आवेदन इमेजिंग के दौरान कॉर्निया में बादल से बचें।
  8. केंद्रीय कॉर्निया से परिधीय क्षेत्र(चित्रा 1सी, डी)तक पूरे कॉर्नियल सतह पर इमेजिंग के लिए स्टेपर-मोटराइज्ड चरण पर बंद धारक के साथ आंखों की पुतली को घुमाएं।
    सावधानी: आंखों के जेल की अतिरिक्त और अपर्याप्त मात्रा दोनों इमेजिंग के दौरान छवियों की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती हैं। इसलिए, सतह को नियमित रूप से नम रखने के लिए हर घंटे आंख जेल का पूरक इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है।

4. जेड धारावाहिक छवि अधिग्रहण

नोट: छोड़ने की गति कलाकृतियों को कम करने के लिए हर ढेर में पहली और आखिरी स्लाइड सेट करें।

  1. छवियों को लेने से पहले, एक पारा प्रकाश स्रोत के साथ लक्ष्यीकरण क्षेत्र छवि ।
  2. सॉफ्टवेयर चालू करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के प्रतीक पर क्लिक करें।
  3. नेत्र सतह में सेलुलर संरचना की कल्पना करने के लिए उचित पीएमटी लाभ और डिजिटल लाभ का चयन करें।
  4. एक स्टैक प्राप्त करने के लिए पहली स्लाइड और अंतिम स्लाइड सेट करें।
  5. इमेज रेजोल्यूशन और जेड-स्टेप के लिए संख्यात्मक मान दर्ज करें, उदाहरण के लिए, 512 x 512 और 1 माइक्रोन जेड-स्टेप के रूप में।
  6. Z-सीरियल इमेज कलेक्ट करने के लिए स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
  7. एक ही क्षेत्र में दो बार लाइव छवियों का अधिग्रहण, पहले एसएचजी/ईजीएफपी सिग्नल संग्रह के लिए ८८० एनएम उत्तेजन पर और दूसरा ९४० एनएम उत्तेजन पर EGFP/tdTomato सिग्नल संग्रह के लिए ।
    नोट: दो स्टैक का संयोजन 3 चैनल छवियां प्रदान करता है। इमेज रेजोल्यूशन और स्कैन फॉर्मेट का साइज क्रमशः 512 x 512 पिक्सल और 157 माइक्रोन x157 माइक्रोन था।

5. छवि प्रसंस्करण और 3 डी पुनर्निर्माण

  1. फिजी सॉफ्टवेयर18में जेड-सीरियल छवियों को लोड करें।
  2. पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए फिजी में प्लगइन मीडियन 3डी फ़िल्टर का चयन करें।
  3. छवियों को तेज करने के लिए फिजी में पैकेज अनशार्प मास्क फ़िल्टर का चयन करें।
  4. छवियों की गुणवत्ता को स्वचालित रूप से अनुकूलित करने के लिए चमक/विपरीत में"ऑटो"पर क्लिक करें ।
  5. जेड-सीरियल छवियों को निर्यात करने में सक्षम होने के लिए छवि दृश्यों के रूप में छवियों को सहेजें।
  6. वॉल्यूम रेंडरिंग का उपयोग करके 3डी पुनर्निर्माण के लिए वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर (जैसे, एविज़ो लाइट) में जेड-सीरियल छवियों को लोड करें।
  7. सभी एमपीएम छवियों में, वर्तमान ईजीएफपी, टीडीटोमाटो, और एसएचजी क्रमशः छद्म-हरे, लाल और सियान रंग में संकेत करते हैं।
  8. स्नैपशॉट द्वारा 3D संरचना चित्रों को कैप्चर करें।

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Representative Results

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इस लाइव इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके, माउस नेत्र सतह को सेलुलर स्तरों पर कल्पना की जा सकती है। नेत्र सतह में व्यक्तिगत एकल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, हमने कोशिका झिल्ली में व्यक्त नाभिक और टीडीटोमाटो में व्यक्त ईजीएफपी के साथ दोहरी फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक चूहों को नियोजित किया। कोलेजन से भरपूर कॉर्नियल स्ट्रोमा को एसएचजी संकेतों ने हाइलाइट किया ।

कॉर्नियल एपिथेलियम में, सतही कोशिकाओं, पंख कोशिकाओं और बेसल कोशिकाओं(चित्रा 2) कीकल्पना की गई थी। दोहरी फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक चूहों में, हम बेसल परत से कॉर्नियल और लिम्बल एपिथेलियम(चित्रा 2)दोनों में सतही परतों के लिए एकल कोशिकाओं को मैप करने में सक्षम थे। षट्कोणीय सतही कोशिकाओं को देखा गया (चित्र 2में सफेद तीर) । बेसल परत से बाहरी परतों की ओर परमाणु आकार और इंटरन्यूक्लियर अंतर दोनों कॉर्नियल एपिथेलियम(चित्रा 2)में वृद्धि हुई। टीडीटोमाटो फ्लोरेसेंस के साइटोप्लाज्मिक संकेतों ने संकेत दिया कि झिल्ली प्रोटीन से भरपूर इंट्रासेलुलर वेसिकुलर सिस्टम, जिसमें गोलगी उपकरण, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम शामिल हैं, विंग कोशिकाओं(चित्रा 2)में बिखरे हुए थे।

कोलेजनस स्ट्रोमा के भीतर, स्टेलेट के आकार के केराटोसाइट्स को दोहरी फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक चूहों (चित्र 3 और चित्रा 4में पीला तीर सिर) में झिल्ली-लक्षित tdTomato फ्लोरेसेंस द्वारा रेखांकित किया गया था। कोलेजन स्ट्रोमा में एम्बेडेड केराटोसाइट्स एंडोथेलियल कोशिकाओं की तुलना में अधिक शिथिल स्थान थे। इसके अलावा, कॉर्नियल स्ट्रोमा में पतली ब्रांचिंग नसों को झिल्ली-लक्षित टीडीटोमा संकेतों (चित्र 3में सफेद एरोहेड) द्वारा भी कल्पना की गई थी। कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं के मोनोलेयर ने एक अपेक्षाकृत समरूप षट्कोणीय आकार दिखाया जो एक शहद पैटर्न (चित्र 4में सफेद एरोहेड) में जुड़ा हुआ था। लिम्बल एपिथेलियम में एपिथेलियल कोशिकाओं(चित्र 5)की 1-2 परतें शामिल थीं। दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ट्रांसजेनिक माउस तनाव ने भी हमें कंजक्टिवा(चित्र 6 ए)के भीतर केशिकाओं की छवि बनाने में सक्षम बनाया। केशिकाओं के 3 डी आर्किटेक्चर को वैस्कुलर एंडोथेलियम(चित्रा 6बी, 6सी)को रेखांकित करके खंगाला गया था।

Figure 1
चित्रा 1: एमपीएम और घूर्णन माउस धारक का सेटअप।
}Aएमपीएम का सेटअप। (ख)माउस धारक का डिजाइन। माउस धारक में एक घूर्णन प्रधान धारक और एक नेत्र धारक होता है। (ग)माउस आई होल्डर का डिजाइन। नेत्र धारक कॉर्निया और कंजक्टिवा को बेनकाब करने के लिए प्लास्टिक के लूप से पलकों को वापस लेता है। सिर धारक और नेत्र धारक एक साथ खराब कर रहे है (बी) मंच पर सटीक और नियंत्रणीय रोटेशन और नेत्र सतह की इमेजिंग की अनुमति है । (घ)नेत्र धारक के साथ कॉर्नियल इमेजिंग के लिए लाइव माउस की तस्वीर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: दोहरी फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक चूहों में कॉर्नियल एपिथेलियम की लाइव इमेजिंग।
कॉर्नियल एपिथेलियम को सतही कोशिकाओं, पंख कोशिकाओं और बेसल कोशिकाओं को शामिल करने के लिए परत-दर-परत चित्रित किया गया था। सतही कोशिकाओं को सफेद तीर के साथ चिह्नित किया जाता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (Z = एपिथेलियम (μm) की शीर्ष सतह से गहराई)) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कॉर्नियल स्ट्रोमा की लाइव इमेजिंग।
कॉर्नियल स्ट्रोमा के भीतर, केराटोसाइट्स (पीला एरोहेड) और तंत्रिका फाइबर (सफेद एरोहेड) कोलेजनस स्ट्रोमा (छद्म-नीले रंग में) में एम्बेडेड थे। स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सेंट्रल कॉर्निया में कॉर्नियल एंडोथेलियम की लाइव इमेजिंग।
षट्कोणीय कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं (सफेद एरोहेड) का मोनोलेयर। स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: लिम्बल एपिथेलियम की लाइव इमेजिंग।
दोहरी फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक चूहों में लिम्बल एपिथेलियम की लाइव छवियों ने वैक्यूलेटेड न्यूक्लियी को दिखाया। स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: लाइव इमेजिंग और कंजक्टिवा में संवहनी नेटवर्क के त्रि-आयामी पुनर्निर्माण।
(कंजक्टिव स्ट्रोमा में केशिकाओं की कल्पना की गई थी ।A स्केल बार = 50 माइक्रोन। (ख)केशिका नेटवर्क का 3डी पुनर्निर्माण एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जाता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। (C,D) पैनल बी फ्लोरोसेंट वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं में दिखाई गई छवि के 3 डी दृश्यों ने केशिकाओं (सफेद और पीले तीरहेड) को रेखांकित किया। पैनल सी के लिए स्केल बार = 6.26 माइक्रोन और पैनल डी = 10 माइक्रोन के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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एक नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ इस कस्टम-निर्मित एमपीएम इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग माउस एपिथेलियल अंगों के इंट्राविटल इमेजिंग के लिए किया गया था, जिसमें त्वचा10,बाल कूप10 और नेत्र सतह9,,10 (चित्रा 1A)शामिल थे। कस्टम निर्मित प्रणाली का उपयोग हमारी परियोजना की शुरुआत से ही विभिन्न प्रयोगों के लिए ऑप्टिकल घटकों को बदलने में इसके लचीलेपन के लिए किया गया था। यह इमेजिंग पद्धति वाणिज्यिक एमपीएम उत्पादों के लिए बहुमुखी है। यह प्रोटोकॉल एमपीएम इमेजिंग प्लेटफॉर्म द्वारा माउस नेत्र सतह के इंट्राविटल इमेजिंग के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है। एक स्टीरियोटैक्सिक माउस धारक(चित्रा 1 बी) काउपयोग करके, हम पूरे नेत्र सतह में विभिन्न क्षेत्रों की कल्पना करने में सक्षम थे। सटीक स्थिति क्षमता एक निर्दिष्ट क्षेत्र में लौकिक सेल गतिशील परिवर्तनों की निगरानी करना संभव बनाती है।

यद्यपि वीवो,21,19, 20, 21,,22में मुरीन कॉर्नियल एमपीएम इमेजिंग के कई अध्ययनों की सूचना दी गईहै,लेकिन कई तकनीकी सीमाएं हैं जिन्हें लंबी अवधि में निरंतर इमेजिंग प्राप्त करने के लिए दूर करने की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए, आंखों की पुतली को स्थिर स्थिति में रखना, इमेजिंग के दौरान गति कलाकृतियों को कम करना और फोटोब्लैचिंग के बिना लंबी अवधि के लिए छवियों को प्राप्त करना। आंखों की सतह20तक अपेक्षाकृत सीमित पहुंच के साथ वीवो में कॉर्नियल इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किए गए प्लास्टिक आईकप की तुलना में, हमारा नेत्र धारक न केवल आंखों की पुतली को पूरी तरह से उजागर रखता है बल्कि पूरे नेत्र सतह को ऑब्जेक्टिव लेंस(चित्रा 1C)के लिए सुलभ बनाता है।

यद्यपि महत्वपूर्ण रंगों या जांचों का उपयोग नियमित रूप से फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के रूप में कोशिकाओं को लेबल करने के लिए किया जाता है20,,21,,22,सुई इंजेक्शन की आक्रामकता शारीरिक होमोस्टेटिक राज्य या ऊतक उत्थान प्रक्रिया के दौरान अंगों की प्राकृतिक कोशिका गतिशीलता को बाधित कर सकती है। R26R-जीआर ट्रांसजेनिक चूहों तनाव कोशिका नाभिक में स्थिर और उज्ज्वल हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है और भूत फाइबर23में मांसपेशियों की जनकलि के कोशिका गतिशीलता के दृश्य के लिए इस्तेमाल किया गया है । MT-mG रिपोर्टर ट्रांसजेनिक माउस लाइन का उपयोग एपिडर्मल कोशिकाओं के विभेदन का विश्लेषण करने के लिए किया गयाथा। एक एकल रिपोर्टर फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक माउस लाइन की तुलना में, इस दोहरी फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक माउस तनाव ने कोशिका नाभिक और कोशिका झिल्ली दोनों की कोशिका संरचना जानकारी प्रदान करके छवि अधिग्रहण के समय को आधे से कम कर दिया। माउस धारक को घुमाकर, एंडोथेलियल और रक्त कोशिकाओं दोनों के फ्लैट नाभिक को दोहरी फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक माउस स्ट्रेन(चित्रा 6)का उपयोग करके संवहनी ल्यूमेन के भीतर कल्पना की गई थी। इसलिए, इस ट्रांसजेनिक माउस लाइन का उपयोग भविष्य में केशिकाओं की कोशिका गतिशीलता की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो रोग कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन की कुंजी है। इसके अलावा, वीवो इमेजिंग प्लेटफॉर्म में इसका उपयोग विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे न्यूट्रोफिल25,लैंगरहंस कोशिकाओं 26, नियामक टी कोशिकाओं (ट्रेग्स)27 27और मस्तूल कोशिकाओं28की फ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वारा कॉर्नियल विकृतियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है।

अंत में, हमने माउस नेत्र सतह अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली इंट्राविटल एमपीएम इमेजिंग प्लेटफॉर्म का प्रदर्शन किया। लाइव एमपीएम स्टीरियोटैक्सिक चरण और विशेष फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक चूहों का संयोजन कॉर्निया, लिम्बस और कंजक्टिवा सहित नेत्र सतह में विशिष्ट सेलुलर और बाह्य कोशिकीय संरचनाओं के वास्तविक समय के दृश्य को सक्षम बनाता है। यह इंट्राविटल इमेजिंग प्लेटफॉर्म नेत्र सतह की कोशिका गतिशीलता का पता लगाने में मदद कर सकता है और, आगे के विकास के साथ, भविष्य में नेत्र दवा स्क्रीनिंग के लिए संभावित रूप से उपयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, से अनुदान सहायता का शुक्रिया अदा करते हैं, 108-2628-बी-002-023, 108-2628-बी-002-023), नेशनल ताइवान यूनिवर्सिटी अस्पताल (NTUH108-T17) और चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल, ताइवान (सीएमआरपीजी3जी1621, सीएमआरपीजी3जी1623) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831

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References

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माउस कॉर्निया और कंजक्टिवा की लाइव इमेजिंग के लिए एक कस्टम मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी प्लेटफॉर्म
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Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).More

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).

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