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Bioengineering

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

doi: 10.3791/60944 Published: May 17, 2020
* These authors contributed equally

Summary

여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.

Abstract

기존의 조직학적 분석 및 세포 배양 시스템은 생체 내 생리학적 및 병리학적 역학을 완전히 시뮬레이션하기에 충분하지 않습니다. 다광 현미경 검사법 (MPM)은 생체 내 세포 수준에서 생물 의학 연구를위한 가장 인기있는 이미징 양식 중 하나가되었으며, 장점은 고해상도, 깊은 조직 침투 및 최소한의 광독성을 포함합니다. 우리는 맞춤형 마우스 눈 홀더와 생체 내 안구 표면을 이미징하기위한 스테레오 탁스 스테이지가있는 MPM 이미징 플랫폼을 설계했습니다. 이중 형광 단백질 리포터 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 다광형광 신호 외에도 제2 고조파 생성(SHG)을 동시에 획득하면 콜라주기스트롬 아키텍처의 특성화가 가능합니다. 이 플랫폼은 각막과 결막을 포함하여 전체 안구 표면에 정확한 위치가 있는 인트라베이티 이미징에 사용할 수 있습니다.

Introduction

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각막과 결막을 포함한 안구 표면 구조는 외부 장애로부터 다른 더 깊은 안구 조직을 보호합니다. 눈의 투명한 전면 부분인 각막은 눈안으로 빛을 지시하고 보호 장벽으로 반응하는 굴절 렌즈로 기능합니다. 각막 상피는 각막의 가장 바깥쪽 층이며 피상 세포, 날개 세포 및 기저 세포의 뚜렷한 층으로 구성됩니다. 각막 스트로마는 정교하게 포장된 콜라주누우스 라멜라에 각질 세포가 내장되어 있습니다. 각막 내피, 평평한 육각 세포의 단일 층은 펌핑 기능1을통해 상대적으로 탈수 된 상태에서 각막 스트로마를 유지함으로써 각막의 투명성을 유지하는 데 중요한 역할을한다. 림푸스는 각막과 결막 사이의 경계를 형성하고, 각막 상피 줄기 세포2의저수지이다. 혈관이 높게 한 결막은 점액과 눈물3을생성하여 눈을 윤활하는 데 도움이됩니다.

각막 표면 구조의 세포 역학은 기존의 조직학적 분석 또는 생체 내 세포 배양에 의해 연구되며, 이는 생체 내 세포 역학을 적절히 시뮬레이션하지 못할 수 있다. 비침습적 라이브 이미징 접근법은 그러한 격차를 해소할 수 있습니다. 고해상도, 최소한의 광손상 및 심층 이미징 깊이를 포함하는 장점으로 인해 MPM은,,4, 5,56,67,8의다양한 생물학적연구에서강력한 양식이되었습니다. 각막 이미징의 경우, MPM은 세포 내 NAD(P)H에서 유래한 본질적인 자동 형광으로부터 세포 정보를 제공합니다. 펨토초 레이저 스캐닝 하에서 비중심형 I 콜라겐 섬유로부터 유래된 제2 고조파 생성(SHG) 신호는 추가 염색 절차 없이 콜라주기누우스 기질 구조를 제공한다9. 이전에는 동물 및 인간 각막9,,,10, 11,12,,13,14,1115의이미징을 위해,MPM을악용했습니다.

특정 세포 집단에서 형광 단백질을 나타내는 형질 전환 마우스 라인은 개발, 조직 항상성, 조직 재생 및 발암 발생을 포함한 세포 생물학의 다양한 연구에 널리 사용되어 왔다. 우리는 각막9,10,모낭 10표피10MPM에 의하여 생체 내 화상 진찰을10 위한 형광 단백질로 표지된 형질 마우스 균주를 이용했습니다. TdTomato와 EGFP로 태그된 세포막을 가진 이중 형광 마우스 변형은 두 개의 마우스 균주에서 사육됩니다: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J,#021847)16 및 mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-t., 1.#007676 1.17 R26R-GR 형질전환 마우스 라인은 H2B-EGFP 융합 유전자 및 mCherry-GPI 앵커 신호 융합 유전자를 포함하는 이중 형광 단백질 리포터 생성을 포함하며, Gt(ROSA)26Sor 궤적에 삽입된다. mT-mG 형질균은 세포막 표적 tdTomato 및 EGFP 형광 크레 리포터 마우스이다. Cre 재조합 전에, tdTomato 형광 발현을 가진 세포막 단백질은 각종 세포에서 널리 존재한다. 이 형질전환 마우스 변형은 우리가 Cre 흥분없이 tdTomato핵-EGFP 및 막을 시각화 할 수 있습니다. 두 암컷 (R26R-GR+/+)및 한 남성 (mT-mG+/+)형질 전환 마우스실험에 대 한 충분 한 마우스를 생산 하기 위해 함께 사육 되었다. R26R-GR+/-;mT-mG+/- 유전자형, 이중 형광 마우스 균주를 가진 그들의 자손은 이 연구에서 사용되었습니다. 앞서설명한9,10,이 이중 형광 기자 마우스 균주는 이전에 설명한 바와 같이 하나의 형광 기자 마우스 라인과 비교하여, 이 이중 형광 기자 마우스 균주는 이미징 시간의 50% 감소 된 취득을 우리에게 제공합니다.

이 작품에서, 우리는 우리의 화상 진찰 플랫폼 및 이중 형광 형질 전환 마우스를 사용하여 단계별로 안구 표면의 생체 내 화상 진찰을 위한 상세한 기술 프로토콜을 기술합니다.

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Protocol

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모든 동물 실험은 국립 대만 대학과 창궁 기념 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 절차에 따라 수행되었습니다.

1. 다광 현미경 검사법 설정

  1. 물 침지 20x 1.00 NA 목표(그림 1A)와직립 현미경을 기반으로 시스템을 구축 합니다.
  2. Ti 사용: 사파이어 레이저(튜닝 파장 사용)를 흥분 원으로 사용하십시오. EGFP의 경우 880nm, tdTomato의 경우 940nm에서 레이저 출력 파장을 설정합니다(그림1A).
  3. SHG/EGFP 및 EGFP/tdTomato(그림1A)의분리를 위한 2개의 이색 거울(495nm 및 580 nm)을 포함한다. 관전적으로 밴드패스 필터 434/17nm, 510/84nm 및 585/40nm(그림1A)로SHG 신호, EGFP 및 tdTomato를 분리합니다.
  4. 영상 품질을 최적화하고 광표백 및 조직 손상을 방지하기 위해 레이저 전력을 이미징 각막용약 35mW, 림푸스의 경우 50mW로 설정합니다. 레이저가 광학 시스템을 통과하기 전에 레이저 전력을 측정합니다. 샘플의 정확한 레이저 전력은 약 8-9 mW입니다. 완전한 현미경 디자인은 도 1A에도시된다.
    참고: 레이저 전력의 상한은 70mW로 설정되어 사진 표백 및 조직 손상을 방지합니다.

2. 라이브 이미징을 위한 동물 준비

  1. 실험에 8-12주 된 마우스를 사용하십시오. 근육질 주입 50-80 틸타민 HCl의 mg/kg과 졸라제팜 HCl 전신 마취에 대 한. 발가락을 꼬집어 철수 반사에 대한 응답의 부족을 확인합니다. 충분한 마취는 안정적인 호흡 속도 모니터링을 허용하는 것이 중요합니다.
    참고: 8주 이상의 나이에 마우스는 안구가 성숙하기 때문에 권장됩니다.
  2. 가열 된 단계에 마취 아래에 마우스를 배치하고 항문에 온도 모니터링 프로브를 삽입합니다.
    주의: 히터의 과열과 열사병 유도를 피하기 위해 프로브는 공기에 노출되지 않고 항문 구멍에 완전히 삽입해야합니다.

3. 안구 표면의 라이브 이미징을 위한 눈 들고

  1. 안구 표면의 라이브 이미징의 경우 헤드 홀더와 눈꺼풀을 후퇴시키고 전체 안구 표면을 노출하는 헤드 홀더의 두 부분으로 구성된 맞춤형 입체 마우스 홀더를사용합니다(그림 1B-D).
  2. 외부 청각 고기에 이어 바를 삽입하고 헤드 홀더(그림 1B, D)의3 점 고정을 유지합니다.
  3. 토폴로지0.4% 옥시부프로카인 염산염의 용액을 식염수에 적용하여 안구 표면을 마취시키기 위해 3분 간 방치한다.
  4. 적절한 수동 눈꺼풀 후퇴로 안구가 튀어나오도록 하십시오. 그렇지 않으면 안구의 허혈과 출혈이 발생할 수 있습니다.
  5. 눈꺼풀 여백을 따라 눈 홀더의 폴리에틸렌 튜브 루프를 조심스럽게 배치하여 안구 표면을 노출시합니다. 폴리에틸렌튜브(그림 1C,D)의루프로 덮인 팁으로 5번 듀몬트 집게로 구성된 아이 홀더로 안구를 안정시다.
  6. 눈덩이의 말단 집게에 손잡이를 사용하여 나사 집게(도1D).
  7. 매시간 안구 표면의 수분을 유지하기 위해 침지 매체로서 각막 표면에 1.338의 굴절률을 가진 아이 젤을 적용한다. 또한, 매시간 아이 젤을 정기적으로 바르면 이미징 중에 각막이 흐리는 것을 피합니다.
  8. 중앙 각막에서 주변부위(그림 1C,D)로전체 각막 표면을 가로질러 이미징하기 위해 스테퍼 전동 단계에 잠긴 홀더로 안구를 회전시.
    주의: 눈 젤의 과잉 및 부족한 양 둘 다 화상 진찰 도중 심상질의 질에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 표면을 촉촉하게 유지하기 위해 매 시간마다 눈 젤을 보충하는 것은 이미징에 중요합니다.

4. Z-시리얼 이미지 수집

참고: 모든 스택에 첫 번째 및 마지막 슬라이드를 설정하여 떨어지는 모션 아티팩트를 줄입니다.

  1. 이미지를 촬영하기 전에 타게팅 필드를 수은 광원으로 이미지화합니다.
  2. 현미경 소프트웨어의 기호를 클릭하여 소프트웨어를 켭니다.
  3. 적절한 PMT 게인 및 디지털 게인을 선택하여 안구 표면의 세포 구조를 시각화합니다.
  4. 첫 번째 슬라이드와 마지막 슬라이드를 설정하여 스택을 획득합니다.
  5. 이미지 해상도 및 z 단계(예: 512 x 512 및 1 μm)를 z 단계로 입력합니다.
  6. 시작 버튼을 클릭하여 z-serial 이미지를 수집합니다.
  7. 같은 지역에서 두 번 라이브 이미지를 획득, SHG / EGFP 신호 수집에 대한 880 nm 여기에서 먼저 EGFP / tdTomato 신호 컬렉션940 nm 여기에서 두 번째.
    참고: 두 스택의 조합은 3채널 이미지를 제공합니다. 이미지 해상도 및 스캔 형식 크기는 각각 512 x 512 픽셀과 157 μm x157 μm이었습니다.

5. 이미지 처리 및 3D 재구성

  1. 피지 소프트웨어18에z-시리얼 이미지를로드합니다.
  2. 배경 소음을 줄이기 위해 피지에서 플러그인 중앙값 3D 필터를 선택합니다.
  3. 피지의 포장 비샤프 마스크 필터를 선택하여 이미지를 선명하게 합니다.
  4. 밝기/대비로"자동"을클릭하여 이미지 품질을 자동으로 최적화합니다.
  5. z-serial 이미지를 내보낼 수 있도록 이미지를 이미지 시퀀스로 저장합니다.
  6. 볼륨 렌더링을 사용하여 3D 재구성을 위해 z-serial 이미지를 상용 소프트웨어(예: Avizo lite)에 로드합니다.
  7. 모든 MPM 이미지에서 EGFP, tdTomato 및 SHG 신호를 각각 의사 녹색, 빨간색 및 시안 색상으로 표시합니다.
  8. 스냅샷으로 3D 구조 사진을 캡처합니다.

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Representative Results

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이 라이브 이미징 플랫폼을 사용하여 마우스 안구 표면은 셀룰러 수준에서 시각화할 수 있습니다. 안구 표면에 개별 단일 세포를 시각화하기 위해, 우리는 세포막에서 발현된 핵 및 tdTomato에서 발현된 EGFP를 가진 이중 형광 형질 형질 형질 성 생쥐를 고용했습니다. 콜라겐이 풍부한 각막 스트로마는 SHG 신호에 의해 강조되었다.

각막 상피에서, 피상 세포, 날개 세포 및 기저세포(그림 2)가시각화되었다. 이중 형광 형질 전환 마우스에서, 우리는 각막과 사지 상피(도 2)에서피상층으로 기저 층에서 단일 세포를 매핑 할 수 있었습니다. 육각형 피상 세포가 관찰되었다(도 2의백색 화살촉). 핵 크기와 핵간 간격은 바깥층을 향한 기저층에서 각막 상피(그림2)에서증가하였다. tdTomato 형광의 세포질 신호는 골기 장치, 내피성 망상을 포함한 막 단백질이 풍부한 세포 내 혈관 계통이 날개 세포에 흩어져 있음을나타냈다(도 2).

콜라주 기질 내, 스텔레이트 형 각질은 이중 형광 형질 전환 마우스에서 멤브레인 표적 tdTomato 형광에 의해 설명되었다 (그림 3도 4의노란색 화살촉). 콜라겐 스트로마에 내장된 각질 세포는 내피 세포보다 더 느슨하게 간격이 있었다. 또한, 각막 스트로마에서 얇은 분기 신경은 또한 멤브레인 표적 tdTomato 신호(도 3의백색 화살촉)에 의해 시각화되었다. 각막 내피 세포의 단층은 벌집 패턴 (도 4의흰색 화살촉)으로 연결된 비교적 균일한 육각형을 보였다. 사지 상피는 상피 세포의 1-2 층으로 구성되었다(도 5). 이중 형광 기자 형질성 마우스 변형은 또한 결막 내의 모세 혈관을 이미지할 수 있게하였다(도 6A). 모세 혈관 내피의 3D 아키텍처는 혈관 내피(그림 6B,6C)를요약하여 재구성되었다.

Figure 1
그림 1: MPM 및 회전 마우스 홀더의 설정입니다.
(A)MPM의 설정. (B)마우스 홀더의 디자인. 마우스 홀더는 회전 헤드 홀더와 아이 홀더로 구성됩니다. (C)마우스 눈 홀더의 디자인. 눈 홀더는 각막과 결막을 노출하기 위해 플라스틱 루프로 눈꺼풀을 철회합니다. 헤드 홀더와 눈 홀더는 무대에서 (B)를 함께 나사로 조이어 정확하고 제어 가능한 회전과 안구 표면의 이미징을 허용합니다. (D)눈 홀더와 각막 이미징라이브 마우스의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 이중 형광 형질 전환 쥐에서 각막 상피의 라이브 이미징.
각막 상피는 표면 세포, 날개 세포 및 기저 세포를 포함하는 층별로 이미지되었다. 피상 세포는 흰색 화살촉으로 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm. (상피(μm)의 상단 표면으로부터의 Z = 깊이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 각막 스트로마의 라이브 이미징.
각막 기질 내에서 각막 세포 (노란색 화살촉)와 신경 섬유 (흰색 화살촉)는 콜라주 성 기질 (의사 - 파란색)에 내장되었다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 중앙 각막내피의 각막 내피의 라이브 이미징.
육각 각막 내피 세포 (백색 화살촉)의 단층. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 사지 상피의 라이브 이미징.
이중 형광 형질 전환 마우스에서 사지 상피의 살아있는 이미지는 진공 핵을 보였다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 실시간 이미징 및 결막에서 혈관 네트워크의 3차원 재구성.
(A)결막 기질에서 모세 혈관이 시각화되었다. 스케일 바 = 50 μm. (B)상용 소프트웨어를 이용하여 수행된 모세관 네트워크의 3D 재구성. 스케일 바 = 50 μm. (C,D) 패널 B. 형광 혈관 내피 세포에 표시된 이미지의 확대 된 3D 보기는 모세 혈관 (흰색과 노란색 화살촉)을 설명했습니다. 패널 C = 6.26 μm 및 패널 D = 10 μm용 스케일 막대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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제어 소프트웨어가 있는 이 맞춤형 MPM 이미징 플랫폼은 피부10,모낭10 및 안구 표면9,,10 (도 1A)을포함한 마우스 상피 기관의 인탈 이미징에 사용되었습니다. 맞춤형 시스템은 프로젝트 시작부터 다양한 실험을 위한 광학 부품을 유연히 변경하는 데 사용되었습니다. 이 이미징 방법론은 상용 MPM 제품에 다재다능합니다. 이 프로토콜은 MPM 이미징 플랫폼에 의한 마우스 안구 표면의 인트라인탈 이미징을 위한 상세한 방법을 설명합니다. 입체 마우스홀더(도 1B)를사용하여 안구 표면 전체에 걸쳐 서로 다른 영역을 시각화할 수 있었습니다. 정확한 포지셔닝 기능을 통해 지정된 영역의 측두세포 동적 변화를 모니터링할 수 있습니다.

뮤린 각막 MPM 이미징의 여러 연구가 생체19,,20,,21,,22에서보고되었지만, 장기간 에 걸쳐 지속적인 이미징을 달성하기 위해 극복해야 하는 몇 가지 기술적 한계가 있습니다(예: 안정된 위치에 안구를 잡고, 이미징 중 모션 아티팩트를 감소시키고, 광표백 없이 장기간 이미지를 획득한다) 눈표면(20)에상대적으로 제한된 생체 내 각막 이미징을 위해 설계된 플라스틱 안과컵과 비교하여, 눈 홀더는 안구를 완전히 노출시킬 뿐만 아니라 전체 안구 표면을 객관적렌즈(도1C)에접근할 수 있게 합니다.

중요한 염료 또는 프로브는 일상적으로 세포에 라벨을 붙이기 위해 형광 기자로 사용되지만20,,21,,22,바늘 주사의 침습성은 생리적 정성 상태 또는 조직 재생 과정에서 장기의 자연 세포 역학을 방해할 수 있다. R26R-GR 형질성 마우스 균주는 세포 핵에서 안정적이고 밝은 녹색 형광 단백질을 발현하고 유령섬유(23)에서근육 전주의 세포 역학의 시각화에 사용되어 왔다. mT-mG 기자 형질전환 마우스 라인은 피피 세포 내주모성(24)의분화를 분석하는 데 사용되었다. 단일 리포터 형광 형질 전환 마우스 라인에 비해, 이 이중 형광 형질 형질 형질 마우스 균주는 세포 핵과 세포막 둘 다의 세포 구조 정보를 동시에 제공함으로써 이미지 수집 시간을 절반으로 감소시켰습니다. 마우스 홀더를 회전시킴으로써, 내피 세포와 혈액 세포의 평평한 핵은 이중 형광 형질 형질 성 형질 마우스 균주를 사용하여 혈관 루멘 내에서 시각화되었다(도 6). 따라서, 이 형질전환 마우스 라인은 병리학 각막 신생혈관화의 열쇠인 미래에 모세혈관의 세포 역학을 조사하기 위하여 이용될 수 있다. 또한, 생체 내 이미징 플랫폼은호중구(25),랑게란스세포(26),조절T 세포(Tregs) 27 및 비만세포(28)와같은 다른 면역 세포의27 형광 라벨링에 의한 각막 병리에서 면역 반응을 탐구하는 데사용될 수 있다.

결론적으로, 우리는 마우스 안구 표면 연구를 위한 강력한 인트라바이탈 MPM 이미징 플랫폼을 보여주었습니다. 살아있는 MPM 스테레오탁스 단계와 특별한 형광 형질 형질 전환 마우스의 조합은 각막, 림푸스 및 결막을 포함하여 안구 표면에 있는 뚜렷한 세포 및 세포외 구조물의 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 이 인트라베이티 이미징 플랫폼은 안구 표면의 세포 역학을 탐구하는 데 도움이 될 수 있으며, 추가 개발과 함께 향후 안과 약물 스크리닝에 잠재적으로 사용될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

대만 과학기술부(106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089)의 보조금 지원에 감사드립니다. 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), 국립 대만 대학 병원 (NTUH108-T17) 및 창궁 기념 병원, 대만 (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3GG16222, CMRPG3G1622).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25x36
FF580-Di01-25x36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).More

Wu, Y. F., Ye, R. T., Pan, M. K., Lin, S. J., Tan, H. Y. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).

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