마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼
Summary
여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.
Abstract
기존의 조직학적 분석 및 세포 배양 시스템은 생체 내 생리학적 및 병리학적 역학을 완전히 시뮬레이션하기에 충분하지 않습니다. 다광 현미경 검사법 (MPM)은 생체 내 세포 수준에서 생물 의학 연구를위한 가장 인기있는 이미징 양식 중 하나가되었으며, 장점은 고해상도, 깊은 조직 침투 및 최소한의 광독성을 포함합니다. 우리는 맞춤형 마우스 눈 홀더와 생체 내 안구 표면을 이미징하기위한 스테레오 탁스 스테이지가있는 MPM 이미징 플랫폼을 설계했습니다. 이중 형광 단백질 리포터 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 다광형광 신호 외에도 제2 고조파 생성(SHG)을 동시에 획득하면 콜라주기스트롬 아키텍처의 특성화가 가능합니다. 이 플랫폼은 각막과 결막을 포함하여 전체 안구 표면에 정확한 위치가 있는 인트라베이티 이미징에 사용할 수 있습니다.
Introduction
각막과 결막을 포함한 안구 표면 구조는 외부 장애로부터 다른 더 깊은 안구 조직을 보호합니다. 눈의 투명한 전면 부분인 각막은 눈안으로 빛을 지시하고 보호 장벽으로 반응하는 굴절 렌즈로 기능합니다. 각막 상피는 각막의 가장 바깥쪽 층이며 피상 세포, 날개 세포 및 기저 세포의 뚜렷한 층으로 구성됩니다. 각막 스트로마는 정교하게 포장된 콜라주누우스 라멜라에 각질 세포가 내장되어 있습니다. 각막 내피, 평평한 육각 세포의 단일 층은 펌핑 기능1을통해 상대적으로 탈수 된 상태에서 각막 스트로마를 유지함으로써 각막의 투명성을 유지하는 데 중요한 역할을한다. 림푸스는 각막과 결막 사이의 경계를 형성하고, 각막 상피 줄기 세포2의저수지이다. 혈관이 높게 한 결막은 점액과 눈물3을생성하여 눈을 윤활하는 데 도움이됩니다.
각막 표면 구조의 세포 역학은 기존의 조직학적 분석 또는 생체 내 세포 배양에 의해 연구되며, 이는 생체 내 세포 역학을 적절히 시뮬레이션하지 못할 수 있다. 비침습적 라이브 이미징 접근법은 그러한 격차를 해소할 수 있습니다. 고해상도, 최소한의 광손상 및 심층 이미징 깊이를 포함하는 장점으로 인해 MPM은,,4, 5,56,67,8의다양한 생물학적연구에서강력한 양식이되었습니다. 각막 이미징의 경우, MPM은 세포 내 NAD(P)H에서 유래한 본질적인 자동 형광으로부터 세포 정보를 제공합니다. 펨토초 레이저 스캐닝 하에서 비중심형 I 콜라겐 섬유로부터 유래된 제2 고조파 생성(SHG) 신호는 추가 염색 절차 없이 콜라주기누우스 기질 구조를 제공한다9. 이전에는 동물 및 인간 각막9,,,10, 11,12,,13,14,1115의이미징을 위해,MPM을악용했습니다.
특정 세포 집단에서 형광 단백질을 나타내는 형질 전환 마우스 라인은 개발, 조직 항상성, 조직 재생 및 발암 발생을 포함한 세포 생물학의 다양한 연구에 널리 사용되어 왔다. 우리는 각막9,10,모낭 10및표피10MPM에 의하여 생체 내 화상 진찰을10 위한 형광 단백질로 표지된 형질 마우스 균주를 이용했습니다. TdTomato와 EGFP로 태그된 세포막을 가진 이중 형광 마우스 변형은 두 개의 마우스 균주에서 사육됩니다: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J,#021847)16 및 mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-t., 1.#007676 1.17 R26R-GR 형질전환 마우스 라인은 H2B-EGFP 융합 유전자 및 mCherry-GPI 앵커 신호 융합 유전자를 포함하는 이중 형광 단백질 리포터 생성을 포함하며, Gt(ROSA)26Sor 궤적에 삽입된다. mT-mG 형질균은 세포막 표적 tdTomato 및 EGFP 형광 크레 리포터 마우스이다. Cre 재조합 전에, tdTomato 형광 발현을 가진 세포막 단백질은 각종 세포에서 널리 존재한다. 이 형질전환 마우스 변형은 우리가 Cre 흥분없이 tdTomato핵-EGFP 및 막을 시각화 할 수 있습니다. 두 암컷 (R26R-GR+/+)및 한 남성 (mT-mG+/+)형질 전환 마우스실험에 대 한 충분 한 마우스를 생산 하기 위해 함께 사육 되었다. R26R-GR+/-;mT-mG+/- 유전자형, 이중 형광 마우스 균주를 가진 그들의 자손은 이 연구에서 사용되었습니다. 앞서설명한9,10,이 이중 형광 기자 마우스 균주는 이전에 설명한 바와 같이 하나의 형광 기자 마우스 라인과 비교하여, 이 이중 형광 기자 마우스 균주는 이미징 시간의 50% 감소 된 취득을 우리에게 제공합니다.
이 작품에서, 우리는 우리의 화상 진찰 플랫폼 및 이중 형광 형질 전환 마우스를 사용하여 단계별로 안구 표면의 생체 내 화상 진찰을 위한 상세한 기술 프로토콜을 기술합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제어 소프트웨어가 있는 이 맞춤형 MPM 이미징 플랫폼은 피부10,모낭10 및 안구 표면9,,10 (도 1A)을포함한 마우스 상피 기관의 인탈 이미징에 사용되었습니다. 맞춤형 시스템은 프로젝트 시작부터 다양한 실험을 위한 광학 부품을 유연히 변경하는 데 사용되었습니다. 이 이미징 방법론은 상용 MPM ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
대만 과학기술부(106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089)의 보조금 지원에 감사드립니다. 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), 국립 대만 대학 병원 (NTUH108-T17) 및 창궁 기념 병원, 대만 (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3GG16222, CMRPG3G1622).
Materials
| AVIZO Lite software | Thermo Fisher Scientific | Version: 2019.3.0 | |
| Bandpass filters | Semrock | FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40 |
|
| Dichroic mirrors | Semrock | FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36 | |
| Galvano | Thorlabs | GVS002 | |
| Jade BIO control software | SouthPort Corporation | Jade BIO | |
| Oxybuprocaine hydrochloride | Sigma | O0270000 | |
| PMT | Hamamatsu | H7422A-40 | |
| Polyesthylene Tube | BECTON DICKINSON | 427401 | |
| Stereotaxic mouse holder | Step Technology Co.,Ltd | 000111 | |
| Ti: Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai-Tai DeepSee | |
| Upright microscopy | Olympus | BX51WI | |
| Vidisic Gel | Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH | D13581 | |
| Zoletil | Virbac | VR-2831 |
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