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Biochemistry

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/60950
Automatic Translation
1, *1, *1,2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College
* These authors contributed equally

Summary

Herkömmliche BODIPY-Konjugate können für die livezellige Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) durch Ausnutzung ihrer vorübergehend bildenden, rot verschiebeten Bodenzustandsdimer eingesetzt werden. Wir präsentieren ein optimiertes SMLM-Protokoll zur Verfolgung und Auflösung subzellulärer neutraler Lipide und Fettsäuren in lebenden Säugetier- und Hefezellen auf der nanoskopischen Längenskala.

Abstract

Die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM)-Techniken überwinden die optische Beugungsgrenze der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie und können intrazelluläre Strukturen und die Dynamik von Biomolekülen mit einer Genauigkeit von 20 nm auflösen. Eine Voraussetzung für SMLM sind Fluorophore, die von einem dunklen in einen fluoreszierenden Zustand übergehen, um eine räumlich-zeitliche Überlappung ihrer Punktausbreitungsfunktionen in jedem der Tausenden von Datenerfassungsrahmen zu vermeiden. BODIPYs sind etablierte Farbstoffe mit zahlreichen Konjugaten, die in der konventionellen Mikroskopie verwendet werden. Die transiente Bildung rot verschiebtiger BODIPY-Boden-Dimere (DII) führt zu einer hellen Einzelmolekülemission, die eine Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) ermöglicht. Hier präsentieren wir ein einfaches, aber vielseitiges Protokoll für SMLM mit konventionellen BODIPY-Konjugaten in lebenden Hefe- und Säugetierzellen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um hochauflösende Bilder zu erfassenII und einzelne BODIPY-D II-Zustände zu verfolgen, um räumlich-zeitliche Informationen von BODIPY-Konjugaten zu extrahieren. Wir wenden dieses Verfahren an, um Lipidtröpfchen (LDs), Fettsäuren und Lysosomen in lebenden Hefe- und Säugetierzellen auf der nanoskopischen Längenskala aufzulösen. Darüber hinaus demonstrieren wir die mehrfarbige Bildgebungsfähigkeit mit BODIPY-Farbstoffen in Verbindung mit anderen fluoreszierenden Sonden. Unsere repräsentativen Ergebnisse zeigen die differenzierte räumliche Verteilung und Mobilität von BODIPY-Fettsäuren und neutralen Lipiden in Hefe unter gefütterten und gefasteten Bedingungen. Dieses optimierte Protokoll für SMLM kann mit Hunderten von kommerziell erhältlichen BODIPY-Konjugaten verwendet werden und ist eine nützliche Ressource, um biologische Prozesse im Nanomaßstab weit über die Anwendungen dieser Arbeit hinaus zu untersuchen.

Introduction

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) Techniken wie stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) haben sich als Methoden zur Erzeugung von hochauflösenden Bildern mit Informationen jenseits der optischen Beugungsgrenze1,2 und zur Verfolgung der Dynamik einzelner Biomoleküle3,4herauskristallisiert. Eine der Anforderungen für Sonden, die mit SMLM kompatibel sind, ist die Fähigkeit, die Anzahl der aktiven Fluorophore jederzeit zu kontrollieren, um räumliche Überschneidungen ihrer Punktstreufunktionen (PSF) zu vermeiden. In jedem der Tausenden von Datenerfassungsrahmen wird dann die Position der einzelnen fluoreszierenden Fluorophore mit einer Genauigkeit von 20 nm bestimmt, indem die entsprechende Punktstreufunktion angebracht wird. Traditionell wurde das On-Off-Blinken von Fluorophoren durch stochastisches Photoswitching1,2,5 oder chemisch induziertes intrinsisches Blinken6gesteuert. Weitere Ansätze sind die induzierte Aktivierung von Fluorogenen bei vorübergehender Bindung an ein fluorogen-aktivierendes Protein7,8 und die programmierbare bindungsfreie Bindung von markierten DNA-Oligomeren in der gesamten inneren Reflexionsfluoreszenz (TIRF) oder Lichtblattanregung9. Kürzlich berichteten wir über eine neuartige und vielseitige Etikettierungsstrategie für SMLM10, in der zuvor gemeldete rot verschiebte Dimer (DII) Zustände herkömmlicher Bor-Di-Pyromethan (BODIPY)-Konjugate11,12,13 vorübergehend bilden und speziell angeregt und mit rot verschobenen Wellenlängen erkannt werden.

BODIPYs sind weit verbreitete Farbstoffe mit Hunderten von Varianten, die speziell subzelluläre Kompartimente und Biomoleküle14,15,16kennzeichnen. Aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit und Anwendbarkeit in lebenden Zellen sind BODIPY-Varianten für die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie im Handel erhältlich. Hier beschreiben wir ein detailliertes und optimiertes Protokoll, wie die Hunderte von kommerziell erhältlichen BODIPY-Konjugaten für Live-Cell-SMLM verwendet werden können. Durch die Optimierung der Konzentration von BODIPY-Monomeren und die Optimierung der Anregungslaserkräfte, Bildgebungs- und Datenanalyseparameter werden hochwertige hochauflösende Bilder und Einzelmolekül-Tracking-Daten in lebenden Zellen gewonnen. Bei geringer Konzentration (25-100 nM) können BODIPY-Konjugate gleichzeitig für SMLM im rot verschiebten Kanal und für die korrelative konventionelle Fluoreszenzmikroskopie im konventionellen Emissionskanal eingesetzt werden. Die erhaltenen Einzelmoleküldaten können analysiert werden, um die räumliche Organisation unbeweglicher Strukturen zu quantifizieren und die diffusiven Zustände von Molekülen in lebenden Zellen zu extrahieren17. Die Verfügbarkeit von BODIPY-Sonden in grüner und roter Form ermöglicht eine mehrfarbige Bildgebung, wenn sie in der richtigen Kombination mit anderen kompatiblen Fluorophoren verwendet wird.

In diesem Bericht bieten wir ein optimiertes Protokoll zum Erfassen und Analysieren von Live-Zell-SMLM-Daten mit BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rot und Lysotracker-Grün in mehreren Farben. Wir lösen Fettsäuren und neutrale Lipide in lebenden Hefe- und Säugetierzellen mit einer Auflösung von 30 nm. Wir zeigen weiter, dass Hefezellen die räumliche Verteilung von extern zugesetzten Fettsäuren in Abhängigkeit von ihrem Stoffwechselzustand regulieren. Wir stellen fest, dass zugesetzte BODIPY-Fettsäuren (FA) das endoplasmatische Retikulum (ER) und Lipidtröpfchen (LDs) unter gefütterten Bedingungen lokalisieren, während BODIPY-FAs beim Fasten nicht-LD-Cluster in der Plasmamembran bilden. Wir erweitern die Anwendung dieser Technik auf Bildlysosomen und LDs in lebenden Säugetierzellen. Unser optimiertes Protokoll für SMLM mit herkömmlichen BODIPY-Konjugaten kann eine nützliche Ressource sein, um biologische Prozesse im Nanomaßstab mit den unzähligen verfügbaren BODIPY-Konjugaten zu untersuchen.

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Protocol

HINWEIS: Zum Hefeklonen und endogenen Tagging lesen Sie bitte unsere aktuelle Publikation10.

1. Herstellung von Hefezellproben zur Bildgebung

  1. Bereiten Sie eine flüssige Nachtkultur eines w303 Hefestamms vor. Mit einem sterilen Holzstab, erkennen Sie eine kleine Menge von Hefezellen aus einer Agarplatte, die Hefeextrakt-Pepton-Dextrose in einem Kulturrohr mit 2 ml synthetischem Komplett-Dextrose-Medium (SCD) enthält. Inkubieren Sie die Röhre über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 270 U/min und 30 °C.
  2. Führen Sie eine 1:50-Morgenverdünnung der Zellen in SCD durch. Die verdünnten Zellen für 4 h bei 30 °C in einem 270 Rpm-Shaking-Inkubator weiter bebauen, so dass die Zellen in exponentiellen Phasen wachsen und eine optische Dichte (OD) von 0,6 erreichen können.
    HINWEIS: Das Verfahren kann hier variieren, je nachdem, welcher Stoffwechselzustand untersucht wird. BODIPY-Konjugate benötigen keine Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase. Beachten Sie jedoch die Autofluoreszenz von abgestorbenen Zellen während der stationären Phase, da es ein HintergrundsignalII verursachen kann, das zu stark ist, um einzelne BODIPY-D II-Emitter zu analysieren.
  3. Für das Studium von Fastenzellen, wachsen die Hefekultur für 2 Tage ohne Austausch von Medien.
  4. In 30 min vor der Beschichtung der Zellen ein kammerkammeriertes Deckglas mit 80 l mit 0,8 mg/ml sterilem Concanavalin A (ConA) bei deionisiertemH2O bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 30 min das Deckglas dreimal mit deionisiertem H2O waschen.
  5. Bei 30 min vor der Bildgebung pipette die Zellen auf dem kammerierten Deckglas, mit dem richtigen Volumen von frischem SCD, um eine optische Dichte von 0,12 zu erreichen (typischerweise 60 L Hefekultur bei OD 0,6 in 240 L SCD). Lassen Sie die Zellen sich absetzen und 30 min an der ConA-Oberfläche haften.
  6. Fügen Sie das gewünschte BODIPY-Konjugat bei einer Endkonzentration von 100 nM direkt in das kammergekammerte Deckglas ein.
    HINWEIS: Je nach lokaler Dichte von BODIPYs in einem bestimmten Zellfach kann ein BODIPY-Konzentrationsoptimierungsexperiment erforderlich sein.

2. Vorbereitung von Säugetierzellen für die SMLM-Bildgebung

  1. Pflegen Sie die Säugetier-U2OS-Zellen in nicht fluoreszierenden DMEM mit 10% fetalem Rinderserum, 4 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 1% Penicillin-Streptomycin-Antibiotika in einem T25-Kolben.
    HINWEIS: Zellen können auch in DMEM mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin-Antibiotika aufrechterhalten werden, jedoch muss das Medium vor der Bildgebung mit einer nicht-autofluoreszierenden Lösung ausgetauscht werden.
  2. Teilen Sie die Zellen bei 70-80% Konfluenz 1:5 in einem einzigen Brunnen einer 8-Well-Platte. Kultur die Zellen in der 8-Well-Platte für 12 bis 24 h vor der Bildgebung.
  3. Fügen Sie BODIPY-C12, LysoTracker Green oder ein anderes BODIPY-Konjugat in einer Endkonzentration von 100 nM (Lagerlösungen in Dimethylsulfoxid [DMSO]) 10 min vor der Bildgebung hinzu. Diese Zeit kann je nach gewünschtem Experiment variieren.
    HINWEIS: Die Bildgebung kann bei Umgebungstemperatur (23 °C) mit einer Live-Zell-Bildgebungslösung durchgeführt werden. Die Bildgebung bei 37 °C und 5 %CO2 mit nicht fluoreszierendem DMEM gemischt mit 10 % fetalem Rinderserum, 4 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 1 % Penicillin-Streptomycin-Antibiotika wird jedoch bevorzugt, um Zellen näher an physiologischen Bedingungen zu halten und biologische Schlussfolgerungen zu ziehen.

3. Gerätevorbereitung

  1. Montieren Sie die entsprechenden Filtersätze in den Emissionspfad, basierend auf der verwendeten Emissionsfarbe von BODIPY.
    HINWEIS: Ein vierband-dichroitischer Spiegel (zt/405/488/561/640rdc) trennt zunächst die Anregung vom Emissionslicht. Die grüne Emission (525 nm) und die rote Emission (595 nm) werden dann durch einen dichroitischen Langpass-Strahlteiler (T562lpxr) geteilt, gefolgt von Bandpassfiltern ET525/50 im grünen Kanal und ET 595/50 im roten Kanal. Die beiden Kanäle werden dann auf verschiedene Bereiche desselben Kamerachips projiziert. Ebenso werden die rote Emission (595 nm) und die far-rote Emission zunächst durch einen dichroitischen Langpass-Strahlteiler (FF652-Di01) geteilt, gefolgt von Bandpassfiltern ET 610/75 im Rot und FF731/137 im fernroten Kanal.
  2. Mikroskop, Mikroskopstufe, Laser (488 nm, 561 nm) und Kamera einschalten. Hier kommen ein invertiertes Mikroskop mit perfektem Fokussystem und einer auf -68 °C gekühlten EMV-Kamera zum Einsatz.
  3. Fügen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Mikroskop objektiv.
  4. Öffnen Sie die Hal4000-Software (siehe Materialtabelle),die das LED-Licht für Lichtfeld-Bildgebung, Laserleistungen, Laserläden und Kameraeinstellungen für die Bildgebung steuert. Stellen Sie die EMVCD-Verstärkung auf 30 und die Kameratemperatur auf -68 °C ein. Bereiten Sie die Kamera und die entsprechende Software vor, um Filme mit 20 Hz aufzunehmen.
    HINWEIS: Diese Technik gilt für jedes Weitfeldmikroskop, das in der Lage ist, fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) zu fotografieren. Entsprechende Software kann variieren.
  5. Schalten Sie die Mikroskop-Bühnenheizung ein und stellen Sie sie auf eine Temperatur von 37 °C und auf einenCO2-Gehalt von 5 %. Passen Sie den Objektivkorrekturkragen entsprechend an.
  6. Montieren Sie die Probe auf der Mikroskopstufe und fokussieren Sie, bis das Fokussiersystem eingreift. Verschieben Sie die Bühne mit dem Stufencontroller, bis fehlerbesagte Zellen im Sichtfeld angezeigt werden.
    HINWEIS: Für die Bildgebung mit Hefezellen bei Raumtemperatur ist es nicht erforderlich, die Heizung oderCO2-Steuerung einzuschalten.
  7. Schalten Sie die entsprechenden Laser für die Anregung von Monomeren sowie Dichern ein. Für BODIPY green oder LysoTracker green verwenden wir einen 561 nm Laser, um DII-Zustände für SMLM zu erregen, und einen 488 nm Laser, um Monomere für konventionelle Fluoreszenz zu begeistern.
    HINWEIS: Verwenden Sie für BODIPY red einen 640II nm Laser, um D II-Zustände für SMLM zu erregen, und einen 561 nm-Laser, um die Monomere für konventionelle Fluoreszenz zu begeistern. Passen Sie für BODIPY red die Laserstärken 561 nm und 640 nm an, um die Massenfluoreszenz im roten Kanal und einzelne Molekülausbrüche im weitroten Kanal zu visualisieren. Die typische Leistung für 561 nm beträgt 0,06 W/cm2 und 5 kW/cm2 für 640 nm. Für BODIPY green erwarten Sie auch konventionelle Fluoreszenz im grünen Emissionskanal unter 561 nm Anregung. Für BODIPY rot, erwarten, dass konventionelle Fluoreszenz im roten Kanal unter 640 nm Anregung zu sehen. Dieses Signal entsteht durch Anti-Stokes-Emission, die für Monomer/Dimer-Co-Lokalisierungsbilder mit kontinuierlicher Laseranregung nützlich wird.

4. Datenerfassung

  1. Laden Sie Laser-Shutter-Sequenzen zur Anregung von Monomeren sowie Dichern.
    HINWEIS: Wir verwenden in der Regel neun einzelne Molekül-Anregungsrahmen bei 561 nm, gefolgt von einem konventionellen Anregungsrahmen bei 488 nm. Dies bietet ein helleres konventionelles Fluoreszenzsignal und vermeidet das Auslaufen weiterer 488 nm erregbarer Fluorophore wie grünes Fluoreszenzprotein (GFP) in den roten Einzelmolekül-Detektionskanal in mehrfarbigen Bildgebungsanwendungen. Alternativ können Sie den 561 nm Laser kontinuierlich einschalten und sich auf die Anti-Stokes-Emission für herkömmliche Bilder im kürzeren Wellenlängenkanal verlassen.
  2. Tune die Laser-Kräfte so, dass einzelne Molekül Fluoreszenz Bursts im rot-versetzten Emissionskanal unter 561 nm Anregung erkannt werden, und konventionelle Fluoreszenz erscheint im grünen Emissionskanal mit 488 nm Anregung. Typische Laserleistungen des 561 nm Lasers werden für SMLM um 0,8-1 kW/cm2 und für den 488 nm Laser im herkömmlichen Fluoreszenz-Bildgebungsmodus um 0,035-0,07 W/cm2 betragen.
  3. Wählen Sie einen Zielordner für Filme aus, und zeichnen Sie 5.000-20.000 Erfassungsframes auf, um genügend Lokalisierungen für die Rekonstruktion von Bildern mit super Auflösung zu sammeln.
  4. Wechseln Sie zu verschiedenen Sichtfeldern, und wiederholen Sie die obigen Schritte, um Daten aus mehr Zellen zu sammeln.

5. Datenanalyse und Einzelmolekül-Tracking

  1. Laden Sie den Film in eine SMLM-Analysesoftware.
    HINWEIS: Jede Software18 kann verwendet werden. Wir verwenden INSIGHT (siehe Tabelle der Materialien) und kreuzvalidieren die Ergebnisse mit dem ThunderSTORM19 Plugin für imageJ (Fidschi).
  2. Den Film visuell abschirmen und Kontrasteinstellungen so anpassen, dass ein-Molekül-Fluoreszenzblinken sichtbar ist. Beschränken Sie bei Bedarf den Bereich oder den Rahmenbereich für die SMLM-Datenanalyse, wenn Teile der Probe kontinuierlich fluoreszieren.
  3. Festlegen von Einzelmolekül-Identifikationsparametern für die Anpassung an 2D Gaussian PSFs (ROI: 7 x 7 Pixel mit Pixelgröße 160 nm, Breite 260-650 nm, Höhe > 50 Photonen). Visuelle Stellbilder durch einige Beispielrahmen, um die Identifikationsparameter zu überprüfen und die unterschiedlichen Fluoreszenzausbrüche eines einzelnen Moleküls zuverlässig zu erkennen (siehe Abbildung 1C).
    HINWEIS: Bestimmte Identifikationsparameter wie Höhe und Breite können leicht angepasst werden, um die Erkennung von visuell wahrgenommenen Fluoreszenzsignalen für einzelne Moleküle zu optimieren.
  4. Führen Sie die SMLM-Bildanalyse mit den optimierten Identifikationsparametern durch und rendern Sie dann jedes einzelne Molekül als 2D-Gaußian, dessen Breite durch die umgekehrte Quadratwurzel der erkannten Anzahl von Photonen gewichtet wird.
  5. Bewerten Sie die Qualität der Daten. Verwenden Sie eingeschränkte Rahmenbereiche, um einzelne Molekülverteilungen in spezifischeren Fällen zu beobachten. Dies kann für Organellenbewegungen während der Datenerfassung verantwortlich sein.
  6. Um die räumliche Verteilung und Dynamik der Molekülverteilungen weiter zu analysieren, exportieren Sie die erhaltene Molekülliste mit den Koordinaten, Rahmen des Aussehens, Photonen, Breiten und Höhen der Lokalisationen. Importieren Sie die Molekülliste in benutzerdefinierten schriftlichen Analyseverfahren.
  7. Um räumliche Informationen über die Verteilung des einzelnen Moleküls zu erhalten, berechnen Sie die radiale Verteilungsfunktion (r), die die Dichte der Lokalisierungen als Funktion des Radialabstands20darstellt. Um die Anzahl der Durchtrennungen zu erhalten, berechnen Sie die eindeutigen paarweisen Abstände aller Lokalisierungen, konstruieren Sie das Histogramm mit Behältern, die bei ri mit der Höhe H(ri)zentriert sind und mit einer Breite dr und dividieren durch 2'ri*dr; ((ri) = H(ri)/(ri+dr)2-ri2). Die radiale Verteilungsfunktion kann dann verwendet werden, um den Cluster-Grad sowie die charakteristische Größe von Clustern zu quantifizieren und zu vergleichen.
  8. Um dynamische Informationen über die Diffusion von Molekülen zu erhalten, verbinden Sie Lokalisierungen, die beispielsweise innerhalb von 3 Pixeln (0,48 m) in aufeinander folgenden Datenerfassungsrahmen auftreten, um einzelne Molekülspuren zu erstellen.
    HINWEIS: Die Verbindungsentfernung hängt von der Diffusion von Molekülen und der Dichte der Lokalisierungen ab. Der maximale Verbindungsabstand kann geschätzt werden, indem die Dichte der Lokalisierungen in jedem Frame21,22analysiert wird. Die durchschnittliche Dichte wurde auf 0,043 Lokalisierungen pro m2festgelegt; So lag ein Radius von 0,48 m innerhalb einer niedrigen Dichte, um sicherzustellen, dass verschiedene Moleküle nicht miteinander verbunden waren.
  9. Durchschnittlich die Verschiebungen für unterschiedliche Verzögerungszeiten von mehreren Spuren, die mindestens drei Verzögerungszeiten dauern, um eine mittlere quadratische Verschiebung (MSD) im Vergleich zu einem Plot zu erzeugen. Passen Sie die MSD-Kurve mit der Gleichung MSD = 4D t +2 an, um den durchschnittlichen Diffusionskoeffizienten D3zu berechnen.

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Representative Results

Hier stellen wir ein optimiertes Probenvorbereitungs-, Datenerfassungs- und Analyseverfahren für SMLM mit BODIPY-Konjugaten auf der Grundlage des obigen Protokolls vor (Abbildung 1A). Um ein Beispiel für den Workflow zum Erfassen und Analysieren von SMLM-Daten zu veranschaulichen, verwenden wir BODIPY (493/503) in Hefe, um LDs unterhalb der optischen Beugungsgrenze aufzulösen (Abbildung 1B-F). Beispiele für die verschiedenen mehrfarbigen Bildgebungsmodi von BODIPY in Verbindung mit anderen Sonden wie GFP, mEos2 sind in Abbildung 2dargestellt. Wir manipulieren den Stoffwechselzustand in Hefe, indem wir sie im gleichen Medium für 48 h anbauen und zeigen, dass BODIPY-C12 unbewegliche Nicht-LD-Cluster in der Zellperipherie bildet, wenn sie fasten, im Gegensatz zu ihrer Aufnahme in LDs unter gefütterten Bedingungen (Abbildung 3). Um die SMLM-Fähigkeit von BODIPY-Konjugaten auf Säugetierzellen weiter auszubauen, stellen wir BODIPY-C12 und LysoTracker-green in lebenden U2OS-Zellen ab (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1: Optimierung der SMLM-Datenerfassung und -analyse mit BODIPY-Farbstoffen. (A) Workflow zur Optimierung von Fluoreszenzsignalen für einzelne Moleküle und Nachbearbeitung der SMLM-Daten von BODIPY-Konjugaten. (B) LED-Bild (links), konventionelles Fluoreszenzbild (Mitte, Anregung: 488 nm, Emission: 525 nm) und Anti-Stokes-Bild (rechts, Anregung: 561 nm, Emission: 525 nm) von Hefezellen, die mit dem LD-Marker BODIPY (493/503) befleckt sind. (C) Einzelne SMLM-Rahmen mit singe BODIPY DII Emitter (Anregung: 561 nm, Emission: 595 nm) bei zu geringer Dichte (links), optimale Dichte (Mitte) und zu hohe Dichte (rechts). (D) Optimierung der SMLM-Analyseparameter. Bei einem zu hohen Photonenzahlenschwellenwert verfehlt die Software gültige Einzelmolekülsignale (links), erkennt alle Moleküle mit einer optimalen Photonenschwelle (Mitte) und erkennt falsche Lokalisierungen mit zu niedrigen Photonenschwellen (rechts). (E) SMLM-Bild von BODIPY (493/503) löst die Größe von LDs (links, Zoom) mit einem mittleren Durchmesser von 125 nm auf. (F) Die Einzelmolekülverfolgung zeigt eine begrenzte Diffusion von BODIPY (493/503) in LDs (links). Traces werden verwendet, um die MSD-vs. Zeitkurve zu berechnen, die subdiffusives Verhalten in LDs (rechts) aufweist. Maßstabsbalken = 1 m, Zoom = 100 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Mehrfarbige SMLM-Bildgebung mit BODIPY-Konjugaten in lebenden Zellen. (A) Konventionelles Bild von BODIPY-C12 unter 488 nm Anregung (links). Entsprechendes SMLM-Bild mit DII-Zuständen von BODIPY-C12 unter 561 nm Anregung (Mitte) und Zoom (rechts) zeigt BODIPY-C12 in aufkommenden LDs. (B) Konventionelles Fluoreszenzbild des ER mit Sec63-GFP unter 488 nm Anregung (links) beschriftet. Gleichzeitig aufgenommenes konventionelles Fluoreszenzbild von BODIPY-C12 rot mit 561 nm Anregung (Mitte) und SMLM-Bild mit 640 nm Anregung (rechts). (C) Sequenzielle zweifarbige SMLM-Bildgebung von Sec63-mEos2 und BODIPY-C12 grün D II-Zustände.II Zunächst wird mEos2 mit hoher 405 nm Fotoaktivierung und 561 nm Anregung (links) abgebildet, gefolgt von einer langen Datenerfassung ohne 405 nm Aktivierung (Mitte). Maßstabsleiste = 1 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Differenzierte Fettsäureverteilung beim Fasten in Hefezellen. (A) Schematische Beschreibung verschiedener Stoffwechselzustände (gefütterter und gefasteter Zustand) basierend auf der Wachstumsdauer im SCD-Medium. B) Herkömmliche Fluoreszenzbilder (oben) zeigen, dass BODIPY-C12 rot mit BODIPY (493/503) unter gefütterten Bedingungen lokalisiert wird, die auf die Aufnahme in LDs hinweisen. Das SMLM-Bild (unten, links) zeigt dichte BODIPY-C12-Punktzeichen in LDs und einzelne Molekülspuren (unten, rechts) zeigen Diffusion entlang zellulärer Membranen. (C) Unter gefastem Zustand bildet BODIPY-C12 Punktias in der Zellperipherie, die nicht mit LDs kolokalisieren (oben: links, links, unten links). Das SMLM-Bild löst die Punktias und eingeschlossenen Spuren von BODIPY-C12 rot (unten, rechts). (D) Die radiale Verteilungsfunktion (links) zeigt beim Fasten eine höhere Clusterbildung von BODIPY-FAs. Die mittlere Quadratverschiebung vs. Zeitdiagramm der Einzelmolekülverfolgung (rechts) bestätigt die Immobilisierung von BODIPY-C12 beim Fasten. Skalenbalken = 1 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Bildgebung von BODIPY-Farbstoffen in lebenden Säugetier-U2OS-Zellen. (A) Konventionelles Fluoreszenzbild (links) von BODIPY-C12 bei 488 nm Anregung. Das entsprechende SMLM-Bild mitD-II-Zuständen (rechts) bei 561 nm Anregung zeigt die nanoskopische Verteilung vonD-II-Zuständen in U2OS-Zellen. Die Einschreiben zeigen Vergrößerungen von Lipidtröpfchen (Skala bar = 500 nm). (B) Konventionelles Bild von Lysosomen in U2OS-Zellen mit LysoTracker grün bei 488 nm Anregung (links). Das entsprechende SMLM-Bild von unbeweglichen Lysosomen (rechts, Skalenbalken = 5 m) bei 561 nm Anregung. Einset: SMLM-Bild eines optisch beugungsbegrenzten Lysosoms (Maßstabsbalken 100 nm). Die BODIPY-C12-Bilder wurden in einer Live-Zell-Bildgebungslösung bei 23 °C aufgenommen. Die Bilder von Lysosomen mit LysoTracker grün wurden in nicht fluoreszierendem DMEM mit 10% fetalem Rinderserum, 4 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 1% Penicillin-Streptomycin-Antibiotika bei 37 °C aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, wie herkömmliche BODIPY-Konjugate verwendet werden können, um SMLM-Bilder mit einer Größenordnungsverbesserung in der räumlichen Auflösung zu erhalten. Diese Methode basiert auf der Ausnutzung zuvorII gemeldeter, rot verschieber D-II-Zustände herkömmlicher BODIPY-Farbstoffe, die sich vorübergehend durch bimolekulare Begegnungen bilden. Diese Zustände können speziell angeregt und mit rot verschobenen Wellenlängen erkannt werden und sind spärlich und kurzlebig genug für SMLM. Durch die Abstimmung der Konzentration von BODIPY-Monomeren zusammen mit Laserparametern kann eine optimale Dichte der Lokalisierungen und Signal-rausch erreicht werden. Wir lösten die intrazelluläre Verteilung und Mobilität von Fettsäureanalogen und neutralen Lipiden mit einer Auflösung von 30 nm (theoretische Thompson-Formel) in lebenden Hefezellen unter gefütterten und gefastten Bedingungen. Wir stellten außerdem fest, dass 40II % der BODIPY D II-Zustände für zwei oder mehr Datenerfassungsrahmen bei 20 Hz erhalten bleiben, was es ermöglicht, ihre Mobilität unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren. Unsere Ergebnisse zeigen die Differentiallokalisierung und Mobilität von BODIPY-FAs beim Fasten und schlagen einen Schutzmechanismus gegen Lipotoxizität vor. Unsere Fähigkeit, einzelne BODIPY-Moleküle zu verfolgen und die Größe von LDs und BODIPY-FA-Punktias unterhalb der optischen Beugungsgrenze unter verschiedenen Stoffwechselzuständen aufzulösen, ist nur mit der entwickelten SMLM-Fähigkeit herkömmlicher BODIPY-Konjugate möglich. Die genauen molekularen Mechanismen und Wege, die an der räumlichen Regulation der Fettsäureverteilung und -aufnahme beteiligt sind, sind Gegenstand unserer zukünftigen Studien. Darüber hinaus haben wir die SMLM-Fähigkeit konventioneller BODIPY-Konjugate auf lebende Säugetierzellen erweitert, indem wir BODIPY-FAs und Lysosomen in U2OS-Zellen auflösten.

DieII Verwendung von D II-Zuständen herkömmlicher BODIPY-Konjugate für SMLM hat Vorteile gegenüber anderen Sonden, da Hunderte von verschiedenen BODIPY-Varianten kommerziell erhältlich sind, die bestimmte Moleküle oder Zellkompartimente in lebenden Zellen kennzeichnen. Die Probenvorbereitung ist so einfach wie das Hinzufügen des Farbstoffs bei niedrigen Konzentrationen (ca. 100 nM) vor der Bildgebung ohne Waschen. Im Gegensatz zu anderen PALM/STORM-Sonden, die im Laufe der Zeit bleichen, sind BODIPY-Monomere von der Anregung ihrerD-II-Zustände nicht betroffen und stellen daher eine fast nie erschöpfende Quelle für einzelne Molekülsignale in der Langzeitbildgebung. DaD-II-Zustände durch spontane bimolekulare Begegnungen entstehen, benötigt SMLM mitD-II-Zuständen keinen extern zusätzlichen Puffer, um blinkende23zu induzieren. Ebenso besteht keine Notwendigkeit für eine hochenergetische Fotoaktivierung, wie sie für neu synthetisierte fotoaktivierbare BODIPY-Versionen24 oder SMLM einiger konventioneller BODIPY-Farbstoffe21erforderlich ist, die sich bei der Langzeitbildgebung nachteilig auf die Zellgesundheit auswirken könnten25,26. Darüber hinaus erzeugt SMLM mitD-II-Zuständen eine inhärente Hintergrundunterdrückung nicht spezifisch interagierender Sonden aufgrund der quadratischen Abhängigkeit vonD-II-Zuständen von der Monomerkonzentration. Daher wird in SMLM-Bildern ein höherer Kontrast erreicht als bei herkömmlichen Sonden, deren monomeres Signal erkannt wird.

BODIPYs weisen eine schwache Anti-Stokes-Fluoreszenz auf, die die Anregung von Monomeren und Dimeren mit einem einzigen Laser bei hoher Anregungsleistung ermöglicht. Einerseits kann diese Eigenschaft für die gleichzeitige konventionelle Fluoreszenz- und SMLM-Bildgebung genutzt werden, um bewegte Strukturen zu verfolgen und zu lösen. Auf der anderen Seite erschwert es die Kombination von BODIPY D II-Zuständen mit anderen Sonden für die mehrfarbige Bildgebung, da das BODIPY-Signal zwei Emissionskanäle einnimmt. Mehrfarbene Bildgebung ist jedoch möglich, wenn Sonden sorgfältig ausgewählt werden, wie in Abbildung 2B mit Sec63-GFP und BODIPY-C12 rot dargestellt. Ebenso ist sequentielles zweifarbiges SMLM mit anderen fotoaktivierbaren Sonden wie mEos2 möglich, wie in Abbildung 2Cdargestellt. Weitere mögliche Kombinationen für zweifarbiges SMLM sind die Verwendung von grünen BODIPY-Konjugaten und einem 640 nm erregbaren Farbstoff wie JF646, das an das Halo-Tag27gebunden ist.

Zusammenfassend haben wir ein optimiertes Protokoll für SMLM mit herkömmlichen BODIPY-Farbstoffen vorgestellt, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Fettsäuren, neutralen Lipiden und Lysosomen auf der nanoskopischen Längenskala in lebenden Hefe- und Säugetierzellen zu untersuchen. Bei geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll auch für SMLM mit Hunderten anderer BODIPY-Konjugate über verschiedene Zelltypen hinweg anwendbar sein.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Acknowledgments

Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Vergabenummer R21GM127965 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

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References

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Biochemie Ausgabe 160 Fluoreszenzmikroskopie Superauflösungsmikroskopie Einzelmolekül-Tracking Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie BODIPY Boden-Zustands-Dimere Hefe Säugetierzellen
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Adhikari, S., Banerjee, C., Moscatelli, J., Puchner, E. M. Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking. J. Vis. Exp. (160), e60950, doi:10.3791/60950 (2020).

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