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Biochemistry

Conjugaciones BODIPY convencionales para microscopía de superresolución de células vivas y seguimiento de una sola molécula

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/60950
Automatic Translation
1, *1, *1,2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College
* These authors contributed equally

Summary

Los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para la microscopía de localización de células vivas de una sola molécula (SMLM) a través de la explotación de sus dimers de estado de tierra de formación transitoria y cambio de rojo. Presentamos un protocolo SMLM optimizado para rastrear y resolver lípidos neutros subcelulares y ácidos grasos en mamíferos vivos y células de levadura a escala de longitud nanoscópica.

Abstract

Las técnicas de microscopía de localización de molécula única (SMLM) superan el límite de difracción óptica de la microscopía de fluorescencia convencional y pueden resolver las estructuras intracelulares y la dinámica de las biomoléculas con una precisión de 20 nm. Un requisito previo para SMLM son los fluoróforos que pasan de un estado oscuro a un estado fluorescente para evitar la superposición espacio-temporal de sus funciones de propagación de puntos en cada uno de los miles de marcos de adquisición de datos. Los BODIPYs son tintes bien establecidos con numerosos conjugados utilizados en la microscopía convencional. La formación transitoria de dimers de estado de tierra BODIPY (DII)de cambio rojo da como resultado una emisión brillante de molécula única que permite la microscopía de localización de molécula única (SMLM). Aquí presentamos un protocolo simple pero versátil para SMLM con conjugados BODIPY convencionales en levaduras vivas y células de mamíferos. Este procedimiento se puede utilizar para adquirir imágenes de superresoría y para rastrear estados únicos BODIPY-DII para extraer información espacio-temporal de conjugados BODIPY. Aplicamos este procedimiento para resolver las gotas lipídicas (LD), los ácidos grasos y los lisosomas en las células vivas de levadura y mamíferos en la escala de longitud nanoscópica. Además, demostramos la capacidad de imagen multicolor con tintes BODIPY cuando se utilizan junto con otras sondas fluorescentes. Nuestros resultados representativos muestran la distribución espacial diferencial y la movilidad de los ácidos grasos BODIPY y los lípidos neutros en levaduras en condiciones de alimentación y ayuno. Este protocolo optimizado para SMLM se puede utilizar con cientos de conjugados BODIPY disponibles comercialmente y es un recurso útil para estudiar procesos biológicos a nanoescala mucho más allá de las aplicaciones de este trabajo.

Introduction

Las técnicas de microscopía de localización de una sola molécula (SMLM) como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de localización fotoactivada (PALM) han surgido como métodos para generar imágenes de superresolución con información más allá del límite de difracción óptica de Abbe1,,2 y para el seguimiento de la dinámica de biomoléculas individuales3,,4. Uno de los requisitos para las sondas compatibles con SMLM es la capacidad de controlar el número de fluoróforos activos en cualquier momento para evitar la superposición espacial de sus funciones de propagación de puntos (PSF). En cada uno de los miles de marcos de adquisición de datos, la ubicación de cada fluoróforos fluorescentes se determina con una precisión de 20 nm ajustando su función de dispersión de puntos correspondiente. Tradicionalmente, el parpadeo de encendido y apagado de los fluoróforos se ha controlado a través de fotointerrupción estocástica1,2,5 o intermitente intrínseco inducido químicamente6. Otros enfoques incluyen la activación inducida de fluorógenos en la unión transitoria a una proteína activadora de fluorógeno7,8 y la unión programable-unión-desvinculación de oligómeros de ADN etiquetados en fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) o excitación de lámina de luz9. Recientemente, informamos de una novedosa y versátil estrategia de etiquetado para SMLM10 en la que previamente se informaba de dimeric de cambio en rojo (DII)estados de conjugados convencionales de boro di-pirametano (BODIPY)11,12,13 se forman transitoriamente y se excitan específicamente y se detectan con longitudes de onda cambiadas en rojo.

Los BODIPYs son tintes ampliamente utilizados con cientos de variantes que etiquetan específicamente compartimentos subcelulares y biomoléculas14,,15,,16. Debido a su facilidad de uso y aplicabilidad en células vivas, las variantes BODIPY están disponibles comercialmente para la microscopía de fluorescencia convencional. Aquí, describimos un protocolo detallado y optimizado sobre cómo los cientos de conjugados BODIPY disponibles comercialmente se pueden utilizar para SMLM de células vivas. Al ajustar la concentración de monómeros BODIPY y al optimizar los poderes del láser de excitación, los parámetros de diagnóstico por imágenes y datos, se obtienen imágenes de alta calidad de superresolución y datos de seguimiento de moléculas únicas en células vivas. Cuando se utilizan a baja concentración (25-100 nM), los conjugados BODIPY se pueden utilizar simultáneamente para SMLM en el canal de cambio rojo y para la microscopía de fluorescencia convencional correlativa en el canal de emisión convencional. Los datos obtenidos de una sola molécula se pueden analizar para cuantificar la organización espacial de las estructuras inmóviles y extraer los estados difusos de las moléculas en las células vivas17. La disponibilidad de sondas BODIPY en formas verdes y rojas permite obtener imágenes multicolor cuando se utilizan en la combinación correcta con otros fluoróforos compatibles.

En este informe, proporcionamos un protocolo optimizado para adquirir y analizar datos SMLM de células vivas utilizando BODIPY-C12,BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rojo y lysotracker-green en múltiples colores. Resolvemos ácidos grasos y lípidos neutros en levaduras vivas y células de mamíferos con una resolución de 30 nm. Además, demostramos que las células de levadura regulan la distribución espacial de los ácidos grasos añadidos externamente dependiendo de su estado metabólico. Encontramos que los ácidos grasos BODIPY añadidos (FA) se localizan en el retículo endoplasmático (ER) y las gotas de lípidos (LD) en condiciones de alimentación, mientras que BODIPY-FAs forman racimos no LD en la membrana plasmática al en ayunar. Ampliamos aún más la aplicación de esta técnica para tomar imágenes de lisosomas y LDs en células de mamíferos vivos. Nuestro protocolo optimizado para SMLM utilizando conjugados BODIPY convencionales puede ser un recurso útil para estudiar los procesos biológicos a nanoescala con los innumerables conjugados BODIPY disponibles.

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Protocol

NOTA: Para la clonación de levadura y el etiquetado endógeno, consulte nuestra reciente publicación10.

1. Preparación de muestras de células de levadura para imágenes

  1. Preparar un cultivo líquido durante la noche de una cepa de levadura w303. Usando un palo de madera estéril, detecte una pequeña cantidad de células de levadura de una placa de agar que contiene extracto de levadura–peptona-dextrosa en un tubo de cultivo con 2 ml de dextrosa completa sintética (SCD) mediana. Incubar el tubo durante la noche en una incubadora de agitación a 270 rpm y 30oC.
  2. Realice una dilución de 1:50 por la mañana de las células en SCD. Continúe cultivando las células diluidas durante 4 h a 30 oC en una incubadora de agitación de 270 rpm, permitiendo que las células crezcan en fase exponencial y alcancen una densidad óptica (OD) de 0,6 euros.
    NOTA: El procedimiento puede variar aquí dependiendo del estado metabólico que se esté estudiando. Los conjugados BODIPY no requieren células en la fase de crecimiento exponencial. Sin embargo, ser consciente de la autofluorescencia de las células muertas durante la fase estacionaria, ya que puede causar una señal de fondo demasiado fuerte para analizar los emisores BODIPY-DII individuales.
  3. Para estudiar las células en ayunas, hacer crecer el cultivo de levadura durante 2 días sin intercambio de medios.
  4. A 30 min antes de encollar las células, incubar una cubierta de cámara con 80 ml de 0,8 mg/ml estéril de Concanavalina A (ConA) en H2O desionizado a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lave el vaso de la cubierta tres veces con H2O desionizado.
  5. A 30 minutos antes de la toma de imágenes, pipetee las celdas de la cubierta de cámara, con el volumen correcto de SCD fresco para lograr una densidad óptica de 0,12 euros (normalmente 60 l de cultivo de levadura a OD a 0,6 en SCD de 240 l). Deje que las células se asienten y se adhieran a la superficie de ConA durante 30 min.
  6. Añadir el conjugado BODIPY deseado directamente a la cubierta de cámara a una concentración final de 100 nM.
    NOTA: Es posible que se requiera un experimento de optimización de la concentración de BODIPY dependiendo de la densidad local de BODIPYs en un compartimiento celular determinado.

2. Preparación de células de mamíferos para imágenes SMLM

  1. Mantener las células U2OS de mamíferos en DMEM no fluorescente con 10% de suero bovino fetal, 4 mM de glutamina, 1 mM de piruvato sódico y 1% de antibióticos de penicilina-estreptomicina en un matraz T25.
    NOTA: Las células también se pueden mantener en DMEM con un 10% de suero bovino fetal y un 1% de antibióticos de penicilina-estreptomicina, sin embargo, el medio debe intercambiarse antes de tomar imágenes con una solución no autofluorescente.
  2. Dividir las células en 70-80% confluencia 1:5 en un solo pozo de una placa de 8 pozos. Cultivo de las células en la placa de 8 pozos durante 12 a 24 h antes de la toma de imágenes.
  3. Añadir BODIPY-C12, LysoTracker Green o cualquier otro conjugado BODIPY a una concentración final de 100 nM (soluciones de stock en dimetil sulfóxido [DMSO]) 10 min antes de la toma de imágenes. Este tiempo puede variar en función del experimento deseado.
    NOTA: Las imágenes se pueden realizar a temperatura ambiente (23 oC) utilizando una solución de imágenes de células vivas. Sin embargo, se prefiere tomar imágenes a 37oC y 5% deCO2 con DMEM no fluorescente mezclado con 10% de suero bovino fetal, 4 mM de glutamina, 1 mM de piruvato sódico y 1% de antibióticos de penicilina-estreptomicina para mantener las células más cerca de las condiciones fisiológicas y sacar conclusiones biológicas.

3. Preparación del equipo

  1. Monte los conjuntos de filtros apropiados en la ruta de emisión en función del color de emisión de BODIPY que se esté utilizando.
    NOTA: Un espejo dicroico de cuatro bandas (zt/405/488/561/640rdc) separa primero la excitación de la luz de emisión. La emisión verde (525 nm) y la emisión roja (595 nm) se dividen por un divisor de haz de paso largo dicroico (T562lpxr) seguido de filtros de paso de banda ET525/50 en el canal verde y ET 595/50 en el canal rojo. Los dos canales se proyectan a diferentes áreas del mismo chip de cámara. Del mismo modo, la emisión roja (595 nm) y la emisión de rojo lejano se dividen primero por un divisor de haz de paso largo dicroico (FF652-Di01) seguido de filtros de paso de banda ET 610/75 en el rojo y FF731/137 en el canal rojo.
  2. Encienda el microscopio, la etapa del microscopio, los láseres (488 nm, 561 nm) y la cámara. Aquí se utiliza un microscopio invertido con un sistema de enfoque perfecto y una cámara EMCCD refrigerada a -68 oC.
  3. Añadir una gota de aceite de inmersión en el objetivo del microscopio.
  4. Abra el software Hal4000 (consulte la Tabla de materiales)que controla la luz LED para obtener imágenes de campo brillante, potencias láser, persianas láser y ajustes de cámara para imágenes. Establezca la ganancia de EMCCD en 30 y la temperatura de la cámara en -68 oC. Prepare la cámara y el software correspondiente para grabar películas a 20 Hz.
    NOTA: Esta técnica se aplica a cualquier microscopio de campo ancho capaz de microscopía de localización fotoactivada (PALM) y imágenes de microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM). El software correspondiente puede variar.
  5. Encienda el calentador de etapa del microscopio y colócalo a una temperatura de 37oC y a un nivel de CO2 del 5%. Ajuste el collar de corrección objetiva en consecuencia.
  6. Monte la muestra en la etapa del microscopio y concéntrese hasta que el sistema de enfoque se enganche. Mueva el escenario con el controlador de etapa hasta que aparezcan celdas sanas en el campo de visión.
    NOTA: Para la toma de imágenes con células de levadura a temperatura ambiente, no es necesario encender el calentador ni el control deCO2.
  7. Encienda los láseres apropiados para la excitación de monómeros, así como dimers. Para el verde BODIPY o el verde LysoTracker, utilizamos un láser de 561 nm para excitar los estados DII para SMLM y un láser de 488 nm para excitar monómeros para la fluorescencia convencional.
    NOTA: Para el rojo BODIPY, utilice un láser de 640 nm para excitar los estados DII para SMLM y un láser de 561 nm para excitar los monómeros para la fluorescencia convencional. Para el rojo BODIPY, ajuste las potencias láser de 561 nm y 640 nm para visualizar la fluorescencia a granel en el canal rojo y las ráfagas de molécula única en el canal rojo. La potencia típica para 561 nm es de 0,06 W/cm2 y 5 kW/cm2 para 640 nm. Para el verde BODIPY, espere también ver fluorescencia convencional en el canal de emisión verde bajo 561 nm de excitación. Para el rojo BODIPY, espere ver fluorescencia convencional en el canal rojo bajo excitación de 640 nm. Esta señal surge de la emisión anti-Stokes, que se convierte en útil para las imágenes de co-localización monomer/dimer con excitación láser continua.

4. Adquisición de datos

  1. Cargue secuencias de obturación láser para la excitación de monómeros, así como dimers.
    NOTA: Normalmente utilizamos nueve marcos de excitación de molécula única a 561 nm seguidos de un marco de excitación convencional a 488 nm. Esto ofrece una señal de fluorescencia convencional más brillante y evita la fuga de otro fluoróforo excitable de 488 nm, como la proteína fluorescente verde (GFP) en el canal rojo de detección de una sola molécula en aplicaciones de imágenes multicolor. Alternativamente, encienda el láser de 561 nm continuamente y confíe en la emisión anti-Stokes para imágenes convencionales en el canal de longitud de onda más corto.
  2. Sintonice las potencias láser de tal manera que las ráfagas de fluorescencia de molécula única se detecten en el canal de emisión desplazado en rojo bajo 561 nm de excitación, y la fluorescencia convencional aparece en el canal de emisión verde con 488 nm de excitación. Las potencias láser típicas del láser de 561 nm serán de alrededor de 0,8-1 kW/cm2 para SMLM, y de 0,035-0,07 W/cm2 para el láser de 488 nm en el modo de imagen de fluorescencia convencional.
  3. Elija una carpeta de destino para películas y grabe entre 5.000 y 20.000 marcos de adquisición para recopilar suficientes localizaciones para reconstruir imágenes de superresoría.
  4. Muévase a diferentes campos de visión y repita los pasos anteriores para recopilar datos de más celdas.

5. Análisis de datos y seguimiento de una sola molécula

  1. Cargue la película en un software de análisis SMLM.
    NOTA: Se puede utilizar cualquier software18. Utilizamos INSIGHT (ver la Tabla de Materiales)y validamos los resultados usando el plugin ThunderSTORM19 para imageJ (Fiji).
  2. Visualmente visualmente la película y ajuste los ajustes de contraste de modo que la fluorescencia de una sola molécula parpadee es visible. Si es necesario, restrinja la región o el rango de tramas para el análisis de datos SMLM si partes de la muestra son continuamente fluorescentes.
  3. Establezca parámetros de identificación de molécula única para el ajuste con PSF gaussianos 2D (ROI: 7 x 7 píxeles con tamaño de píxel 160 nm, ancho 260-650 nm, altura > 50 fotones). Visualmente visualmente a través de algunos marcos de ejemplo para comprobar los parámetros de identificación y detectar de forma fiable las distintas ráfagas de fluorescencia de molécula única (ver Figura 1C).
    NOTA: Ciertos parámetros de identificación, como la altura y la anchura, se pueden ajustar ligeramente para optimizar el reconocimiento de las señales de fluorescencia de molécula única percibidas visualmente.
  4. Realice el análisis de imágenes SMLM con los parámetros de identificación optimizados y, a continuación, represente cada molécula como un gaussiano 2D cuya anchura se pondera por la raíz cuadrada inversa del número detectado de fotones.
  5. Evaluar la calidad de los datos. Utilice rangos de trama restringidos para observar distribuciones de moléculas individuales en casos más específicos en el tiempo. Esto puede explicar el movimiento del organel durante la adquisición de datos.
  6. Para analizar más a fondo la distribución espacial y la dinámica de las distribuciones de moléculas, exporte la lista de moléculas obtenidas que contiene las coordenadas, marcos de apariencia, fotones, anchuras y alturas de las localizaciones. Importe la lista de moléculas en procedimientos de análisis escritos personalizados.
  7. Para obtener información espacial de la distribución de molécula única, calcule la función de distribución radial (r), que representa la densidad de las localizaciones en función de la distancia radial20. Para obtener las distancias únicas de todas las localizaciones, construya el histograma con bins centrados en ri con la altura H(ri) y con un ancho dr y divida por 2ori*dr; ((ri) á H(ri)/a(ri+dr)2-ri2). A continuación, se puede utilizar la función de distribución radial para cuantificar y comparar el grado de agrupación en clústeres, así como el tamaño característico de los clústeres.
  8. Para obtener información dinámica sobre la difusión de moléculas, vincule las localizaciones que aparecen, por ejemplo, dentro de 3 píxeles (0,48 m) en marcos de adquisición de datos consecutivos para crear trazas de moléculas únicas.
    NOTA: La distancia de enlace dependerá de la difusión de moléculas y de la densidad de localizaciones. La distancia máxima de enlace se puede estimar analizando la densidad de las localizaciones en cada fotograma21,,22. Se determinó que la densidad media era de 0,043 localizaciones porm 2; por lo tanto, un radio de 0,48 m estaba dentro de una densidad lo suficientemente baja como para garantizar que las diferentes moléculas no estuvieran unidas entre sí.
  9. Promediar los desplazamientos para diferentes tiempos de retraso a partir de múltiples trazas que duran al menos tres tiempos de retraso para crear un desplazamiento cuadrado medio (MSD) frente a la gráfica. Ajuste la curva MSD frente a la de T con la ecuación MSD a 4D - t +2 para calcular el coeficiente medio de difusión D3.

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Representative Results

Aquí, presentamos un procedimiento optimizado de preparación, adquisición y análisis de muestras para SMLM utilizando conjugados BODIPY basados en el protocolo anterior (Figura 1A). Para demostrar un ejemplo del flujo de trabajo para adquirir y analizar datos SMLM, empleamos BODIPY (493/503) en levadura para resolver LDs por debajo del límite de difracción óptica (Figura 1B-F). Ejemplos de los diferentes modos de imagen multicolor de BODIPY junto con otras sondas como GFP, mEos2 se muestran en la Figura 2. Manipulamos el estado metabólico de la levadura creciándolas en el mismo medio durante 48 h y mostramos que BODIPY-C12 forma racimos inmóviles no LD en la periferia celular en ayunas en contraste con su incorporación a los LD en condiciones de alimentación (Figura 3). Para ampliar aún más la capacidad SMLM de los conjugados BODIPY a las células de mamíferos, imagenmos BODIPY-C12 y LysoTracker-green en celdas U2OS vivas (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Optimización de la adquisición y análisis de datos SMLM utilizando tintes BODIPY. (A) Flujo de trabajo para optimizar señales de fluorescencia de molécula única y postprocesamiento de los datos SMLM a partir de conjugados BODIPY. (B) Imagen LED (izquierda), imagen de fluorescencia convencional (medio, excitación: 488 nm, emisión: 525 nm) y anti-Stokes imagen (derecha, excitación: 561 nm, emisión: 525 nm) de células de levadura manchadas con el marcador LD BODIPY (493/503). (C) Marcos SMLM individuales que muestran los emisores de singe BODIPY DII (excitación: 561 nm, emisión: 595 nm) a densidad demasiado baja (izquierda), densidad óptima (media) y densidad demasiado alta (derecha). (D) Optimización de los parámetros de análisis SMLM. Con un umbral de número de fotones demasiado alto, el software pierde señales válidas de molécula única (izquierda), detecta todas las moléculas con un umbral de fotón óptimo (medio) y detecta localizaciones falsas con umbrales de fotón demasiado bajos (derecha). ( E )Laimagen SMLM de BODIPY (493/503) resuelve el tamaño de los LD (izquierda, zoom) con un diámetro medio de 125 nm. (F) El seguimiento de moléculas únicas revela la difusión confinada de BODIPY (493/503) dentro de los LD (izquierda). Las trazas se utilizan para calcular la curva MSD frente a la curva de tiempo, que exhibe un comportamiento subdifusivo dentro de los LD (derecha). Barra de escala a 1 m, zoom a 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes SMLM multicolores utilizando conjugados BODIPY en células vivas. (A) Imagen convencional de BODIPY-C12 bajo excitación de 488 nm (izquierda). Imagen SMLM correspondiente utilizando estados DII de BODIPY-C12 bajo 561 nm de excitación (medio) y zoom (derecha) que revelan BODIPY-C12 en LDs emergentes. (B) Imagen de fluorescencia convencional de la ER etiquetada con Sec63-GFP bajo 488 nm de excitación (izquierda). Imagen de fluorescencia convencional grabada simultáneamente de rojo BODIPY-C12 con excitación de 561 nm (medio) e imagen SMLM utilizando excitación de 640 nm (derecha). (C) Imágenes SMLM secuenciales de dos colores de los estados Sec63-mEos2 y BODIPY-C12 verde DII. En primer lugar, mEos2 se obtiene una imagen con alta activación de fotos de 405 nm y excitación de 561 nm (izquierda) seguida de una larga adquisición de datos sin activación de 405 nm (medio). Barra de escala de 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Distribución diferencial de ácidos grasos en ayunas en las células de levadura. (A) Esquema que describe diferentes estados metabólicos (condición alimentada y en ayunas) en función de la duración del crecimiento en el medio SCD. B) Las imágenes de fluorescencia convencionales (arriba) muestran que EL rojo BODIPY-C12 se co-localiza con BODIPY (493/503) en condiciones de alimentación que indican la incorporación a los LD. La imagen SMLM (inferior, izquierda) muestra la densa puncta BODIPY-C12 en LDs y trazas de molécula única (inferior, derecha) exhiben difusión a lo largo de las membranas celulares. (C) En condiciones de ayuno, BODIPY-C12 forma puncta en la periferia celular que no co-localiza con LDs (superior: izquierda, media, izquierda inferior). La imagen SMLM resuelve los rastros puncta y confinados de rojo BODIPY-C12 (inferior, derecha). (D) La función de distribución radial (izquierda) muestra una agrupación más alta de BODIPY-FA al ayunar. La gráfica de desplazamiento medio cuadrado frente a tiempo de seguimiento de molécula única (derecha) confirma la inmovilización de BODIPY-C12 en ayunas. Barra de escala a 1 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes de tintes BODIPY en células U2OS de mamíferos vivos. (A) Imagen de fluorescencia convencional (izquierda) de BODIPY-C12 a 488 nm de excitación. La imagen SMLM correspondiente utilizando estados DII (derecha) a 561 nm de excitación muestra la distribución nanoscópica de los estados DII en la célula U2OS. Los insertos muestran aumentos de gotas de lípidos (barra de escala a 500 nm). (B) Imagen convencional de lisosomas en celdas U2OS utilizando LysoTracker verde a 488 nm de excitación (izquierda). La imagen SMLM correspondiente de los lisosomas inmóviles (derecha, barra de escala a 5 m) a 561 nm de excitación. Inserción: imagen SMLM de un lisosoma limitado de difracción óptica (barra de escala 100 nm). Las imágenes de BODIPY-C12 se grabaron en una solución de imágenes de células vivas a 23 oC. Las imágenes de lisosomas usando LysoTracker verde se registraron en DMEM no fluorescente con 10% de suero bovino fetal, 4 mM de glutamina, 1 mM de piruvato sódico y 1% de antibióticos de penicilina-estreptomicina a 37 oC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este protocolo, demostramos cómo los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para obtener imágenes SMLM con una mejora del orden de magnitud en la resolución espacial. Este método se basa en la explotación de los estados DII previamente reportados y desplazados en rojo de los tintes BODIPY convencionales, que se forman transitoriamente a través de encuentros bimolemosos. Estos estados pueden ser específicamente excitados y detectados con longitudes de onda cambiadas en rojo y son lo suficientemente escasos y efímeros para SMLM. Al ajustar la concentración de monómeros BODIPY junto con los parámetros láser, se puede lograr una densidad óptima de localizaciones y señal a ruido. Resolvimos la distribución intracelular y la movilidad de análogos de ácidos grasos y lípidos neutros con resolución de 30 nm (fórmula teórica de Thompson) en células de levadura vivas en condiciones alimentadas y ayunadas. También encontramos que el 40 % de los estados de BODIPY DII permanecen activados para dos o más marcos de adquisición de datos a 20 Hz, lo que permite que el seguimiento de una sola molécula cuantifique su movilidad en diferentes condiciones. Nuestros resultados muestran la localización diferencial y la movilidad de BODIPY-FAs en ayunas y sugieren un mecanismo de protección contra la lipotoxicidad. Nuestra capacidad para rastrear moléculas BODIPY individuales y resolver el tamaño de los LD y la puncta BODIPY-FA por debajo del límite de difracción óptica bajo diferentes estados metabólicos sólo es posible con la capacidad SMLM desarrollada de los conjugados BODIPY convencionales. Los mecanismos moleculares exactos y las vías implicadas en la regulación espacial de la distribución y absorción de ácidos grasos son el tema de nuestros estudios futuros. Además, ampliamos la capacidad SMLM de los conjugados BODIPY convencionales a las células de mamíferos vivos mediante la resolución de BODIPY-FA y lisosomas en células U2OS.

El uso de estados DII de conjugados BODIPY convencionales para SMLM tiene ventajas sobre otras sondas, ya que cientos de diferentes variantes BODIPY están disponibles comercialmente que etiquetan moléculas específicas o compartimentos celulares en células vivas. La preparación de la muestra es tan fácil como añadir el tinte a concentraciones bajas (100 nM) antes de la toma de imágenes sin ningún lavado. A diferencia de otras sondas PALM/STORM que blanquean con el tiempo, los monómeros BODIPY no se ven afectados por la excitación de sus estados DII y, por lo tanto, proporcionan una fuente casi nunca agotada para señales de moléculas individuales en imágenes a largo plazo. Dado que los estados DII surgen debido a encuentros bimolemosos espontáneos, SMLM que utiliza estados DII no requiere ningún búfer añadido externamente para inducir el parpadeo23. Del mismo modo, no es necesario activar la foto-activación de alta energía como se requiere para las versiones foto-activables24 o SMLM 24 o SMLM de algunos tintes BODIPY convencionales21, que podrían ser perjudiciales para la salud celular durante imágenes a largo plazo25,,26. Además, SMLM con estados DII crea una supresión de fondo inherente de sondas no específicamente interactuantes debido a la dependencia cuadrática de los estados DII en la concentración de monómeros. Por lo tanto, se logra un mayor contraste en las imágenes SMLM en comparación con las sondas tradicionales cuya señal monomérica se detecta.

Los BODIPYs exhiben una débil fluorescencia anti-Stokes que permite la excitación de monómeros y dimers con un solo láser a alta potencia de excitación. Por un lado, esta propiedad se puede explotar para la fluorescencia convencional simultánea y las imágenes SMLM para rastrear y resolver estructuras en movimiento. Por otro lado, hace que sea más difícil combinar estados BODIPY DII con otras sondas para imágenes multicolores, ya que la señal BODIPY ocupa dos canales de emisión. Sin embargo, la imagen multicolor es posible cuando las sondas se eligen cuidadosamente como se muestra en la Figura 2B con Sec63-GFP y BODIPY-C12 rojo. Del mismo modo, el SMLM secuencial de dos colores es posible con otras sondas foto-activables como mEos2 como se muestra en la Figura 2C. Otras combinaciones posibles para SMLM de dos colores incluyen el uso de conjugados BODIPY verdes y un tintes excitables de 640 nm como JF646 unido a la etiqueta de halo27.

En resumen, hemos presentado un protocolo optimizado para SMLM utilizando tintes BODIPY convencionales para investigar la distribución espacio-temporal de ácidos grasos, lípidos neutros y lisosomas a escala de longitud nanoscópica en levaduras vivas y células de mamíferos. Con modificaciones menores, este protocolo puede ser igualmente aplicable para SMLM con cientos de otros conjugados BODIPY en diferentes tipos de celdas.

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Disclosures

Los autores no declaran intereses en competencia.

Acknowledgments

La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R21GM127965.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

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References

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Bioquímica Número 160 Microscopía de Fluorescencia Microscopía de Superresolución Seguimiento de una sola molécula microscopía de localización de una sola molécula BODIPY dimers de estado del suelo levadura células de mamíferos
Conjugaciones BODIPY convencionales para microscopía de superresolución de células vivas y seguimiento de una sola molécula
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Adhikari, S., Banerjee, C., Moscatelli, J., Puchner, E. M. Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking. J. Vis. Exp. (160), e60950, doi:10.3791/60950 (2020).

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