Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Konvensjonelle BODIPY-konjugater for live-cell superoppløsningsmikroskopi og enkeltmolekylsporing

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/60950
Automatic Translation
1, *1, *1,2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College
* These authors contributed equally

Summary

Konvensjonelle BODIPY konjugater kan brukes til live-celle single-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) gjennom utnyttelse av deres forbigående forming, rød-forskjøvet bakken tilstand dimmers. Vi presenterer en optimalisert SMLM-protokoll for å spore og løse subcellulære nøytrale lipider og fettsyrer i levende pattedyr og gjærceller på nanoskopisk lengdeskala.

Abstract

Enkel molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) teknikker overvinne den optiske diffraksjon grensen for konvensjonell fluorescens mikroskopi og kan løse intracellulære strukturer og dynamikken i biomolekyler med ~ 20 nm presisjon. En forutsetning for SMLM er fluoroforeer som går fra en mørk til fluorescerende tilstand for å unngå spatio-temporal overlapping av deres punktspredningsfunksjoner i hver av de tusenvis av datainnsamlingsrammer. BODIPYs er veletablerte fargestoffer med mange konjugater som brukes i konvensjonell mikroskopi. Den forbigående dannelsen av rød-forskjøvet BODIPY ground-state dimers (DII) resulterer i lyse enkeltmolekylutslipp slik at enkeltmolekyl lokalisering mikroskopi (SMLM). Her presenterer vi en enkel, men allsidig protokoll for SMLM med konvensjonelle BODIPY konjugater i levende gjær og pattedyrceller. Denne prosedyren kan brukes til å skaffe superoppløseligeII bilder og til å spore enkelt BODIPY-D II-tilstander for å trekke ut spatio-temporal informasjon om BODIPY konjugater. Vi bruker denne prosedyren for å løse lipiddråper (LDer), fettsyrer og lysosomer i levende gjær og pattedyrceller på nanoskopisk lengdeskala. Videre demonstrerer vi multi-farge bildebehandling evne med BODIPY fargestoffer når de brukes sammen med andre fluorescerende sonder. Våre representative resultater viser differensial romlig distribusjon og mobilitet av BODIPY-fettsyrer og nøytrale lipider i gjær under matet og fastende forhold. Denne optimaliserte protokollen for SMLM kan brukes med hundrevis av kommersielt tilgjengelige BODIPY konjugater og er en nyttig ressurs for å studere biologiske prosesser på nanoskalaen langt utover anvendelsene av dette arbeidet.

Introduction

Single-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) teknikker som stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM) og foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) har dukket opp som metoder for å generere superoppløselige bilder med informasjon utover Abbes optiske diffraction grense1,,2 og for å spore dynamikken i enkelt biomolekyler3,4. Et av kravene til sonder som er kompatible med SMLM er muligheten til å kontrollere antall aktive fluorofofager når som helst for å unngå romlig overlapping av deres punktspredningsfunksjoner (PSF). I hver av de tusenvis av datainnsamlingsrammer bestemmes plasseringen av hver fluorescerende fluorofore med ~ 20 nm presisjon ved å tilpasse sin tilsvarende punktspredningsfunksjon. Tradisjonelt har på-off blinkende av fluorofore kontrollert gjennom stokastiske bilderstitching1,,2,,5 eller kjemisk indusert indre blinkende6. Andre tilnærminger inkluderer indusert aktivering av fluorogener ved forbigående binding til et fluorogenaktiverende protein7,,8 og den programmerbare bindingen-unbinding av merkede DNA-oligomerer i total intern refleksjonfluorescens (TIRF) eller lysarkeksitasjon9. Nylig rapporterte vi en ny og allsidig merkingstrategi for SMLM10 der tidligere rapporterte rød-forskjøvet dimeric (DII) tilstander av konvensjonelle bor di-pyromethane (BODIPY) konjugerer11,12,13 er forbigående forming og blir spesielt begeistret og oppdaget med rød-skift bølgelengder.

BodiPYs er mye brukt fargestoffer med hundrevis av varianter som spesifikt etikett sub-cellulære rom og biomolekyler14,,15,,16. På grunn av deres brukervennlighet og anvendelighet i levende celler, er BODIPY-varianter kommersielt tilgjengelige for konvensjonell fluorescensmikroskopi. Her beskriver vi en detaljert og optimalisert protokoll om hvordan hundrevis av kommersielt tilgjengelige BODIPY-konjugater kan brukes til live-celle SMLM. Ved å justere konsentrasjonen av BODIPY monomerer og ved å optimalisere eksitasjon laser krefter, bildebehandling og dataanalyse parametere, høy kvalitet super-oppløsning bilder og enkelt molekyl sporing data er oppnådd i levende celler. Når den brukes ved lav konsentrasjon (25-100 nM), kan BODIPY konjugater samtidig brukes til SMLM i den rødskiftede kanalen og for korrelativ konvensjonell fluorescensmikroskopi i den konvensjonelle utslippskanalen. De oppnådde enkeltmolekyldataene kan analyseres for å kvantifisere den romlige organiseringen av immobile strukturer og å trekke ut de diffusive tilstander av molekyler i levende celler17. Tilgjengeligheten av BODIPY-sonder i både grønne og røde former gjør det mulig å bilde av flere farger når de brukes i riktig kombinasjon med andre kompatible fluorofofager.

I denne rapporten gir vi en optimalisert protokoll for å anskaffe og analysere live-celle SMLM-data ved hjelp av BODIPY-C12,BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rød og lysotracker-grønn i flere farger. Vi løser fettsyrer og nøytrale lipider i levende gjær og pattedyrceller med ~ 30 nm oppløsning. Vi viser videre at gjærceller regulerer den romlige fordelingen av eksternt tilsatte fettsyrer avhengig av deres metabolske tilstand. Vi finner at tilsatt BODIPY-fettsyrer (FA) lokalisere til endoplasmic reticulum (ER) og lipid dråper (LDs) under matet forhold mens BODIPY-FAs danner ikke-LD klynger i plasmamembranen ved faste. Vi utvider videre anvendelsen av denne teknikken til bildelysosomer og LDer i levende pattedyrceller. Vår optimaliserte protokoll for SMLM ved hjelp av konvensjonelle BODIPY konjugater kan være en nyttig ressurs for å studere biologiske prosesser på nanoskalaen med de utallige tilgjengelige BODIPY konjugatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: For gjærkloning og endogene merking kan du se vår nyligepublikasjon 10.

1. Utarbeidelse av gjærcelleprøver for bildebehandling

  1. Forbered en flytende over natten kultur av en w303 gjær belastning. Bruk en steril trepinne, se en liten mengde gjærceller fra en agarplate som inneholder gjærekstrakt–pepton–dextrose inn i et kulturrør med ~ 2 ml syntetisk komplett dekstrose (SCD) medium. Inkuber røret over natten i en skjelvende inkubator ved 270 o/min og 30 °C.
  2. Utfør en 1:50 morgen fortynning av cellene i SCD. Fortsett å dyrke de fortynnede cellene i 4 timer ved 30 °C i en risting av inkubator på 270 o/min, slik at cellene kan vokse i eksponentiell fase og nå en optisk tetthet (OD) på ~0,6.
    MERK: Prosedyren kan variere her avhengig av hvilken metabolsk tilstand som studeres. BODIPY konjugater krever ikke celler i eksponentiell vekstfase. Vær imidlertid oppmerksom på autofluorescens fra døde celler i den stasjonære fasen, da det kan føre til et bakgrunnssignal for sterkt til å analysere enkelt BODIPY-DII emittere.
  3. For å studere fastende celler, vokse gjærkulturen i 2 dager uten utveksling av media.
  4. Ved ~30 min før plating cellene, inkubere et kamret coverglass med 80 μL av 0,8 mg / ml steril Concanavalin A (ConA) i deionisert H2O ved romtemperatur. Etter 30 min, vask dekselet tre ganger med deionisert H2O.
  5. Ved ~30 min før avbildning pipetter cellene på det kamret dekselglasset, med riktig volum av fersk SCD for å oppnå en optisk tetthet på ~ 0,12 (vanligvis 60 μL gjærkultur ved OD ~ 0,6 i 240 μL SCD). La cellene bosette seg og holde seg til ConA overflaten i 30 min.
  6. Tilsett ønsket BODIPY konjugat direkte til det kamret dekselglasset ved en endelig konsentrasjon på ~ 100 nM.
    MERK: Et kroppslig konsentrasjonsoptimaliseringseksperiment kan være nødvendig avhengig av bodipys lokal tetthet i et bestemt mobilrom.

2. Utarbeidelse av pattedyrceller for SMLM-avbildning

  1. Opprettholde pattedyr U2OS-celler i ikke-fluorescerende DMEM med 10% foster storfe serum, 4 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvat og 1% penicillin-streptomycin antibiotika i en T25 kolbe.
    MERK: Celler kan også opprettholdes i DMEM med 10% foster storfe serum og 1% penicillin-streptomycin antibiotika, men mediet må byttes før avbildning med en ikke-autofluorescerende løsning.
  2. Del cellene ved 70-80% samløpet 1:5 i en enkelt brønn av en 8-brønn plate. Kultur cellene i 8-brønnplaten i 12 til 24 timer før avbildning.
  3. Legg BODIPY-C12,LysoTracker Green eller andre BODIPY konjugat ved en endelig konsentrasjon på 100 nM (lagerløsninger i dimetylsulfoksid [DMSO]) 10 min før avbildning. Denne gangen kan variere avhengig av ønsket eksperiment.
    MERK: Bildebehandling kan utføres ved omgivelsestemperatur (23 °C) ved hjelp av levende cellebildeløsning. Imidlertid er avbildning ved 37 °C og 5 % CO2 med ikke-fluorescerende DMEM blandet med 10 % fostervinserum, 4 mM glutamin, 1 mM natriumpyuvat og 1 % penicillin-streptomycinantibiotika foretrukket å holde celler nærmere fysiologiske forhold og for å gjøre biologiske konklusjoner.

3. Utstyr forberedelse

  1. Monter de aktuelle filtersettene i utslippsbanen basert på utslippsfargen til BODIPY som brukes.
    MERK: Et quad-band dichroic speil (zt/405/488/561/640rdc) skiller først eksitasjonen fra utslippslyset. Det grønne utslippet (525 nm) og rødt utslipp (595 nm) deles deretter med en dichroic langpass strålesplitter (T562lpxr) etterfulgt av båndpassfiltre ET525/50 i den grønne kanalen og ET 595/50 i den røde kanalen. De to kanalene projiseres deretter til forskjellige områder av samme kamerabrikke. På samme måte er det røde utslippet (595 nm) og det fjerne røde utslippet først delt av en dichroic langpass strålesplitter (FF652-Di01) etterfulgt av båndpassfiltre ET 610/75 i rødt og FF731/137 i den rødrøde kanalen.
  2. Slå på mikroskopet, mikroskopstadiet, laserne (488 nm, 561 nm) og kameraet. Her brukes et invertert mikroskop med et perfekt fokussystem og et EMCCD-kamera avkjølt til -68 °C.
  3. Legg til en dråpe nedsenkingsolje på mikroskopmålet.
  4. Åpne Hal4000-programvaren (se materialtabellen) som styrer LED-lyset for lysfeltavbildning, laserkrefter, laserskodder og kamerainnstillinger for bildebehandling. Sett EMCCD-forsterkningen til 30 og kameratemperaturen til -68 °C. Forbered kameraet og tilsvarende programvare for å ta opp filmer på 20 Hz.
    MERK: Denne teknikken gjelder for alle wide-field mikroskop som er i stand til fotoaktivert lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM) bildebehandling. Tilsvarende programvare kan variere.
  5. Slå på mikroskopet scenen varmeapparatet og sett den til en temperatur på 37 ° C og til et CO2 nivå på 5%. Juster objektiv korreksjonskrage tilsvarende.
  6. Monter prøven på mikroskopet og fokuser til fokuseringssystemet engasjerer seg. Flytt fasen ved hjelp av fasekontrolleren til friske celler vises i synsfeltet.
    MERK: For avbildning med gjærceller ved romtemperatur er det ikke nødvendig å slå på varmeapparatet eller CO2-kontrollen.
  7. Slå på de riktige laserne for eksitasjon av monomerer samt dimers. For BODIPY grønn eller LysoTracker grønn, bruker vi en 561 nm laser for å opphisse DII-tilstander for SMLM og en 488 nm laser for å opphisse monomerer for konvensjonell fluorescens.
    MERK: For bodipy rød, bruk en 640II nm laser for å opphisse D II-tilstander for SMLM og en 561 nm laser for å opphisse monomerene for konvensjonell fluorescens. For bodipy rød, justere 561 nm og 640 nm laser krefter for å visualisere bulk fluorescens i den røde kanalen og enkelt molekyl utbrudd i den fjerne røde kanalen. Den typiske effekten for 561 nm er ~0,06 W/cm2 og ~5 kW/cm2 for 640 nm. For BODIPY grønn, forvent å også se konvensjonell fluorescens i den grønne utslippskanalen under 561 nm eksitasjon. For BODIPY rød, forvent å se konvensjonell fluorescens i den røde kanalen under 640 nm eksitasjon. Dette signalet oppstår fra anti-Stokes utslipp, som blir nyttig for monomer / dimer co-lokalisering bilder med kontinuerlig laser eksitasjon.

4. Innhenting av data

  1. Last laser lukkersekvenser for eksitasjon av monomerer samt dimers.
    MERK: Vi bruker vanligvis ni eksitasjonsrammer med ett enkeltmolekyl ved 561 nm etterfulgt av en konvensjonell eksitasjonsramme på 488 nm. Dette gir et lysere konvensjonelt fluorescenssignal og unngår å lekke av en annen 488 nm spennende fluorofore som grønt fluorescerende protein (GFP) inn i den røde enkeltmolekyldeteksjonskanalen i flerfarget bildebehandlingsapplikasjoner. Alternativt, slå på 561 nm laser kontinuerlig og stole på anti-Stokes utslipp for konvensjonelle bilder i kortere bølgelengde kanal.
  2. Tune laserkrefter slik at enkelt molekyl fluorescens utbrudd oppdages i rød-forskjøvet utslipp kanal under 561 nm eksitasjon, og konvensjonell fluorescens vises i den grønne utslippskanalen med 488 nm eksitasjon. Typiske laserkrefter av 561 nm laser vil være rundt 0,8-1 kW/cm2 for SMLM, og 0,035-0,07 W/cm2 for 488 nm laser i konvensjonell fluorescens bildemodus.
  3. Velg en målmappe for filmer og ta opp 5 000-20 000 anskaffelsesrammer for å samle inn nok lokaliseringer for å rekonstruere superoppløselige bilder.
  4. Flytt til forskjellige synsfelt, og gjenta trinnene ovenfor for å samle inn data fra flere celler.

5. Dataanalyse og sporing av ett molekyl

  1. Last inn filmen i en SMLM-analyseprogramvare.
    MERK: All programvare18 kan brukes. Vi bruker INSIGHT (se tabell over materialer)og kryssvalidere resultatene ved hjelp av ThunderSTORM19 plugin for imageJ (Fiji).
  2. Visuelt skjermen filmen og justere kontrastinnstillinger slik at enkeltmolekylfluorescens blinker er synlig. Hvis det er nødvendig, begrens området eller rammeområdet for SMLM-dataanalyse hvis deler av prøven kontinuerlig fluorescerer.
  3. Angi parametere for identifisering av enkeltmolekyler for montering med 2D-gaussiske PSFer (ROI: 7 x 7 piksler med pikselstørrelse 160 nm, bredde 260-650 nm, høyde > 50 fotoner). Visuelt skjerm gjennom noen eksempelrammer for å sjekke identifikasjonsparametrene og for å oppdage de distinkte enkeltmolekylfluorescensutbruddene på en pålitelig måte (se figur 1C).
    MERK: Visse identifikasjonsparametere som høyde og bredde kan justeres litt for å optimalisere anerkjennelsen av visuelt oppfattede enkeltmolekylfluorescenssignaler.
  4. Utfør SMLM-bildeanalyse med de optimaliserte identifikasjonsparametrene og gjengi deretter hvert enkelt molekyl som en 2D-gaussisk hvis bredde vektes av den inverse firkantede roten til det oppdagede antallet fotoner.
  5. Vurder kvaliteten på dataene. Bruk begrensede rammeområder for å observere enkeltmolekylfordelinger ved mer spesifikke forekomster i tide. Dette kan utgjøre organellebevegelse under datainnhenting.
  6. For ytterligere å analysere den romlige fordelingen og dynamikken i molekylfordelingene, eksporterer du den oppnådde molekyllisten som inneholder koordinatene, utseendets rammer, fotoner, bredder og høyder for lokaliseringene. Importer molekyllisten i tilpassede skriftlige analyseprosedyrer.
  7. For å få romlig informasjon om den enkelte molekylfordelingen, beregn den radiale fordelingsfunksjonen ρ(r), som representerer lokaliseringens tetthet som en funksjon av den radiale avstanden20. For å oppnå ρ(r), beregne unike parvise avstander av alle lokaliseringer, konstruere histogrammet med hyller sentrert på ri med høyde H (ri)og med en bredde dr og dividere med 2πri* dr; (ρ(ri) = H(ri)/π(ri+dr)2-ri2). Den radiale distribusjonsfunksjonen kan deretter brukes til å kvantifisere og sammenligne graden av klynger samt den karakteristiske størrelsen på klynger.
  8. Hvis du vil ha dynamisk informasjon om spredningen av molekyler, kobler du lokaliseringer som for eksempel vises innenfor 3 piksler (0,48 μm) i påfølgende datainnsamlingsrammer for å opprette enkeltmolekylspor.
    MERK: Koblingsavstanden vil avhenge av diffusjon av molekyler og tettheten av lokaliseringer. Den maksimale koblingsavstanden kan estimeres ved å analysere tettheten av lokaliseringer i hver ramme21,22. Gjennomsnittlig tetthet ble fastslått å være 0,043 lokaliseringer per μm2; Dermed var en radius på 0,48 μm innenfor en lav nok tetthet for å sikre at forskjellige molekyler ikke var knyttet sammen.
  9. Gjennomsnittlig forskyvninger for ulike forsinkelser Δt fra flere spor som varer minst tre lag ganger for å skape en gjennomsnittlig kvadrert forskyvning (MSD) vs. Δt plot. Monter MSD vs. ΔT-kurven med ligningen MSD = 4DΔt + σ2 for å beregne den gjennomsnittlige diffusjonskoeffisienten D3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her presenterer vi en optimalisert prøveforberedelse, datainnsamling og analyseprosedyre for SMLM ved hjelp av BODIPY konjugater basert på protokollen ovenfor (Figur 1A). For å demonstrere et eksempel på arbeidsflyten for å anskaffe og analysere SMLM-data, bruker vi BODIPY (493/503) i gjær for å løse LDer under den optiske diffraksjonsgrensen (Figur 1B-F). Eksempler på de forskjellige flerfarget bildemodusene til BODIPY sammen med andre sonder som GFP, mEos2 er vist i figur 2. Vi manipulerer metabolsk tilstand i gjær ved å dyrke dem i samme medium for ~ 48 h og viser at BODIPY-C12 danner immobile ikke-LD klynger i celle periferi ved faste i motsetning til deres innlemmelse i LDer under matet forhold (Figur 3). For ytterligere å utvide SMLM-evnen til BODIPY konjugater til pattedyrceller, ser vi bodipy-C12 og LysoTracker-grønn i levende U2OS-celler (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Optimalisering av SMLM-datainnsamling og analyse ved hjelp av BODIPY-fargestoffer. (A) Arbeidsflyt for optimalisering av enkeltmolekylfluorescenssignaler og etterbehandling av SMLM-dataene fra BODIPY konjugater. (B) LED-bilde (venstre), konvensjonell fluorescensbilde (midten, eksitasjon: 488 nm, utslipp: 525 nm) og anti-Stokes bilde (høyre, eksitasjon: 561 nm, utslipp: 525 nm) av gjærceller farget med LD-markøren BODIPY (493/503). (C) Enkelt SMLM rammer som viser singe BODIPY DII emittere (eksitasjon: 561 nm, utslipp: 595 nm) ved for lav tetthet (venstre), optimal tetthet (midten) og for høy tetthet (høyre). (D) Optimalisering av SMLM-analyseparametere. Med en for høy fotonnummerterskel, går programvaren glipp av gyldige enkeltmolekylsignaler (venstre), oppdager alle molekyler med en optimal fotonterskel (midten) og oppdager falske lokaliseringer med for lave fotonterskler (høyre). (E) SMLM bilde av BODIPY (493/503) løser størrelsen på LDer (venstre, zoom) med en gjennomsnittlig diameter på 125 nm. (F) Enkelt molekyl sporing avslører begrenset diffusjon av BODIPY (493/503) inne LDer (venstre). Spor brukes til å beregne MSD vs. tidskurven, som viser sub-diffusiv virkemåte i LDer (høyre). Skalalinje = 1 μm, zoom = 100 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: SMLM-avbildning med flere farger ved hjelp av BODIPY konjugater i levende celler. (A) Konvensjonelt bilde av BODIPY-C12 under 488 nm eksitasjon (venstre). Tilsvarende SMLM-bilde ved hjelp av DII-tilstander av BODIPY-C12 under 561 nm eksitasjon (midten) og zoom (høyre) avslører BODIPY-C12 i nye LDer. (B) Konvensjonell fluorescensbilde av ER merket med Sec63-GFP under 488 nm excitation (venstre). Samtidig registrert konvensjonell fluorescens bilde av BODIPY-C12 rød med 561 nm eksitasjon (midten) og SMLM bilde ved hjelp av 640 nm eksitasjon (høyre). (C) Sekvensiell tofargers SMLM-avbildning av sec63-mEos2 og BODIPY-C12 grønn D II-tilstander.II Først er mEos2 avbildet med høy 405 nm fotoaktivering og 561 nm eksitasjon (venstre) etterfulgt av lang datainnhenting uten 405 nm aktivering (midten). Skala bar = 1 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Differensial fettsyrefordeling ved faste i gjærceller. (A)Skjematisk beskriver ulike metabolske tilstander (matet og fastet tilstand) basert på varigheten av veksten i SCD-mediet. B) Konvensjonelle fluorescensbilder (øverst) viser at BODIPY-C12 rød samlokaliserer med BODIPY (493/503) under matet forhold som indikerer inkorporering i LDer. SMLM-bildet (nedre, venstre) viser tett BODIPY-C12 puncta i LDer og enkeltmolekylspor (nedre, høyre) viser diffusjon langs cellulære membraner. (C)Under fastet tilstand danner BODIPY-C12 puncta i celleperiene som ikke samtidig lokaliserer med LDer (øvre: venstre, midt, nedre venstre). SMLM-bildet løser puncta og begrensede spor av BODIPY-C12 rød (nedre, høyre). (D) Den radiale distribusjonsfunksjonen (venstre) viser høyere klynger av BODIPY-FAs ved faste. Den gjennomsnittlige forskyvning vs. tid plot av enkelt molekyl sporing (høyre) bekrefter immobilisering av BODIPY-C12 ved faste. Skala bar = 1 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Bilde av BODIPY fargestoffer i levende pattedyr U2OS celler. (A) Konvensjonell fluorescensbilde (venstre) av BODIPY-C12 ved 488 nm eksitasjon. Det tilsvarende SMLM-bildet ved hjelp av DII-tilstander (høyre) ved 561 nm-eksitasjon viser den nanoskopiske fordelingen av DII-tilstandene i U2OS-cellen. Innleggene viser forstørrelser av lipiddråper (skalalinje = 500 nm). (B) Konvensjonelt bilde av lysosomer i U2OS-celler ved hjelp av LysoTracker grønn ved 488 nm eksitasjon (venstre). Det tilsvarende SMLM-bildet av immobile lysosomer (høyre, skalalinje = 5 μm) ved 561 nm eksitasjon. Innfelt: SMLM-bilde av en optisk diffraksjon begrenset lysosom (skalalinje 100 nm). BODIPY-C12 bildene ble tatt opp i live celle bildebehandling løsning ved 23 °C. Bildene av lysosomer som bruker LysoTracker green ble registrert i ikke-fluorescerende DMEM med 10% foster storfe serum, 4 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvat og 1% penicillin-streptomycin antibiotika ved 37 °C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen demonstrerte vi hvordan konvensjonelle BODIPY konjugater kan brukes til å skaffe SMLM-bilder med en størrelsesorden forbedring i romlig oppløsning. Denne metoden er basert på å utnytte tidligere rapporterte, rød-forskjøvet DII tilstander av konvensjonelle BODIPY fargestoffer, som forbigående dannes gjennom bimolekylære møter. Disse tilstandene kan være spesielt begeistret og oppdaget med rød-forskjøvet bølgelengder og er sparsomme og kortvarig nok for SMLM. Ved å justere konsentrasjonen av BODIPY monomerer sammen med laserparametere, kan en optimal tetthet av lokaliseringer og signal-til-støy oppnås. Vi løste den intracellulære fordelingen og mobiliteten til fettsyreanaloger og nøytrale lipider med ~ 30 nm-oppløsning (teoretisk Thompsons formel) i levende gjærceller under matet og fastende forhold. Vi fant også at ~ 40% av BODIPY DII stater holde på for to eller flere datainnsamling rammer på 20 Hz, slik at enkeltmolekyl sporing for å kvantifisere deres mobilitet under forskjellige forhold. Våre resultater viser differensial lokalisering og mobilitet av BODIPY-FAs ved faste og foreslå en beskyttelsesmekanisme mot lipotoxicity. Vår evne til å spore enkelt BODIPY molekyler og å løse størrelsen på LDs og BODIPY-FA puncta under den optiske diffraksjon grensen under ulike metabolske tilstander er bare mulig med utviklet SMLM evne konvensjonelle BODIPY konjugates. De eksakte molekylære mekanismene og banene som er involvert i romlig regulering av fettsyrefordelingen og opptaket er gjenstand for våre fremtidige studier. Videre utvidet vi SMLM-evnen til konvensjonelle BODIPY konjugater til levende pattedyrceller ved å løse BODIPY-FAs og lysosomer i U2OS-celler.

Ved hjelp av DII tilstander av konvensjonelle BODIPY konjugater for SMLM har fordeler over andre sonder siden hundrevis av forskjellige BODIPY varianter er kommersielt tilgjengelig som etikett spesifikke molekyler eller cellulære rom i levende celler. Prøvepreparatet er like enkelt som å legge til fargestoffet ved lave (~ 100 nM) konsentrasjoner før avbildning uten vask. I motsetning til andre PALM / STORM-sonder som blekemiddel over tid, er BODIPYII monomerer upåvirket av eksitasjon av deres D II-tilstander og gir derfor en nesten aldri ødeleggende kilde for enkeltmolekylsignaler i langsiktig avbildning. SidenII D II-tilstander oppstår på grunn av spontane bimolekylære møter, krever SMLM ved hjelp av DII-tilstander ingen eksternt tilsatt buffer for å indusere blinkende23. På samme måte er det ikke behov for høyenergifotoaktivering som kreves for nylig syntetisert foto-activatable BODIPY-versjoner24 eller SMLM av noen konvensjonelle BODIPY fargestoffer21, noe som kan være skadelig for cellehelse under langsiktig bildebehandling25,26. Videre skaper SMLMII med D II-tilstander en iboende bakgrunnsundertrykkelse av ikke-spesifikt interagerende sonder på grunn av den kvadratiske avhengigheten av DII-tilstander på monomerkonsentrasjonen. Derfor oppnås en høyere kontrast i SMLM-bilder sammenlignet med tradisjonelle sonder hvis monomeriske signal oppdages.

BODIPYs viser en svak anti-Stokes fluorescens som muliggjør eksitasjon av monomerer og dimers med en enkelt laser ved høy eksitasjonskraft. På den ene siden kan denne egenskapen utnyttes for samtidig konvensjonell fluorescens og SMLM-bildebehandling for å spore og løse bevegelige strukturer. På den annen side gjør det det vanskeligere å kombinere BODIPY D II-tilstander med andre sonder for flerfarget bildebehandling, da BODIPY-signalet opptar to utslippskanaler. Imidlertid er multi-fargeavbildning mulig når sonder er nøye valgt som vist i figur 2B med Sec63-GFP og BODIPY-C12 rød. På samme måte er sekvensiell tofargers SMLM mulig med andre foto-aktivatable prober som mEos2 som vist i figur 2C. Andre mulige kombinasjoner for to-farge SMLM inkluderer bruk av grønne BODIPY konjugates og en 640 nm spennende fargestoffer som JF646 bundet til halo tag27.

Oppsummert har vi presentert en optimalisert protokoll for SMLM ved hjelp av konvensjonelle BODIPY fargestoffer for å undersøke den spatio-temporale fordelingen av fettsyrer, nøytrale lipider og lysosomer på nanoskopisk lengdeskala i levende gjær og pattedyrceller. Med mindre modifikasjoner kan denne protokollen være like aktuelt for SMLM med hundrevis av andre BODIPY konjugater på tvers av forskjellige celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forskningen rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under tildeling nummer R21GM127965.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  3. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  4. Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077 (2015).
  5. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
  6. Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
  7. Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
  8. Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
  9. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  10. Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  11. Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
  12. Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
  13. Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
  14. Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
  15. Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
  16. Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
  17. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
  18. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
  19. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
  20. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  21. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  22. Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
  23. Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
  24. Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
  25. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
  26. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  27. Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).

Tags

Biokjemi utgave 160 fluorescensmikroskopi mikroskopi med superoppløsning sporing av enkeltmolekyler lokaliseringsmikroskopi med ett molekyl BODIPY jordstatsdumper gjær pattedyrceller
Konvensjonelle BODIPY-konjugater for live-cell superoppløsningsmikroskopi og enkeltmolekylsporing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adhikari, S., Banerjee, C.,… More

Adhikari, S., Banerjee, C., Moscatelli, J., Puchner, E. M. Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking. J. Vis. Exp. (160), e60950, doi:10.3791/60950 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter