Summary
传统的BODIPY结合物可用于活细胞单分子定位显微镜（SMLM），其瞬时成型、红移地面状态变暗器。我们提出了优化的SMLM协议，以跟踪和解决活哺乳动物和酵母细胞中的亚细胞中性脂质和脂肪酸在纳米长度尺度上。
Abstract
单分子定位显微镜（SMLM）技术克服了传统荧光显微镜的光衍射极限，能够以±20nm的精度解决细胞内结构和生物分子的动态。SMLM 的先决条件是荧光器，它从黑暗状态过渡到荧光状态，以避免其点扩散函数在数千个数据采集帧中每个帧中的分时重叠。BODIPYs 是成熟的染料，在传统显微镜中使用大量结合物。红移BODIPY地面状态变暗器（DII）的瞬态形成导致明亮的单分子发射，使单分子局部显微镜（SMLM）成为可能。在这里，我们提出了一个简单但通用的SMLM协议与传统的BODIPY结合在活酵母和哺乳动物细胞。此过程可用于获取超分辨率图像并跟踪单个 BODIPY-DII状态，以提取 BODIPY 偶联的时空信息。我们应用这个程序来解决脂质滴（LDs）、脂肪酸和在纳米长度尺度上活的酵母和哺乳动物细胞中的脂质脂滴（LD）、脂肪酸和淋索体。此外，我们演示了 BODIPY 染料与其他荧光探头结合使用时的多色成像功能。我们的代表性结果表明，在喂养和禁食条件下，酵母中BODIPY脂肪酸和中性脂质的空间分布和流动性存在差异。这种针对 SMLM 的优化协议可用于数百种商用 BODIPY 偶联，是研究纳米尺度生物过程的有用资源，远远超出本工作的应用范围。
Introduction
单分子定位显微镜（SMLM）技术，如随机光学重建显微镜（STORM）和光活化定位显微镜（PALM），已成为生成超分辨率图像的方法，其信息超过Abbe的光衍射极限11，2，2并跟踪单生物分子33，44的动态。与 SMLM 兼容的探头要求之一是能够随时控制活动荧光波的数量，以避免其点差函数 （PSF） 的空间重叠。在数千个数据采集帧中，通过安装其相应的点扩散功能，确定每个荧光荧光波的定位，精度为±20 nm。传统上，氟脑的开离闪烁是通过随机光切换11，2，52,5或化学诱导的内在闪烁6加以控制。其他方法包括荧光原在瞬态结合时诱导激活氟原蛋白77、8，8以及标记的DNA寡聚物在总内部反射荧光（TIRF）或光片激发9中的可编程结合。最近，我们报道了SMLM10的新颖和通用的标签策略，其中先前报道的红移二恶热（DII）状态的传统硼二丙甲甲（BODIPY）结合11，12，13是瞬时形成，并成为特别兴奋和检测与红移波长。11,12,13
BODIPYs是广泛使用的染料与数百种变种，专门标记亚细胞隔间和生物分子14，15，16。14,15,16由于其易用性和适用于活细胞，BODIPY 变体在商业上可用于传统荧光显微镜。在这里，我们描述了一个详细和优化的协议，如何将数以百计的商用 BODIPY 联结物用于活细胞 SMLM。通过调整BODIPY单体浓度，优化激发激光功率、成像和数据分析参数，在活细胞中获得高质量的超分辨率图像和单分子跟踪数据。当在低浓度（25-100 nM）下使用时，BODIPY偶联剂可同时用于红移通道中的SMLM和传统发射通道中的相关传统荧光显微镜。可以分析获得的单分子数据，以量化不动结构的空间组织，提取活细胞17中分子的扩散状态。具有绿色和红色两种形式的 BODIPY 探头，可在与其他兼容荧光波的正确组合中使用多色成像。
在本报告中，我们提供了一个优化的协议，用于使用BODIPY-C 12、BODIPY（493/503）、BODIPY-C12红色和多种颜色的色解解解器绿色来获取和分析活细胞SMLM数据。12我们以±30nm的分辨率解决活酵母和哺乳动物细胞中的脂肪酸和中性脂质。我们进一步证明，酵母细胞根据它们的代谢状态调节外部添加脂肪酸的空间分布。我们发现，在喂食条件下，在内质视网膜（ER）和脂液（LD）中加入的BODIPY-脂肪酸（FA）局部化，而BODIPY-FA在禁食后在血浆膜中形成非LD簇。进一步扩展了该技术在活体哺乳动物细胞中图像的脂体和LD的应用。我们使用传统的 BODIPY 联偶联体优化的 SMLM 协议是利用无数可用的 BODIPY 偶联物在纳米尺度上研究生物过程的有用资源。
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Protocol
注：关于酵母克隆和内源性标记，请参阅我们最近的出版物10。
1. 制备用于成像的酵母细胞样品
- 准备w303酵母菌株的液体过夜培养。使用无菌木棍，从含有酵母提取物的a加盘（peptone_dextrose）中发现少量酵母细胞，放入含有±2 mL合成完整脱脂（SCD）介质的培养管中。在 270 rpm 和 30°C 的摇摇培养箱中孵育管过夜。
- 在 SCD 中执行 1：50 的细胞稀释。在270 rpm的摇动培养箱中，在30°C下继续培养稀释细胞4小时，使细胞在指数相中生长，达到±0.6的光学密度（OD）。
注：根据正在研究的代谢状态，该过程可能在这里有所不同。BODIPY偶联不需要细胞在指数生长阶段。然而，要认识到在静止阶段死细胞的自荧光，因为它可能导致背景信号太强，无法分析单个BODIPY-DII发射器。 - 研究禁食细胞，在不交换介质的情况下，将酵母培养菌培养2天。
- 在电镀细胞前约30分钟，在室温下以去离子H2O孵育80μL0.8mg/mL无菌康卡瓦林A（ConA）的室盖玻璃。30分钟后，用去离子H2O清洗盖玻璃三次。
- 在成像前约30分钟，将室盖玻璃上的细胞移液，以正确的新鲜SCD体积，达到±0.12的光学密度（通常在OD+0.6 μL SCD下培养60μL酵母培养）。让细胞沉降并粘附在 ConA 表面 30 分钟。
- 将所需的 BODIPY 偶联直接添加到室盖玻璃中，最终浓度为 ±100 nM。
注：根据特定细胞舱中的 BODIPY 局部密度，可能需要进行 BODIPY 浓度优化实验。
2. 为SMLM成像制备哺乳动物细胞
- 在非荧光DMEM中维持哺乳动物U2OS细胞，在T25烧瓶中使用10%的胎儿牛血清、4 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮钠和1%青霉素-链霉素抗生素。
注：细胞也可以维持在DMEM与10%的胎儿牛血清和1%青霉素-链霉素抗生素，但是，在成像前需要交换与非自动荧光溶液的介质。 - 在8孔板的单孔中，将细胞以70-80%的汇合1：5分。成像前，将8孔板中的细胞培养12至24小时。
- 在成像前10分钟12，在100 nM的最终浓度下加入BODIPY-C 12，LysoTracker绿色或任何其他BODIPY偶联（二甲基亚硫酸盐中的库存溶液[DMSO]）。这一次可能因所需的实验而异。
注：成像可在环境温度 （23 °C） 下使用活细胞成像解决方案进行。然而，在37°C和5%CO2成像2与非荧光DMEM混合与10%胎儿牛血清，4 mM谷氨酰胺，1 mM钠丙酮酸钠和1%青霉素链霉素抗生素是首选使细胞更接近生理条件，并作出生物结论。
3. 设备准备
- 根据正在使用的 BODIPY 的排放颜色，在排放路径中安装适当的滤光片集。
注：四波段二色镜 （zt/405/488/561/640rdc） 首先将激发与发射灯分离。然后，绿色发射（525 nm）和红色发射 （595 nm） 由二色长通光束分路器 （T562lpxr） 拆分，然后在绿色通道中由带通滤波器 ET525/50 和 ET 595/50 分割。然后，两个通道投影到同一摄像机芯片的不同区域。同样，红色发射（595 nm）和远红色发射首先由二色长通光束分路器 （FF652-Di01） 分裂，然后由红色带通滤波器 ET 610/75 在远红色通道中。 - 打开显微镜、显微镜舞台、激光（488 nm、561 nm）和相机。这里使用了带有完美对焦系统的倒置显微镜，并使用了冷却至-68 °C的 EMCCD 摄像机。
- 在显微镜目标上加入一滴浸入油。
- 打开 Hal4000 软件（参见材料表），用于控制 LED 光，用于明亮场成像、激光功率、激光百叶窗和成像相机设置。将 EMCCD 增益设置为 30，将摄像机温度设置为 -68 °C。准备相机和相应的软件以 20 Hz 的速度录制电影。
注：该技术适用于任何能够光活化局部显微镜 （PALM） 和随机光学重建显微镜 （STORM） 成像的宽场显微镜。相应的软件可能有所不同。 - 打开显微镜舞台加热器，将其设置为 37 °C 和CO 2水平 5%。相应地调整目标校正衣领。
- 将样品安装在显微镜舞台上并聚焦，直到对焦系统接合。使用舞台控制器移动舞台，直到正常单元格出现在视场中。
注：在室温下使用酵母细胞成像，无需打开加热器或 CO2控制装置。 - 打开适当的激光器，以激发单体和昏暗器。对于 BODIPY 绿色或 LysoTracker 绿色，我们使用 561 nm 激光来激发 SMLM 的 DII状态，使用 488 nm 激光来激发单体进行常规荧光。
注：对于 BODIPY 红色，使用 640 nm 激光来激发 SMLM 的 DII状态，使用 561 nm 激光来激发单体进行常规荧光。对于 BODIPY 红色，调整 561 nm 和 640 nm 激光功率，以可视化红色通道中的大容量荧光，并在远红色通道中出现单个分子爆裂。561 nm 的典型功率为 ±0.06 W/cm2和 ±5 kW/cm2，用于 640 nm。对于 BODIPY 绿色，预计在 561 nm 激发下的绿色发射通道中也会看到传统的荧光。对于 BODIPY 红色，期望在 640 nm 激发下的红色通道中看到常规荧光。该信号产生于反斯托克斯发射，对于具有连续激光激发的单体/二进制共定位图像非常有用。
4. 数据采集
- 加载激光快门序列，用于单体和昏暗器的激发。
注：我们通常使用9个单分子激励框架在561nm，其次是一个传统的激励框架在488nm。这提供了更明亮的传统荧光信号，并避免在多色成像应用中将绿色荧光蛋白 （GFP） 等其他 488 nm 兴奋荧光磷泄漏到红色单分子检测通道中。或者，连续打开 561 nm 激光，并依靠反斯托克斯发射，在较短的波长通道中拍摄常规图像。 - 调整激光功率，使在561 nm激励下的红色移动发射通道中检测到单分子荧光爆发，而传统的荧光出现在具有488nm激发的绿色发射通道中。561 nm 激光的典型激光功率约为 0.8-1 kW/cm2，用于 SMLM，在传统荧光成像模式下为 488 nm 激光为 0.035-0.07 W/cm2。
- 为影片选择目标文件夹并录制 5，000-20，000 个采集帧，以收集足够的本地化以重建超分辨率图像。
- 移动到不同的视图区域，并重复上述步骤，从更多单元格收集数据。
5. 数据分析和单分子跟踪
- 将影片加载到 SMLM 分析软件中。
注：可以使用任何软件18。我们使用 INSIGHT（参见材料表），并使用 ImageJ（斐济）的 ThunderSTORM19插件对结果进行交叉验证。 - 目视放映影片并调整对比度设置，使单分子荧光闪烁可见。如果需要，如果样本的某些部分持续荧光，则限制 SMLM 数据分析的区域或帧范围。
- 设置单分子识别参数，用于与 2D 高斯 PSF（ROI： 7 x 7 像素，像素大小 160 nm，宽度 260-650 nm，高度 > 50 光子）。通过一些示例帧进行可视化筛选，以检查识别参数并可靠地检测独特的单分子荧光突发（参见图 1C）。
注：某些识别参数（如高度和宽度）可以稍微调整，以优化视觉感知的单分子荧光信号的识别。 - 使用优化的识别参数执行 SMLM 图像分析，然后将每个单个分子渲染为 2D 高斯，其宽度由检测到的光子数的反向平方根加权。
- 评估数据的质量。使用受限帧范围及时观察更特定实例的单个分子分布。这可以解释数据采集过程中的细胞器运动。
- 为了进一步分析分子分布的空间分布和动力学，导出获得的分子列表，其中包含定位的坐标、外观帧、光子、宽度和高度。在自定义书面分析程序中导入分子列表。
- 为了获取单个分子分布的空间信息，计算径向分布函数_（r），该函数表示自定位的密度，作为径向距离20的函数。要获取\（r），计算所有本地化的唯一对对距离，构造以 ri为中心的柱图（高度 H（ri），宽度 dr，除以 2μri_dr;（（ri） = H（ri）/*（ri+dr）2-ri2）。然后，径向分布函数可用于量化和比较聚类的程度以及聚类的特征大小。
- 要获取有关分子扩散的动态信息，请链接在连续数据采集帧中出现 3 像素（0.48 μm） 以内的定位，以创建单个分子痕迹。
注：链接距离将取决于分子的扩散和局部的密度。通过分析每个帧21、,22中的本地化密度，可以估计最大链接距离。平均密度确定为每μm 20.043次定位;2因此，0.48 μm半径的密度足够低，以确保不同的分子不连接在一起。 - 从多个跟踪中平均不同延迟时间的位移 \t，持续时间至少为三个滞后时间，以创建平均平方位移 （MSD） 与 μt 图。将 MSD 与 μt 曲线与方程 MSD = 4D_t = =2拟合，以计算平均扩散系数 D3。
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Representative Results
在这里，我们提出了基于上述协议（图1A）的基于BODIPY偶联的SMLM优化的样品制备、数据采集和分析程序。为了演示获取和分析 SMLM 数据的工作流示例，我们在酵母中使用 BODIPY （493/503） 来解决光学衍射限制以下的 LD（图 1B-F）。图2显示了BODIPY与其他探测器（如GFP、mEos2）不同的多色成像模式的示例。我们操纵酵母的代谢状态，将它们在同一介质中生长，持续约48小时，并表明BODIPY-C12在禁食时形成细胞外围的非LD聚类，而它们在喂食条件下与LD的合并形成鲜明对比（图3）。为了进一步将BODIPY结合的SMLM功能扩展到哺乳动物细胞，我们拍摄了活U2OS细胞中的BODIPY-C12和LysoTracker-Green（图4）。
图1：使用BODIPY染料优化SMLM数据采集和分析. （A） 优化单个分子荧光信号和后处理来自BODIPY联理会的SMLM数据的工作流程.（B） LED 图像（左），传统荧光图像（中，激发：488 nm，发射：525 nm）和抗斯托克斯图像（右，激发：561 nm，发射：525 nm）的酵母细胞沾染 LD 标记 BODIPY （493/503）。（C） 单 SMLM 帧显示单张 BODIPY DII发射器（激发：561 nm，发射：595 nm），密度过低（左），最佳密度（中）和密度过高（右）。（D） SMLM 分析参数的优化。由于光子数阈值过高，软件会丢失有效的单分子信号（左图），以最佳光子阈值（中）检测所有分子，并检测光子阈值过低的假定位（右）。（E） BODIPY （493/503） 的 SMLM 图像可解析平均直径为 125 nm 的 LD（左，缩放）的大小。（F） 单分子跟踪显示，在 LD（左）内，BODIPY （493/503） 的有限扩散。跟踪用于计算 MSD 与时间曲线，该曲线在 LD 中表现出分扩散行为（右图）。刻度杆 = 1 μm，变焦 = 100 nm。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：在活细胞中使用BODIPY结合的多色SMLM成像。 （A） 488 nm激发下BODIPY-C12的传统图像（左图）。在 561 nm 激发（中间）下使用 BODIPY-C12 的 DII状态的相应 SMLM 图像，在新兴 L 中显示 BODIPY-C12。B同时使用 640 nm 激励（右）记录 BODIPY-C12 红色的传统荧光图像和 561 nm 激励（中）和 SMLM 图像。（C） 顺序双色 SMLM 成像 Sec63-mEos2 和 BODIPY-C12 绿色 DII状态。首先，mEos2 的成像具有高 405 nm 照片激活和 561 nm 激发（左），然后是无需 405 nm 激活（中）即可获得长数据。比例尺 = 1 μm。请点击这里查看此图形的较大版本。
图3：酵母细胞禁食时的差分脂肪酸分布。（A） 基于 SCD 介质的生长持续时间描述不同代谢状态（喂养和禁食条件）的原理图。B） 传统荧光图像（顶部）显示，BODIPY-C12 红色在指示融入 LD 的喂食条件下与 BODIPY （493/503） 共同本地化。SMLM 图像（左下、左）显示 D 中的密集 BODIPY-C12 puncta 和单分子痕迹（下、右）沿细胞膜显示扩散。（C） 在禁食条件下，BODIPY-C12 在细胞外围形成不与 L 共同本地化的 puncta（上部：左、中、左下）。SMLM 图像可解析 BODIPY-C12 红色（下、右）的 puncta 和受限痕迹。（D） 径向分布函数（左）显示禁食时 BODIPY-FA 的聚类较高。单分子跟踪的平均平方位移与时间图（右）确认BODIPY-C12在禁食时固定。刻度条 = 1 μm。请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：活体哺乳动物U2OS细胞中BODIPY染料的成像。（A） BODIPY-C12 在 488 nm 激发时的传统荧光图像（左）。在 561 nm 激发时使用 DII状态（右）的相应 SMLM 图像显示了 U2OS 细胞中 DII状态的纳米分布。内落显示脂质液滴的放大倍数（刻度条 = 500 nm）。（B） U2OS 细胞中使用 LysoTracker 绿色在 488 nm 激发（左）下使用 LysoTracker 绿色的传统图像。在 561 nm 激励下，不可移动的淋索体（右，刻度条 = 5 μm）的相应 SMLM 图像。内部：光学衍射有限解声（刻度棒100 nm）的SMLM图像。BODIPY-C12图像记录在23°C的活细胞成像溶液中。使用LysoTracker绿色的溶酶体图像记录在非荧光DMEM中，含有10%的胎儿牛血清、4 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮钠和1%青霉素-链霉素抗生素，温度为37°C。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
在此协议中，我们演示了如何使用传统的 BODIPY 偶联来获取具有空间分辨率级级改进的 SMLM 图像。该方法基于利用先前报告的红色移位DII状态的传统BODIPY染料，这些状态通过双分子接触暂时形成。这些状态可以特别兴奋和检测与红色偏移波长，是稀疏和短寿命足以SMLM。通过调整 BODIPY 单体与激光参数的浓度，可实现本地化和噪声到噪声的最佳密度。在喂养和禁食条件下，我们解决了脂肪酸类比和中性脂质在食用和禁食条件下以±30 nm分辨率（理论汤普森公式）在活酵母细胞中的细胞内分布和流动性问题。我们还发现，在 20 Hz 时，约 40% 的 BODIPY DII状态保持两个或多个数据采集帧，使单分子跟踪能够量化其在不同条件下的移动性。结果表明，BODIPY-FA在禁食时具有差异定位性和流动性，并提出了防止脂毒性的保护机制。只有通过传统BODIPY偶联的SMLM能力，我们才能跟踪单个BODIPY分子并解决不同代谢状态下光衍射限以下的LD和BODIPY-FA puncta的大小。脂肪酸分布和摄入的空间调节所涉及的确切分子机制和途径是我们未来研究的主题。此外，我们通过解决U2OS细胞中的BODIPY-FA和裂解体，将传统BODIPY结合的SMLM能力扩展到活的哺乳动物细胞。
使用 SMLM 的传统 BODIPY 结合的 DII状态比其他探头具有优势，因为有数百种不同的 BODIPY 变体在商业上可用，用于标记活细胞中的特定分子或细胞室。样品制备与在成像前在不洗涤的情况下以低浓度（±100 nM）浓度添加染料一样简单。与随着时间的推移漂白的其他 PALM/STORM 探头不同，BODIPY 单体不受其 DII状态激发的影响，因此在长期成像中为单个分子信号提供几乎从不消耗的来源。由于DII状态产生于自发的双分子接触，使用DII状态的SMLM不需要外部添加的缓冲来诱导闪烁23。同样，不需要高能量光活化，因为新合成的光可激活BODIPY版本24或SMLM的一些传统的BODIPY染料21，这可能损害细胞健康的长期成像25，26。,26此外，具有DII状态的SMLM对非特定相互作用的探头创造了固有的背景抑制，因为DII状态对单体浓度的二次依赖。因此，与检测到单体信号的传统探头相比，SMLM图像的对比度更高。
BODIPYs 表现出微弱的抗斯托克斯荧光，可在高激发功率下使用单个激光激发单体和昏暗器。一方面，该特性可用于同时进行常规荧光和 SMLM 成像，以跟踪和解析移动结构。另一方面，由于BODIPY信号占据两个发射通道，因此很难将 BODIPY DII状态与其他探头结合进行多色成像。但是，如果仔细选择探头，使用 Sec63-GFP 和Figure 2BBODIPY-C12 红色，则可以进行多色成像。同样，顺序双色 SMLM 可以与其他可激活的照片探测器（如 mEos2）进行，如图2C所示。其他可能的组合的双色SMLM包括使用绿色BODIPY结合和640纳米兴奋染料，如JF646绑定到光晕标签27。
总之，我们提出了一种利用传统的BODIPY染料对SMLM的优化方案，以研究活酵母和哺乳动物细胞中纳米长度尺度下脂肪酸、中性脂质和脂质的时空分布。稍加修改，此协议同样适用于 SMLM，同时跨不同单元类型进行数百种其他 BODIPY 组合。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所的支持，编号为R21GM127965。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror |
References
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
- Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
- Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
- Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
- Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
- Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
- Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
- Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
- Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
- Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).
