Summary
Konventionella BODIPY konjugat kan användas för levande-cell single-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) genom utnyttjande av deras övergående bildar, röd-skiftade mark tillstånd dimers. Vi presenterar ett optimerat SMLM-protokoll för att spåra och lösa subcellulära neutrala lipider och fettsyror i levande däggdjurs- och jästceller på den nanoskopiska längdskalan.
Abstract
Single molecule localization microscopy (SMLM) tekniker övervinna den optiska diffraktion gränsen för konventionell fluorescensmikroskopi och kan lösa intracellulära strukturer och dynamiken i biomolekyler med ~ 20 nm precision. En förutsättning för SMLM är fluorofores som övergår från ett mörkt till ett fluorescerande tillstånd för att undvika spatio-temporal överlappning av deras punktspridningsfunktioner i var och en av de tusentals datainsamlingsramarna. BODIPYs är väletablerade färgämnen med många konjugat som används i konventionell mikroskopi. Den övergående bildandet av rödförskjutna BODIPY marktillståndsdimmer (DII)resulterar i ljust enda molekylutsläpp som möjliggör enmolekyllokaliseringsmikroskopi (SMLM). Här presenterar vi ett enkelt men mångsidigt protokoll för SMLM med konventionella BODIPY konjugat i levande jäst och däggdjursceller. Denna procedur kan användas för att förvärva super-upplösning bilder och att spåra enda BODIPY-DII stater att extrahera spatio-temporal information om BODIPY konjugat. Vi tillämpar detta förfarande för att lösa lipiddroppar (LD), fettsyror och lysosomer i levande jäst- och däggdjursceller på nanoskopisk längdskala. Dessutom visar vi multi-color imaging kapacitet med BODIPY färgämnen när de används tillsammans med andra fluorescerande sonder. Våra representativa resultat visar differentiell rumslig fördelning och rörlighet av BODIPY-fettsyror och neutrala lipider i jäst under utfodras och fasted villkor. Detta optimerade protokoll för SMLM kan användas med hundratals kommersiellt tillgängliga BODIPY konjugat och är en användbar resurs för att studera biologiska processer på nanoskala långt utöver tillämpningarna av detta arbete.
Introduction
Single-molecule localization microscopy (SMLM) tekniker såsom stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM) och foto-aktiverad lokalisering mikroskopi (PALM) har dykt upp som metoder för att generera super-upplösning bilder med information utöver Abbe optiska diffraktion gräns1,2 och för att spåra dynamiken i enda biomolekyler3,4. Ett av kraven för sonder som är kompatibla med SMLM är möjligheten att kontrollera antalet aktiva fluoroforeer när som helst för att undvika rumslig överlappning av deras punktspridningsfunktioner (POLYESTERSTAPELS). I var och en av de tusentals datainsamlingsramar bestäms platsen för varje fluorescerande fluorofores med ~20 nm precision genom att montera motsvarande punktspridningsfunktion. Traditionellt har on-off blinkning av fluorofores kontrolleras genom stokastiska photoswitching1,2,,5 eller kemiskt inducerad inneboende blinkande6. Andra metoder är aktivering av fluorogener vid transientbindning till ett fluorogenaktiverande protein7,,8 och den programmerbara bindnings-unbinding av märkta DNA-oligomererer i total intern reflektionfluorescens (TIRF) eller ljusplåts excitation9. Nyligen rapporterade vi en ny och mångsidig märkning strategi för SMLM10 där tidigare rapporterade röd-skiftade dimeric (DII)stater konventionella bor di-pyrometan (BODIPY) conjugates11,12,13 är övergående bildar och blir specifikt upphetsad och upptäcks med röd-skiftade våglängder.
BODIPYs används ofta färgämnen med hundratals varianter som specifikt etikett subcellulära fack och biomolekyler14,15,16. På grund av deras användarvänlighet och tillämplighet i levande celler, BODIPY varianter är kommersiellt tillgängliga för konventionell fluorescensmikroskopi. Här beskriver vi ett detaljerat och optimerat protokoll om hur de hundratals kommersiellt tillgängliga BODIPY konjugat kan användas för live-cell SMLM. Genom att justera koncentrationen av BODIPY monomerer och genom att optimera excitation laserkrafter, bildbehandling och dataanalysparametrar, högkvalitativa superupplösningsbilder och enda molekylspårningsdata erhålls i levande celler. Vid låg koncentration (25-100 nM) kan BODIPY-konjugat samtidigt användas för SMLM i den rödförskjutna kanalen och för korrelerad konventionell fluorescensmikroskopi i den konventionella utsläppskanalen. De erhållna enskilda molekyldata kan analyseras för att kvantifiera den rumsliga organisationen av orörliga strukturer och för att extrahera de diffusiva tillstånden hos molekyler i levande celler17. Tillgången på BODIPY-sonder i både gröna och röda former möjliggör flerfärgsavbildning när de används i rätt kombination med andra kompatibla fluorofores.
I den här rapporten tillhandahåller vi ett optimerat protokoll för att förvärva och analysera live-cell SMLM-data med BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 röd och lysotracker-grön i flera färger. Vi löser fettsyror och neutrala lipider i levande jäst- och däggdjursceller med ~30 nm upplösning. Vi visar vidare att jästceller reglerar den rumsliga fördelningen av externt tillsatta fettsyror beroende på deras metaboliska tillstånd. Vi finner att la BODIPY-fettsyror (FA) lokalisera till endoplasmic reticulum (ER) och lipid droppar (LDs) under utfodras villkor medan BODIPY-FAs form icke-LD kluster i plasma membran vid fasta. Vi utökar tillämpningen av denna teknik ytterligare till bildlysosomer och LDs i levande däggdjursceller. Vårt optimerade protokoll för SMLM med konventionella BODIPY konjugat kan vara en användbar resurs för att studera biologiska processer på nanoskala med de otaliga tillgängliga BODIPY konjugat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: För jäst kloning och endogen märkning se vår senaste publikation10.
1. Beredning av jästcellprover för bildbehandling
- Förbered en flytande över natten kultur av en w303 jäst stam. Använd en steril träpinne, upptäck en liten mängd jästceller från en agar platta som innehåller jästextrakt-pepton-dextros till en kultur rör med ~ 2 ml syntetiskt komplett dextros (SCD) medium. Inkubera röret över natten i en skakande inkubator vid 270 varv/min och 30 °C.
- Utför en 1:50 morgon utspädning av cellerna i SCD. Fortsätt att odla de utspädda cellerna i 4 h vid 30 °C i en 270 rpm skakar inkubator, så att cellerna att växa i exponentiell fas och att nå en optisk densitet (OD) på ~ 0,6.
OBS: Förfarandet kan variera här beroende på vilket metaboliskt tillstånd som studeras. BODIPY konjugat kräver inte celler i exponentiell tillväxtfas. Var dock medveten om autofluorescens från döda celler under den stationära fasen, eftersom det kan orsakaII en bakgrundssignal för stark för att analysera enda BODIPY-D II-utsläpp. - För att studera fasta celler, odla jästkulturen i 2 dagar utan utbyte av media.
- Vid ~30 min före plätering av cellerna, inkubera ett kammarglas med 80 μL av 0,8 mg/ml sterila Concanavalin A (ConA) i avjoniserat H2O vid rumstemperatur. Efter 30 min, tvätta täckglaset tre gånger med avjoniserad H2O.
- Vid ~30 min före avbildning, pipett cellerna på kamrar coverglass, med rätt volym av färska SCD för att uppnå en optisk densitet på ~ 0,12 (vanligtvis 60 μL jäst kultur vid OD ~ 0,6 i 240 μL SCD). Låt cellerna bosätta sig och hålla fast vid ConA-ytan i 30 minuter.
- Tillsätt önskat BODIPY konjugat direkt till det kamrade täckglaset vid en slutlig koncentration av ~100 nM.
OBS: Ett BODIPY koncentrationsoptimeringsexperiment kan krävas beroende på bodipys lokal densitet i ett visst cellrum.
2. Beredning av däggdjursceller för SMLM-avbildning
- Underhåll u2OS-däggdjurscellerna i icke-fluorescerande DMEM med 10% fetala bovinserum, 4 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat och 1% penicillin-streptomycin antibiotika i en T25-kolv.
OBS: Celler kan också upprätthållas i DMEM med 10% fetala nötkreatur serum och 1% penicillin-streptomycin antibiotika, men mediet måste bytas ut före bildbehandling med en icke-autofluorescent lösning. - Dela cellerna på 70-80% sammanflöde 1:5 i en enda brunn av en 8-brunnsplatta. Odla cellerna i 8-brunnsplattan i 12 till 24 timmar före avbildning.
- Tillsätt BODIPY-C12, LysoTracker Green eller något annat BODIPY-konjugat vid en slutlig koncentration på 100 nM (stamlösningar i dimetylsulfaoxid [DMSO]) 10 min före avbildning. Den här gången kan variera beroende på önskat experiment.
OBS: Avbildning kan utföras vid omgivningstemperatur (23 °C) med hjälp av levande cellavbildningslösning. Avbildning vid 37 °C och 5% CO2 med icke-fluorescerande DMEM blandas med 10% fetala nötkreatur serum, 4 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvat och 1% penicillin-streptomycin antibiotika är att föredra att hålla cellerna närmare fysiologiska villkor och att göra biologiska slutsatser.
3. Förberedelse av utrustning
- Montera lämpliga filteruppsättningar i utsläppsbanan baserat på emissionsfärgen för BODIPY som används.
OBS: En dichroisk spegel med fyr band (zt/405/488/561/640rdc) separerar först excitationen från emissionsljuset. Det gröna utsläppet (525 nm) och det röda utsläppet (595 nm) delas sedan upp med en dichroisk långpassstråledelare (T562lpxr) följt av bandpassfilter ET525/50 i den gröna kanalen och ET 595/50 i den röda kanalen. De två kanalerna projiceras sedan till olika områden i samma kamerachip. På samma sätt delas det röda utsläppet (595 nm) och det vidströda utsläppet först av en dichroic lång-passera stråladelare (FF652-Di01) följt av band-passerar filtrerar ET 610/75 i rött och FF731/137 i den avlägsna-röda kanaliserar. - Slå på mikroskopet, mikroskopstadiet, lasrarna (488 nm, 561 nm) och kameran. Här används ett inverterat mikroskop med ett perfekt fokussystem och en EMCCD-kamera som kyls till -68 °C.
- Tillsätt en droppe nedsänkningsolja på mikroskopmålet.
- Öppna Programvaran Hal4000 (se tabell över material)som styr LED-lampan för ljus fältavbildning, laserkrafter, laserluckor och kamerainställningar för avbildning. Ställ in EMCCD-förstärkningen på 30 och kameratemperaturen till -68 °C. Förbered kameran och motsvarande programvara för att spela in filmer på 20 Hz.
OBS: Denna teknik gäller för alla breda fält mikroskop som kan fotoaktiverad lokalisering mikroskopi (PALM) och stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM) avbildning. Motsvarande programvara kan variera. - Slå på mikroskopets scenvärmare och ställ in den på en temperatur på 37 °C och till en CO2-nivå på 5 %. Justera objektiva korrigeringskragen därefter.
- Montera provet på mikroskopstadiet och fokusera tills fokuseringssystemet aktiveras. Flytta scenen med hjälp av scenstyrenheten tills felfria celler visas i synfältet.
OBS: För avbildning med jästceller i rumstemperatur finns det ingen anledning att slå på värmaren eller CO2-kontrollen. - Slå på lämpliga lasrar för excitering av monomerer samt dimrar. För BODIPY grön eller LysoTracker grön, använder vi en 561 nm laser för att excitera DII stater för SMLM och en 488 nm laser för att excitera monomerer för konventionell fluorescens.
OBS: För BODIPY röd, använd en 640 nm laser för att excitera DII stater för SMLM och en 561 nm laser för att excitera monomerer för konventionell fluorescens. För BODIPY röd, justera 561 nm och 640 nm laserkrafter för att visualisera bulk fluorescens i den röda kanalen och enda molekyl spricker i den rödröda kanalen. Den typiska effekten för 561 nm är ~0,06 W/cm2 och ~5 kW/cm2 för 640 nm. För BODIPY grön, räkna med att även se konventionell fluorescens i den gröna utsläppskanalen under 561 nm excitation. För BODIPY röd, räkna med att se konventionell fluorescens i den röda kanalen under 640 nm excitation. Detta signalerar uppstår från anti-Stokes utsläpp, som blir användbart för monomer/dimer co-localization avbildar med fortlöpande lasert excitation.
4. Datainsamling
- Ladda laser slutare sekvenser för excitation av monomerer samt dimrar.
OBS: Vi använder vanligtvis nio enmolekyl excitering ramar på 561 nm följt av en konventionell excitering ram på 488 nm. Detta ger en ljusare konventionell fluorescenssignal och undviker läckage av en annan 488 nm retbar fluorofor såsom grönt fluorescerande protein (GFP) i den röda single-molecule detektionskanalen i multi-color imaging applikationer. Alternativt kan du slå på 561 nm-lasern kontinuerligt och förlita dig på anti-Stokes-utsläppet för konventionella bilder i den kortare våglängdskanalen. - Justera laserkrafterna så att fluorescenssskurar med en molekyl detekteras i den rödförskjutna utsläppskanalen under 561 nm-excitation, och konventionell fluorescens visas i den gröna emissionskanalen med 488 nm excitation. Typiska laserkrafter hos 561 nm laser kommer att vara runt 0,8-1 kW/cm2 för SMLM, och 0,035-0,07 W/cm2 för 488 nm laser i konventionellt fluorescensavbildningsläge.
- Välj en målmapp för filmer och spela in 5 000-20 000 förvärvsramar för att samla in tillräckligt många lokaliseringar för att rekonstruera superupplösta bilder.
- Flytta till olika synfält och upprepa stegen ovan för att samla in data från fler celler.
5. Dataanalys och spårning av en molekyl
- Ladda filmen i en SMLM analysprogram.
Alla program18 kan användas. Vi använder INSIGHT (se tabell över material)och kors validera resultaten med hjälp av ThunderSTORM19 plugin för imageJ (Fiji). - Visuellt skärm filmen och justera kontrastinställningar så att enmolekyl fluorescens blinkar är synlig. Om det behövs begränsa regionen eller ramområdet för SMLM-dataanalys om delar av provet kontinuerligt fluorescerar.
- Ställ in enmolekylidentifieringsparametrar för montering med 2D Gaussiska polyesterstapelfibrer (ROI: 7 x 7 pixlar med pixelstorlek 160 nm, bredd 260-650 nm, höjd > 50 fotoner). Visuellt skärm genom några exempelramar för att kontrollera identifieringsparametrarna och på ett tillförlitligt sätt upptäcka de distinkta fluorescenssorna med en molekyl (se figur 1C).
OBS: Vissa identifieringsparametrar som höjd och bredd kan justeras något för att optimera igenkänningen av visuellt upplevda fluorescenssignaler med en molekyl. - Utför SMLM-bildanalys med de optimerade identifieringsparametrarna och rendera sedan varje enskild molekyl som en 2D Gaussian vars bredd viktas av den omvända kvadratroten av det upptäckta antalet fotoner.
- Bedöm uppgifternas kvalitet. Använd begränsade ramområden för att observera enmolekylfördelningar vid mer specifika tidpunkter. Detta kan förklara organelle rörelse under datainsamling.
- För att ytterligare analysera molekylfördelningens rumsliga fördelning och dynamik, exportera den erhållna molekyllistan som innehåller koordinaterna, bildramarna, fotonernas, bredden och höjderna. Importera molekyllistan i anpassade skriftliga analysprocedurer.
- För att erhålla rumslig information om den enda molekylfördelningen, beräkna den radiella fördelningsfunktionen ρ(r), som representerar lokaliseringarnas densitet som en funktion av det radiella avståndet20. För att få ρ(r), beräkna unika par-wise avstånd av alla lokaliseringar, konstruera histogrammet med bin centrerad på ri med höjd H(ri)och med en bredd dr och dividera med 2πri* dr; (ρ(ri) = H(r i)/π(ri+dr)2-ri2).i Den radiella distributionsfunktionen kan sedan användas för att kvantifiera och jämföra graden av klustring samt klusters karakteristiska storlek.
- Om du vill ha dynamisk information om spridningen av molekyler länkar du lokaliseringar som visas till exempel inom 3 pixlar (0,48 μm) i på varandra följande datainsamlingsramar för att skapa enstaka molekylspårningar.
OBS: Länkavståndet beror på spridningen av molekyler och tätheten av lokaliseringar. Det maximala länkningsavståndet kan uppskattas genom att analysera tätheten av lokaliseringar i varje bildruta21,22. Den genomsnittliga densiteten fastställdes vara 0,043 lokaliseringar per μm2; Således var en radie på 0,48 μm inom en tillräckligt låg densitet för att säkerställa att olika molekyler inte var sammankopplade. - Medelvärden för olika fördröjningar Δt från flera spår som varar minst tre fördröjningar för att skapa en genomsnittlig kvadratisk förskjutning (MSD) jämfört med Δt-observationsområdet. Montera MSD vs Δt-kurvan med ekvationen MSD = 4DΔt +σ 2 för att beräkna den genomsnittliga diffusionskoefficienten D3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenterar vi ett optimerat urval beredning, datainsamling och analys förfarande för SMLM med BODIPY konjugat baserat på protokollet ovan (figur 1A). För att visa ett exempel på arbetsflödet för att förvärva och analysera SMLM-data använder vi BODIPY (493/503) i jäst för att lösa LD:er under den optiska diffraktionsgränsen (figur 1B-F). Exempel på de olika flerfärgsbildslägena för BODIPY tillsammans med andra sonder som GFP, mEos2 visas i figur 2. Vi manipulerar det metaboliska tillståndet i jäst genom att odla dem i samma medium för ~ 48 h och visar att BODIPY-C12 bildar orörliga icke-LD kluster i cellperiferi vid fasta i motsats till deras införlivande i LD under fed villkor(Figur 3). För att ytterligare utöka SMLM-kapaciteten hos BODIPY-konjugat till däggdjursceller, bildar vi BODIPY-C12 och LysoTracker-green i levande U2OS-celler (figur 4).
Figur 1: Optimering av SMLM datainsamling och analys med hjälp av BODIPY färgämnen. (A)Arbetsflöde för att optimera enmolekyl fluorescenssignaler och efterbehandling av SMLM-data från BODIPY konjugat. (B)LED-bild (vänster), konventionell fluorescensbild (mitten, excitering: 488 nm, utsläpp: 525 nm) och anti-Stokes bild (höger, excitering: 561 nm, utsläpp: 525 nm) jästceller färgade med LD-markörEN BODIPY (493/503). (C)Enstaka SMLM-ramar som visar singe BODIPY DII-utsläpp (excitation: 561 nm, utsläpp: 595 nm) vid för låg densitet (vänster), optimal densitet (mitten) och för hög densitet (höger). (D)Optimering av SMLM-analysparametrar. Med en för hög fotonnummertröskel missar programvaran giltiga enmolekylsignaler (vänster), detekterar alla molekyler med en optimal fotontröskel (mitten) och upptäcker falska lokaliseringar med för låga fotontrösklar (höger). (E) SMLM bild av BODIPY (493/503) löser storleken på LDs (vänster, zoom) med en genomsnittlig diameter på 125 nm. (F)Single molecule tracking avslöjar begränsad spridning av BODIPY (493/503) inuti lyssor (vänster). Spår används för att beräkna MSD kontra tidskurvan, som uppvisar sub-diffusivt beteende inuti LDs (höger). Skala bar = 1 μm, zoom = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: SMLM-avbildning i flera färger med BODIPY-konjugat i levande celler. (A)Konventionell bild av BODIPY-C12 under 488 nm excitation (vänster). Motsvarande SMLM-bild med DII-tillstånd av BODIPY-C12 under 561 nm excitation (mitten) och zoom (höger) avslöjar BODIPY-C12 i nya LDs. (B) Konventionell fluorescensbild av ER märkt med Sec63-GFP under 488 nm excitation (vänster). Samtidigt inspelad konventionell fluorescensbild av BODIPY-C12 röd med 561 nm excitation (mitten) och SMLM bild med 640 nm excitation (höger). (C)Sekventiell tvåfärgad SMLM-avbildning av sec63-mEos2 och BODIPY-C12 gröna DII-stater. Först är mEos2 avbildas med hög 405 nm foto-aktivering och 561 nm excitation (vänster) följt av långa datainsamling utan 405 nm aktivering (mitten). Skala bar = 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Differentiell fettsyrafördelning vid fasta i jästceller. (A)Schematisk beskriver olika metaboliska tillstånd (matas och fastar tillstånd) baserat på varaktigheten av tillväxten i SCD-mediet. B) Konventionella fluorescensbilder (överst) visar att BODIPY-C12 röd samlokaliserar med BODIPY (493/503) under utfodrade förhållanden som indikerar införlivande i LDs. SMLM-bilden (nedre, vänstra) visar tät BODIPY-C12 puncta i LDs och enstaka molekylspår (nedre, högra) uppvisar diffusion längs cellulära membran. (C)Under fastigt tillstånd bildar BODIPY-C12 puncta i cellperiferin som inte samlokaliserar med LDs (övre: vänster, mitten, nedre vänstra). SMLM-bilden löser puncta och begränsade spår av BODIPY-C12 röd (nedre, högra). (D)Den radiella fördelningsfunktionen (vänster) visar högre klustring av BODIPY-FAs vid fasta. Den genomsnittliga kvadratiska förskjutning vs tid tomt enstaka molekyl spårning (höger) bekräftar immobilisering av BODIPY-C12 vid fasta. Skalstång = 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Avbildning av BODIPY-färgämnen i levande U2OS-celler hos däggdjur. (A)Konventionell fluorescensbild (vänster) av BODIPY-C12 vid 488 nm excitation. Motsvarande SMLM-bild med DII-tillstånd (höger) vid 561 nm excitation visar den nanoskopiska fördelningen av DII-tillstånd i U2OS-cellen. Inset visar förstoringar av lipiddroppar (skalstång = 500 nm). (B)Konventionell bild av lysosomer i U2OS celler med LysoTracker grön vid 488 nm excitation (vänster). Motsvarande SMLM-bild av orörliga lysosomer (höger, skalstång = 5 μm) vid 561 nm excitation. Infälld: SMLM-bild av en optiskt diffraktion begränsad lysosom (skala bar 100 nm). Cellerna I 23°C-bilderna spelades in i en cellavbildningslösning vid 23 °C. Bilderna av lysosomer med LysoTracker green spelades in i icke-fluorescerande DMEM med 10% fetala nötkreatur serum, 4 mM glutamin, 1 mM natrium pyruvat och 1% penicillin-streptomycin antibiotika vid 37 °C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll visade vi hur konventionella BODIPY konjugat kan användas för att få SMLM bilder med en storleksordning förbättring i rumslig upplösning. Denna metod är baserad på att utnyttja tidigare rapporterade, röd-skiftade DII stater konventionella BODIPY färgämnen, som övergående form genom bi-molekylära möten. Dessa tillstånd kan vara särskilt upphetsad och upptäcks med röd-skiftade våglängder och är glesa och kortlivade nog för SMLM. Genom att justera koncentrationen av BODIPY monomerer tillsammans med laserparametrar, kan en optimal densitet av lokaliseringar och signal-till-buller uppnås. Vi löst intracellulära fördelningen och rörlighet av fettsyra analoger och neutrala lipider med ~ 30 nm upplösning (teoretisk Thompsons formel) i levande jästceller under utfodras och fastade förhållanden. Vi fann också att ~ 40% av BODIPY DII stater stanna på för två eller flera datainsamling ramar på 20 Hz, vilket gör det möjligt single-molekyl spårning för att kvantifiera sin rörlighet under olika förhållanden. Våra resultat visar differentiell lokalisering och rörlighet av BODIPY-FA vid fasta och föreslå en skyddsmekanism mot lipotoxicitet. Vår förmåga att spåra enda BODIPY molekyler och att lösa storleken på LDs och BODIPY-FA puncta under den optiska diffraktion gränsen under olika metaboliska tillstånd är endast möjligt med den utvecklade SMLM förmåga konventionella BODIPY konjugat. De exakta molekylära mekanismer och vägar som ingår i den rumsliga regleringen av fettsyrafördelningen och upptaget är föremål för våra framtida studier. Dessutom utökade vi SMLM kapacitet konventionella BODIPY konjugat till levande däggdjur celler genom att lösa BODIPY-FA och lysosomer i U2OS celler.
Använda DII tillstånd av konventionella BODIPY konjugat för SMLM har fördelar jämfört med andra sonder eftersom hundratals olika BODIPY varianter är kommersiellt tillgängliga som etikett specifika molekyler eller cellulära fack i levande celler. Provberedningen är lika enkelt som att lägga till färgämnet vid låga (~100 nM) koncentrationer före avbildning utan tvättning. I motsats till andra PALM / STORM sonder som blekmedel över tiden, bodipy monomerer påverkas inte av excitation av deras DII stater och därför ger en nästan aldrig utarmning källa för enstaka molekylsignaler i långsiktig avbildning. Eftersom DII-tillstånd uppstår på grund av spontana bimolekylära möten kräver SMLM med DII-tillstånd ingen externt tillsatt buffert för att inducera blinkande23. På samma sätt finns det inget behov av hög energi foto-aktivering som krävs för nyligen syntetiserade foto-aktiverande BODIPY versioner24 eller SMLM av vissa konventionella BODIPY färgämnen21, vilket kan vara skadligt för cellhälsa under lång sikt imaging25,26. Dessutom skapar SMLM med DII-stater en inneboende bakgrundssuppression av icke-specifikt interagerande sonder på grund av det kvadratiska beroendet av DII-tillstånd på monomerkoncentrationen. Därför uppnås en högre kontrast i SMLM-bilder jämfört med traditionella sonder vars monomeriska signal detekteras.
BODIPYs uppvisar en svag anti-Stokes fluorescens som möjliggör excitation av monomerer och dimers med en enda laser vid hög excitation makt. Å ena sidan kan denna egenskap utnyttjas för samtidig konventionell fluorescens och SMLM-avbildning för att spåra och lösa rörliga strukturer. Å andra sidan gör det det svårare att kombinera BODIPY DII stater med andra sonder för multi-color imaging som BODIPY signalen upptar två utsläppskanaler. Multifärgsavbildning är dock möjlig när sonder väljs noggrant enligt figur 2B med S63-GFP och BODIPY-C12 röd. På samma sätt är sekventiell tvåfärgad SMLM möjligt med andra fotoaktiverbara sonder som mEos2 som visas i figur 2C. Andra möjliga kombinationer för tvåfärgs-SMLM inkluderar användning av gröna BODIPY konjugat och en 640 nm retbara färgämnen som JF646 bunden till halo tag27.
Sammanfattningsvis har vi lagt fram ett optimerat protokoll för SMLM med konventionella BODIPY färgämnen för att undersöka spatio-temporal distribution av fettsyror, neutrala lipider och lysosomer på nanoskopisk längd skala i levande jäst och däggdjur celler. Med mindre ändringar kan detta protokoll vara lika tillämpligt för SMLM med hundratals andra BODIPY konjugat över olika celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Den forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under tilldelningsnummer R21GM127965.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror |
References
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
- Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
- Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
- Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
- Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
- Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
- Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
- Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
- Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
- Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).
