Summary
Conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para microscopia de localização de moléculas únicas de células vivas (SMLM) através da exploração de seus dimers de estado terrestre transitoriamente formados. Apresentamos um protocolo SMLM otimizado para rastrear e resolver lipídios neutros subcelulares e ácidos graxos em células de mamíferos vivos e leveduras na escala de comprimento nanoscópico.
Abstract
As técnicas de microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM) superam o limite de difração óptica da microscopia convencional de fluorescência e podem resolver estruturas intracelulares e a dinâmica das biomoléculas com precisão de ~20 nm. Um pré-requisito para SMLM são fluoroforos que transitam de um estado escuro para um fluorescente, a fim de evitar a sobreposição espátula-temporal de suas funções de spread de ponto em cada um dos milhares de quadros de aquisição de dados. BodipYs são corantes bem estabelecidos com numerosos conjugados usados na microscopia convencional. A formação transitória de dimers de estado terrestre BODIPY de mudança vermelha (DII) resulta em emissão de molécula única brilhante permitindo microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM). Aqui apresentamos um protocolo simples, mas versátil para SMLM com conjugados BODIPY convencionais em leveduras vivas e células de mamíferos. Este procedimento pode ser usado para adquirir imagens de super-resolução e para rastrear estados bodipy-DII únicos para extrair informações espáteris-temporais de conjugados BODIPY. Aplicamos este procedimento para resolver gotículas lipídicas (LDs), ácidos graxos e lisosomos em leveduras vivas e células mamíferas na escala de comprimento nanoscópico. Além disso, demonstramos a capacidade de imagem multicolorido com corantes BODIPY quando usados em conjunto com outras sondas fluorescentes. Nossos resultados representativos mostram a distribuição espacial diferencial e a mobilidade dos ácidos graxos BODIPY e lipídios neutros na levedura sob condições alimentadas e jejuadas. Este protocolo otimizado para SMLM pode ser usado com centenas de conjugados BODIPY disponíveis comercialmente e é um recurso útil para estudar processos biológicos na nanoescala muito além das aplicações deste trabalho.
Introduction
Técnicas de microscopia de localização de molécula única (SMLM), como microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e microscopia de localização ativada por foto (PALM) surgiram como métodos para gerar imagens de super-resolução com informações além do limite de difração óptica da Abbe1,,2 e para o rastreamento da dinâmica de biomoléculas únicas3,,4. Um dos requisitos para sondas compatíveis com SMLM é a capacidade de controlar o número de fluoroforos ativos a qualquer momento para evitar a sobreposição espacial de suas funções de propagação de ponto (PSF). Em cada um dos milhares de quadros de aquisição de dados, a localização de cada fluoroforos fluorescentes é então determinada com precisão de ~20 nm, encaixando sua função de propagação de ponto correspondente. Tradicionalmente, o piscar on-off de fluoroforos tem sido controlado através de fotostocásticas1,,2,5 ou quimicamente induzido piscando6. Outras abordagens incluem a ativação induzida de fluorogens sobre a ligação transitória a uma proteína ativante de fluorogen7,8 e a vinculação programável de oligômeros de DNA rotulados em fluorescência de reflexão interna total (TIRF) ou excitação de folha de luz9. Recentemente, relatamos uma nova e versátil estratégia de rotulagem para o SMLM10, na qual os estados diméricos de mudança vermelha (DII)anteriormente relatados de boro di-pirometano convencional (BODIPY) conjugados11,,12,13 estão se formando transitoriamente e tornam-se especificamente animados e detectados com comprimentos de onda de mudança vermelha.
BODIPYs são corantes amplamente utilizados com centenas de variantes que rotulam especificamente compartimentos subcelulares e biomoléculas14,,15,,16. Devido à sua facilidade de uso e aplicabilidade em células vivas, as variantes BODIPY estão comercialmente disponíveis para microscopia de fluorescência convencional. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e otimizado sobre como as centenas de conjugados BODIPY disponíveis comercialmente podem ser usados para SMLM de células vivas. Ao ajustar a concentração de monômeros BODIPY e otimizando os poderes de laser de excitação, os parâmetros de análise de imagens e dados, imagens de super-resolução de alta qualidade e dados de rastreamento de moléculas únicas são obtidos em células vivas. Quando utilizados em baixa concentração (25-100 nM), os conjugados BODIPY podem ser usados simultaneamente para SMLM no canal de mudança vermelha e para microscopia de fluorescência convencional correlativa no canal de emissão convencional. Os dados de molécula única obtidos podem ser analisados para quantificar a organização espacial de estruturas imóveis e extrair os estados difusivos de moléculas em células vivas17. A disponibilidade de sondas BODIPY em formas verde e vermelha permite imagens multicoloridos quando usadas na combinação certa com outros fluoroforos compatíveis.
Neste relatório, fornecemos um protocolo otimizado para aquisição e análise de dados SMLM de células vivas usando BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 vermelho e verde-lysotracker em múltiplas cores. Resolvemos ácidos graxos e lipídios neutros em leveduras vivas e células mamíferas com resolução de ~30 nm. Demonstramos ainda que as células de levedura regulam a distribuição espacial de ácidos graxos adicionados externamente, dependendo de seu estado metabólico. Descobrimos que os ácidos graxos BODIPY (FA) adicionados localizam-se ao ânticulo endoplasmático (ER) e gotículas lipídicas (LDs) sob condições alimentadas, enquanto bodipy-FAs formam aglomerados não-LD na membrana plasmática após o jejum. Estendemos ainda mais a aplicação dessa técnica a líssomos de imagem e LDs em células de mamíferos vivos. Nosso protocolo otimizado para SMLM usando conjugados BODIPY convencionais pode ser um recurso útil para estudar processos biológicos na nanoescala com a miríade de conjugados BODIPY disponíveis.
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Protocol
NOTA: Para clonagem de levedura e marcação endógena, consulte nossa publicação recente10.
1. Preparação de amostras de células de levedura para imagem
- Prepare uma cultura líquida durante a noite de uma cepa de levedura w303. Usando uma vara de madeira estéril, localmente uma pequena quantidade de células de levedura de uma placa de ágar contendo extrato de levedura -peptone-dextrose em um tubo de cultura com ~2 mL de meio sintético de dextrose completa (SCD). Incubar o tubo durante a noite em uma incubadora de agitação a 270 rpm e 30 °C.
- Realize uma diluição de 1:50 manhã das células em SCD. Continue a cultivar as células diluídas por 4h a 30 °C em uma incubadora de agitação de 270 rpm, permitindo que as células cresçam em fase exponencial e alcancem uma densidade óptica (OD) de ~0,6.
NOTA: O procedimento pode variar aqui dependendo do estado metabólico que está sendo estudado. Os conjugados BODIPY não requerem células na fase de crescimento exponencial. No entanto, fique ciente da autofluorescência de células mortas durante a fase estacionária, pois pode causar um sinal de fundo muito forte para analisar emissores BODIPY-DII únicos. - Para estudar células de jejum, cresça a cultura da levedura por 2 dias sem troca de mídia.
- A ~30 minutos antes de emplacamento das células, incubar um vidro de cobertura com 80 μL de 0,8 mg/mL estéril Concanavalin A (ConA) em H2O desionizado à temperatura ambiente. Depois de 30 min, lave a tampa três vezes com H2O desionizado.
- Em ~30 minutos antes da imagem, pipete as células na tampa de câmara, com o volume correto de SCD fresco para alcançar uma densidade óptica de ~0,12 (tipicamente cultura de levedura de 60 μL em OD ~0,6 em 240 μL SCD). Deixe as células se estabelecerem e aderirem à superfície do por 30 minutos.
- Adicione o conjugado BODIPY desejado diretamente ao vidro de cobertura câmara em uma concentração final de ~100 nM.
NOTA: Um experimento de otimização de concentração BODIPY pode ser necessário dependendo da densidade local da BODIPYs em um determinado compartimento celular.
2. Preparação de células mamíferas para imagem SMLM
- Mantenha as células U2OS mâmicas em DMEM não fluorescentes com soro bovino fetal de 10%, glutamina de 4 mM, piruvato de sódio de 1 mM e 1% antibióticos de penicilina-estreptomicina em um frasco T25.
NOTA: As células também podem ser mantidas no DMEM com soro bovino fetal de 10% e 1% de antibióticos de penicilina-estreptomicina, no entanto, o meio precisa ser trocado antes da imagem com uma solução não autofluorescente. - Divida as células a 70-80% de confluência 1:5 em um único poço de uma placa de 8 poços. Cultue as células na placa de 8 poços por 12 a 24 horas antes da imagem.
- Adicione BODIPY-C12, LysoTracker Green ou qualquer outro conjugado BODIPY em uma concentração final de 100 nM (soluções de estoque em sulfóxido de dimetil [DMSO]) 10 minutos antes da imagem. Este tempo pode variar de acordo com o experimento desejado.
NOTA: A imagem pode ser realizada à temperatura ambiente (23 °C) usando uma solução de imagem de células vivas. No entanto, a imagem a 37 °C e 5% de CO2 com DMEM não fluorescente misturada com soro bovino fetal de 10%, 4 mM de glutamina, piruvato de sódio de 1 mM e 1% antibióticos de penicilina-estreptomicina é preferível manter as células mais próximas das condições fisiológicas e tirar conclusões biológicas.
3. Preparação do equipamento
- Monte os conjuntos de filtros apropriados no caminho de emissão com base na cor de emissão do BODIPY que está sendo utilizado.
NOTA: Um espelho dicroico de banda quádrupla (zt/405/488/561/640rdc) separa pela primeira vez a excitação da luz de emissão. A emissão verde (525 nm) e a emissão vermelha (595 nm) são então divididas por um divisor de feixe de passagem longa dicroico (T562lpxr), seguido pelos filtros de passe de banda ET525/50 no canal verde e ET 595/50 no canal vermelho. Os dois canais são então projetados para diferentes áreas do mesmo chip de câmera. Da mesma forma, a emissão vermelha (595 nm) e a emissão de vermelho distante são primeiramente divididas por um divisor de feixe de passagem longadicróica (FF652-Di01) seguido pelos filtros de passe de banda ET 610/75 no vermelho e FF731/137 no canal vermelho. - Ligue o microscópio, o estágio do microscópio, os lasers (488 nm, 561 nm) e a câmera. Aqui são utilizados um microscópio invertido com um sistema de foco perfeito e uma câmera EMCCD refrigerado a -68 °C.
- Adicione uma gota de óleo de imersão no objetivo do microscópio.
- Abra o software Hal4000 (veja a Tabela de Materiais)que controla a luz LED para imagens de campo brilhante, poderes a laser, persianas a laser e configurações de câmera para imagens. Defina o ganho emccd para 30 e a temperatura da câmera para -68 °C. Prepare a câmera e o software correspondente para gravar filmes a 20 Hz.
NOTA: Esta técnica se aplica a qualquer microscópio de campo largo capaz de microscopia de localização ativada por foto (PALM) e imagens de microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM). O software correspondente pode variar. - Ligue o aquecedor do estágio do microscópio e coloque-o a uma temperatura de 37 °C e a um nível de CO2 de 5%. Ajuste a coleira de correção objetiva em conformidade.
- Monte a amostra no estágio do microscópio e concentre-se até que o sistema de foco se envolva. Mova o estágio usando o controlador de palco até que as células saudáveis apareçam no campo de visão.
NOTA: Para imagens com células de leveduras à temperatura ambiente, não há necessidade de ligar o aquecedor ou o controle de CO2. - Ligue os lasers apropriados para a excitação de monômeros, bem como dimers. Para verde BODIPY ou verde LysoTracker, usamos um laser de 561 nm para excitar os estados DII para SMLM e um laser de 488 nm para excitar monômeros para fluorescência convencional.
NOTA: Para vermelho BODIPY, use um laser de 640 nm para excitar os estados DII para SMLM e um laser de 561 nm para excitar os monômeros para fluorescência convencional. Para o vermelho BODIPY, ajuste os poderes laser de 561 nm e 640 nm para visualizar fluorescência a granel no canal vermelho e uma única molécula estoura no canal vermelho. A potência típica para 561 nm é ~0,06 W/cm2 e ~5 kW/cm2 para 640 nm. Para o verde BODIPY, espere também ver fluorescência convencional no canal de emissão verde abaixo de 561 nm excitação. Para o vermelho BODIPY, espere ver fluorescência convencional no canal vermelho sob excitação de 640 nm. Este sinal surge da emissão anti-Stokes, que se torna útil para imagens de co-localização monômeros/dimer com excitação a laser contínua.
4. Aquisição de dados
- Carregue sequências de obturadores laser para a excitação de monômeros, bem como dimers.
NOTA: Normalmente usamos nove quadros de excitação de molécula única a 561 nm seguidos por um quadro de excitação convencional a 488 nm. Isso oferece um sinal de fluorescência convencional mais brilhante e evita o vazamento de outro fluoróforo excitável de 488 nm, como a proteína fluorescente verde (GFP) no canal vermelho de detecção de molécula única em aplicações de imagem multicolorida. Alternativamente, ligue o laser de 561 nm continuamente e conte com a emissão anti-Stokes para imagens convencionais no canal de comprimento de onda mais curto. - Sintonize os poderes de laser de tal forma que explosões de fluorescência de molécula única são detectadas no canal de emissão deslocada para vermelho sob excitação de 561 nm, e a fluorescência convencional aparece no canal de emissão verde com excitação de 488 nm. As potências laser típicas do laser de 561 nm serão em torno de 0,8-1 kW/cm2 para SMLM, e 0,035-0,07 W/cm2 para o laser de 488 nm no modo convencional de imagem de fluorescência.
- Escolha uma pasta de destino para filmes e grave de 5.000 a 20.000 quadros de aquisição para coletar localizações suficientes para reconstruir imagens de super resolução.
- Mova-se para diferentes campos de visão e repita os passos acima para coletar dados de mais células.
5. Análise de dados e rastreamento de molécula única
- Carregue o filme em um software de análise SMLM.
NOTA: Qualquer software18 pode ser usado. Usamos insight (ver a Tabela de Materiais) e validamos os resultados usando o plugin ThunderSTORM19 para imageJ (Fiji). - Visualmente tela o filme e ajustar configurações de contraste de modo que a fluorescência de molécula única piscando é visível. Se necessário, restringir a região ou a faixa de quadros para análise de dados SMLM se partes da amostra estiverem continuamente fluorescentes.
- Defina parâmetros de identificação de molécula única para encaixe com PSFs gaussianos 2D (ROI: 7 x 7 pixels com tamanho de pixel de 160 nm, largura 260-650 nm, altura > 50 fótons). Visualmente tela através de alguns quadros de exemplo para verificar os parâmetros de identificação e detectar de forma confiável as distintas rajadas de fluorescência de molécula única (ver Figura 1C).
NOTA: Certos parâmetros de identificação, como altura e largura, podem ser ligeiramente ajustados para otimizar o reconhecimento de sinais de fluorescência de molécula única visualmente percebidos. - Realize a análise de imagem SMLM com os parâmetros de identificação otimizados e, em seguida, torne cada molécula como um gaussiano 2D cuja largura é ponderada pela raiz quadrada inversa do número detectado de fótons.
- Avalie a qualidade dos dados. Use faixas de quadros restritas para observar distribuições de moléculas únicas em instâncias mais específicas no tempo. Isso pode explicar a movimentação de organelas durante a aquisição de dados.
- Para analisar melhor a distribuição espacial e a dinâmica das distribuições das moléculas, exporte a lista de moléculas obtidas contendo as coordenadas, quadros de aparência, fótons, larguras e alturas das localizações. Importe a lista de moléculas em procedimentos personalizados de análise por escrito.
- Para a obtenção de informações espaciais da distribuição de molécula única, calcule a função de distribuição radial ρ(r), que representa a densidade das localizações em função da distância radial20. Para obter ρ(r), calcular distâncias únicas em pares de todas as localizações, construir o histograma com caixas centradas em ri com altura H(ri) e com uma largura dr e dividir por 2πri*dr; (ρ(ri) = H(ri)/π(ri+dr)2-ri2). A função de distribuição radial pode então ser usada para quantificar e comparar o grau de agrupamento, bem como o tamanho característico dos clusters.
- Para obter informações dinâmicas sobre a difusão de moléculas, vincule localizações que aparecem, por exemplo, dentro de 3 pixels (0,48 μm) em quadros consecutivos de aquisição de dados para criar traços de molécula única.
NOTA: A distância de ligação dependerá da difusão de moléculas e da densidade das localizações. A distância máxima de ligação pode ser estimada analisando a densidade de localizações em cada quadro21,22. A densidade média foi determinada em 0,043 localizações por μm2; assim, um raio de 0,48 μm estava dentro de uma densidade baixa o suficiente para garantir que diferentes moléculas não estivessem ligadas juntas. - Média dos deslocamentos para diferentes tempos de lag Δt de múltiplos traços com duração mínima de três tempos de atraso para criar um deslocamento médio quadrado (MSD) vs. Δt plot. Ajuste a curva MSD vs. Δt com a equação MSD = 4DΔt + σ2 para calcular o coeficiente de difusão média D3.
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Representative Results
Aqui, apresentamos um procedimento otimizado de preparação amostral, aquisição de dados e análise para SMLM utilizando conjugados BODIPY com base no protocolo acima(Figura 1A). Para demonstrar um exemplo do fluxo de trabalho para aquisição e análise de dados SMLM, empregamos BODIPY (493/503) em leveduras para resolver LDs abaixo do limite de difração óptica(Figura 1B-F). Exemplos dos diferentes modos de imagem multicoloridos do BODIPY em conjunto com outros testes como GFP, mEos2 são mostrados na Figura 2. Manipulamos o estado metabólico na levedura, cultivando-os no mesmo meio por ~48 h e mostramos que o BODIPY-C12 forma aglomerados imóveis não-LD na periferia celular após o jejum em contraste com sua incorporação em LDs sob condições alimentadas(Figura 3). Para estender ainda mais a capacidade SMLM dos conjugados BODIPY para células mamíferas, nós imaginamos BODIPY-C12 e LysoTracker-green em células U2OS vivas(Figura 4).
Figura 1: Otimização da aquisição e análise de dados SMLM utilizando corantes BODIPY. (A) Fluxo de trabalho para otimização de sinais de fluorescência de moléculas únicas e pós-processamento dos dados SMLM de conjugados BODIPY. (B) imagem LED (esquerda), imagem de fluorescência convencional (meio, excitação: 488 nm, emissão: 525 nm) e imagem anti-Stokes (direita, excitação: 561 nm, emissão: 525 nm) de células de levedura manchadas com o marcador LD BODIPY (493/503). (C) Quadros SMLM únicos que mostram emissores BODIPY DII (excitação: 561 nm, emissão: 595 nm) em densidade muito baixa (esquerda), densidade ótima (média) e densidade muito alta (direita). (D) Otimização dos parâmetros de análise SMLM. Com um limite de número de fótons muito alto, o software perde sinais de molécula única válidos (esquerda), detecta todas as moléculas com um limiar de fóton ótimo (meio) e detecta falsas localizações com limiares de fótons muito baixos (à direita). (E) Imagem SMLM de BODIPY (493/503) resolve o tamanho de LDs (esquerda, zoom) com um diâmetro médio de 125 nm. (F) O rastreamento de moléculas únicas revela a difusão confinada do BODIPY (493/503) dentro dos LDs (esquerda). Os traços são usados para calcular a curva MSD vs. time, que exibe comportamento sub-difusivo dentro de LDs (à direita). Barra de escala = 1 μm, zoom = 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem de SMLM multicolorido usando conjugados BODIPY em células vivas. (A) Imagem convencional de BODIPY-C12 sob excitação de 488 nm (esquerda). Imagem SMLM correspondente usando os estados DII de BODIPY-C12 sob excitação de 561 nm (médio) e zoom (direita) revelando BODIPY-C12 em LDs emergentes. (B) Imagem de fluorescência convencional do ER rotulado com Sec63-GFP sob excitação de 488 nm (esquerda). Registrou simultaneamente imagem de fluorescência convencional de vermelho BODIPY-C12 com excitação de 561 nm (meio) e imagem SMLM usando excitação de 640 nm (à direita). (C) Imagens sequenciais de SMLM de duas cores dos estados Sec63-mEos2 e BODIPY-C12 verde DII. Primeiro, o mEos2 é imageado com alta ativação fotográfica de 405 nm e excitação de 561 nm (esquerda), seguido de aquisição de dados longos sem ativação de 405 nm (meio). Barra de escala = 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Distribuição diferencial de ácidos graxos no jejum em células de levedura. (A) Esquema descrevendo diferentes estados metabólicos (condição alimentada e em jejum) com base na duração do crescimento no meio SCD. B) Imagens convencionais de fluorescência (topo) mostram que o vermelho BODIPY-C12 co-localiza com BODIPY (493/503) sob condições alimentadas indicando incorporação em LDs. A imagem SMLM (inferior, esquerda) mostra puncta BODIPY-C12 densa em LDs e traços de molécula única (inferior, direita) exibem difusão ao longo de membranas celulares. (C) Em condições de jejum, BODIPY-C12 forma puncta na periferia celular que não co-localiza com LDs (superior: esquerda, médio, inferior esquerdo). A imagem SMLM resolve os traços punctas e confinados do vermelho BODIPY-C12 (inferior, à direita). (D) A função de distribuição radial (esquerda) mostra maior agrupamento de BODIPY-FAs após o jejum. O deslocamento médio-quadrado versus o tempo de rastreamento de molécula única (à direita) confirma a imobilização do BODIPY-C12 após o jejum. Barra de escala = 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem de corantes BODIPY em células U2OS de mamíferos vivos. (A) Imagem de fluorescência convencional (esquerda) de BODIPY-C12 a 488 nm excitação. A imagem SMLM correspondente usando estados DII (à direita) em excitação de 561 nm mostra a distribuição nanoscópica dos estados DII em células U2OS. Os insets mostram ampliações de gotículas lipídicas (barra de escala = 500 nm). (B) Imagem convencional de lysososomes em células U2OS usando verde LysoTracker a 488 nm excitação (esquerda). A imagem SMLM correspondente de lisesomos imóveis (direita, barra de escala = 5 μm) a 561 nm excitação. Inset: Imagem SMLM de uma difração óptica limitada lysosome (barra de escala 100 nm). As imagens do BODIPY-C12 foram registradas em solução de imagem celular viva a 23 °C. As imagens de lysosomes usando verde LysoTracker foram registradas em DMEM não fluorescente com soro bovino fetal de 10%, glutamina de 4 mM, piruato de sódio de 1 mM e 1% antibióticos de penicilina-estreptomicina a 37 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, demonstramos como conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para obter imagens SMLM com uma ordem de melhoria de magnitude na resolução espacial. Este método baseia-se na exploração de estados DII previamente relatados de corantes BODIPY convencionais, que se formam transitoriamente através de encontros bi-moleculares. Esses estados podem ser especificamente animados e detectados com comprimentos de onda com mudanças vermelhas e são esparsos e de curta duração suficiente para SMLM. Ao ajustar a concentração de monômeros BODIPY juntamente com parâmetros laser, uma densidade ideal de localizações e sinal-ruído pode ser alcançada. Resolvemos a distribuição intracelular e a mobilidade de análogos de ácidos graxos e lipídios neutros com resolução de ~30 nm (fórmula teórica de Thompson) em células vivas de leveduras em condições alimentadas e jejuadas. Também descobrimos que ~40% dos estados BODIPY DII permanecem por dois ou mais quadros de aquisição de dados a 20 Hz, permitindo que o rastreamento de molécula única quantifique sua mobilidade em condições diferentes. Nossos resultados mostram a localização diferencial e mobilidade das BODIPY-FAs no jejum e sugerem um mecanismo de proteção contra a lipotoxicidade. Nossa capacidade de rastrear moléculas bodipy únicas e resolver o tamanho de LDs e puncta BODIPY-FA abaixo do limite de difração óptica sob diferentes estados metabólicos só é possível com a capacidade de SMLM desenvolvida de conjugados BODIPY convencionais. Os mecanismos moleculares exatos e caminhos envolvidos na regulação espacial da distribuição e absorção de ácidos graxos são objeto de nossos estudos futuros. Além disso, estendemos a capacidade SMLM de conjugados BODIPY convencionais para células mamíferas vivas, resolvendo BODIPY-FAs e lysosomes em células U2OS.
O uso de estados DII de conjugados BODIPY convencionais para SMLM tem vantagens sobre outras sondas, uma vez que centenas de diferentes variantes BODIPY estão disponíveis comercialmente que rotulam moléculas específicas ou compartimentos celulares em células vivas. A preparação da amostra é tão fácil quanto adicionar o corante em concentrações baixas (~100 nM) antes de imagem sem qualquer lavagem. Em contraste com outras sondas PALM/STORM que branqueiam ao longo do tempo, os monômeros BODIPY não são afetados pela excitação de seus estados DII e, portanto, fornecem uma fonte quase nunca esgotada para sinais de molécula única em imagens de longo prazo. Uma vez que os estados DII surgem devido a encontros bime moleculares espontâneos, o SMLM usando estados DII não requer nenhum buffer adicionado externamente para induzir o piscar23. Da mesma forma, não há necessidade de ativação fotográfica de alta energia, conforme necessário para as versões BODIPY recém-sintetizadas fotoativas24 ou SMLM de alguns corantes BODIPY convencionais21, o que pode ser prejudicial para a saúde celular durante a imagem de longo prazo25,26. Além disso, o SMLM com os estados DII cria uma supressão de fundo inerente de sondas não especificamente interagindo devido à dependência quadrática dos estados DII na concentração de monômeros. Portanto, um contraste maior é obtido em imagens SMLM em comparação com sondas tradicionais cujo sinal monomérico é detectado.
BodipYs exibem uma fluorescência anti-Stokes fraca que permite a excitação de monômeros e dimers com um único laser em alta potência de excitação. Por um lado, esta propriedade pode ser explorada para fluorescência convencional simultânea e imagens SMLM para rastrear e resolver estruturas móveis. Por outro lado, torna mais difícil combinar estados BODIPY DII com outros testes para imagens multicoloridos, pois o sinal BODIPY ocupa dois canais de emissão. No entanto, imagens multicoloridos são possíveis quando as sondas são cuidadosamente escolhidas como mostrado na Figura 2B com Sec63-GFP e vermelho BODIPY-C12. Da mesma forma, o SMLM de duas cores sequencial é possível com outros testes foto-ativaveis como mEos2, como mostrado na Figura 2C. Outras combinações possíveis para SMLM de duas cores incluem o uso de conjugados BODIPY verdes e um corante de 640 nm excitável, como JF646 ligado à tag halo27.
Em resumo, apresentamos um protocolo otimizado para OMTM usando corantes BODIPY convencionais para investigar a distribuição espástica-temporal de ácidos graxos, lipídios neutros e lisosomos na escala de comprimento nanoscópico em leveduras vivas e células mamíferas. Com pequenas modificações, este protocolo pode ser igualmente aplicável para SMLM com centenas de outros conjugados BODIPY em diferentes tipos de células.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número R21GM127965.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror |
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