Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking
Summary
Herkömmliche BODIPY-Konjugate können für die livezellige Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) durch Ausnutzung ihrer vorübergehend bildenden, rot verschiebeten Bodenzustandsdimer eingesetzt werden. Wir präsentieren ein optimiertes SMLM-Protokoll zur Verfolgung und Auflösung subzellulärer neutraler Lipide und Fettsäuren in lebenden Säugetier- und Hefezellen auf der nanoskopischen Längenskala.
Abstract
Die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM)-Techniken überwinden die optische Beugungsgrenze der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie und können intrazelluläre Strukturen und die Dynamik von Biomolekülen mit einer Genauigkeit von 20 nm auflösen. Eine Voraussetzung für SMLM sind Fluorophore, die von einem dunklen in einen fluoreszierenden Zustand übergehen, um eine räumlich-zeitliche Überlappung ihrer Punktausbreitungsfunktionen in jedem der Tausenden von Datenerfassungsrahmen zu vermeiden. BODIPYs sind etablierte Farbstoffe mit zahlreichen Konjugaten, die in der konventionellen Mikroskopie verwendet werden. Die transiente Bildung rot verschiebtiger BODIPY-Boden-Dimere (DII) führt zu einer hellen Einzelmolekülemission, die eine Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) ermöglicht. Hier präsentieren wir ein einfaches, aber vielseitiges Protokoll für SMLM mit konventionellen BODIPY-Konjugaten in lebenden Hefe- und Säugetierzellen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um hochauflösende Bilder zu erfassenII und einzelne BODIPY-D II-Zustände zu verfolgen, um räumlich-zeitliche Informationen von BODIPY-Konjugaten zu extrahieren. Wir wenden dieses Verfahren an, um Lipidtröpfchen (LDs), Fettsäuren und Lysosomen in lebenden Hefe- und Säugetierzellen auf der nanoskopischen Längenskala aufzulösen. Darüber hinaus demonstrieren wir die mehrfarbige Bildgebungsfähigkeit mit BODIPY-Farbstoffen in Verbindung mit anderen fluoreszierenden Sonden. Unsere repräsentativen Ergebnisse zeigen die differenzierte räumliche Verteilung und Mobilität von BODIPY-Fettsäuren und neutralen Lipiden in Hefe unter gefütterten und gefasteten Bedingungen. Dieses optimierte Protokoll für SMLM kann mit Hunderten von kommerziell erhältlichen BODIPY-Konjugaten verwendet werden und ist eine nützliche Ressource, um biologische Prozesse im Nanomaßstab weit über die Anwendungen dieser Arbeit hinaus zu untersuchen.
Introduction
Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) Techniken wie stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) haben sich als Methoden zur Erzeugung von hochauflösenden Bildern mit Informationen jenseits der optischen Beugungsgrenze1,2 und zur Verfolgung der Dynamik einzelner Biomoleküle3,4herauskristallisiert. Eine der Anforderungen für Sonden, die mit SMLM kompatibel sind, ist die Fähigkeit, die Anzahl der aktiven Fluorophore jederzeit zu kontrollieren, um räumliche Überschneidungen ihrer Punktstreufunktionen (PSF) zu vermeiden. In jedem der Tausenden von Datenerfassungsrahmen wird dann die Position der einzelnen fluoreszierenden Fluorophore mit einer Genauigkeit von 20 nm bestimmt, indem die entsprechende Punktstreufunktion angebracht wird. Traditionell wurde das On-Off-Blinken von Fluorophoren durch stochastisches Photoswitching1,2,5 oder chemisch induziertes intrinsisches Blinken6gesteuert. Weitere Ansätze sind die induzierte Aktivierung von Fluorogenen bei vorübergehender Bindung an ein fluorogen-aktivierendes Protein7,8 und die programmierbare bindungsfreie Bindung von markierten DNA-Oligomeren in der gesamten inneren Reflexionsfluoreszenz (TIRF) oder Lichtblattanregung9. Kürzlich berichteten wir über eine neuartige und vielseitige Etikettierungsstrategie für SMLM10, in der zuvor gemeldete rot verschiebte Dimer (DII) Zustände herkömmlicher Bor-Di-Pyromethan (BODIPY)-Konjugate11,12,13 vorübergehend bilden und speziell angeregt und mit rot verschobenen Wellenlängen erkannt werden.
BODIPYs sind weit verbreitete Farbstoffe mit Hunderten von Varianten, die speziell subzelluläre Kompartimente und Biomoleküle14,15,16kennzeichnen. Aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit und Anwendbarkeit in lebenden Zellen sind BODIPY-Varianten für die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie im Handel erhältlich. Hier beschreiben wir ein detailliertes und optimiertes Protokoll, wie die Hunderte von kommerziell erhältlichen BODIPY-Konjugaten für Live-Cell-SMLM verwendet werden können. Durch die Optimierung der Konzentration von BODIPY-Monomeren und die Optimierung der Anregungslaserkräfte, Bildgebungs- und Datenanalyseparameter werden hochwertige hochauflösende Bilder und Einzelmolekül-Tracking-Daten in lebenden Zellen gewonnen. Bei geringer Konzentration (25-100 nM) können BODIPY-Konjugate gleichzeitig für SMLM im rot verschiebten Kanal und für die korrelative konventionelle Fluoreszenzmikroskopie im konventionellen Emissionskanal eingesetzt werden. Die erhaltenen Einzelmoleküldaten können analysiert werden, um die räumliche Organisation unbeweglicher Strukturen zu quantifizieren und die diffusiven Zustände von Molekülen in lebenden Zellen zu extrahieren17. Die Verfügbarkeit von BODIPY-Sonden in grüner und roter Form ermöglicht eine mehrfarbige Bildgebung, wenn sie in der richtigen Kombination mit anderen kompatiblen Fluorophoren verwendet wird.
In diesem Bericht bieten wir ein optimiertes Protokoll zum Erfassen und Analysieren von Live-Zell-SMLM-Daten mit BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rot und Lysotracker-Grün in mehreren Farben. Wir lösen Fettsäuren und neutrale Lipide in lebenden Hefe- und Säugetierzellen mit einer Auflösung von 30 nm. Wir zeigen weiter, dass Hefezellen die räumliche Verteilung von extern zugesetzten Fettsäuren in Abhängigkeit von ihrem Stoffwechselzustand regulieren. Wir stellen fest, dass zugesetzte BODIPY-Fettsäuren (FA) das endoplasmatische Retikulum (ER) und Lipidtröpfchen (LDs) unter gefütterten Bedingungen lokalisieren, während BODIPY-FAs beim Fasten nicht-LD-Cluster in der Plasmamembran bilden. Wir erweitern die Anwendung dieser Technik auf Bildlysosomen und LDs in lebenden Säugetierzellen. Unser optimiertes Protokoll für SMLM mit herkömmlichen BODIPY-Konjugaten kann eine nützliche Ressource sein, um biologische Prozesse im Nanomaßstab mit den unzähligen verfügbaren BODIPY-Konjugaten zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll haben wir gezeigt, wie herkömmliche BODIPY-Konjugate verwendet werden können, um SMLM-Bilder mit einer Größenordnungsverbesserung in der räumlichen Auflösung zu erhalten. Diese Methode basiert auf der Ausnutzung zuvorII gemeldeter, rot verschieber D-II-Zustände herkömmlicher BODIPY-Farbstoffe, die sich vorübergehend durch bimolekulare Begegnungen bilden. Diese Zustände können speziell angeregt und mit rot verschobenen Wellenlängen erkannt werden und sind spärlich und kurzlebig …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Vergabenummer R21GM127965 unterstützt.
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
References
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