Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

קונבנציונלי BODIPY מעלה שערים עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה ומעקב יחיד מולקולה

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/60950
Automatic Translation
1, *1, *1,2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College
* These authors contributed equally

Summary

שערי מעלה קונבנציונאלי BODIPY ניתן להשתמש עבור מיקרוסקופ לוקליזציה של תא לחיות בודד (SMLM) באמצעות ניצול של היווצרות הארעיות שלהם, אדום העביר המדינה הקרקע. אנו מציגים פרוטוקול SMLM אופטימיזציה כדי לעקוב ולפתור ליפידים ניטרליים שומנים וחומצות שומן בתאי היונקים החיים בקנה מידה nanoscopic באורך.

Abstract

מיקרוסקופ יחיד לוקליזציה של מולקולות (SMLM) טכניקות להתגבר על מגבלת עקיפה אופטית של מיקרוסקופ הזריחה המקובלת והוא יכול לפתור מבנים תאיים ואת הדינמיקה של biomolecules עם ~ 20 דיוק ננומטר. תנאי מוקדם עבור SMLM הם fluorophores כי מעבר מחושך למצב פלורסנט כדי למנוע חפיפה בזמן הזמני של פונקציות התפשטות הנקודה שלהם בכל אחד מאלפי מסגרות רכישת נתונים. BODIPYs הם צבעים מבוססים היטב עם שערים רבים המשמשים במיקרוסקופיה קונבנציונאלי. היווצרות ארעי של אדום העביר BODIPY הקרקע מדינה דימרס (DII) תוצאות פליטת מולקולה אחת בהירה המאפשר מיקרוסקופ יחיד לוקליזציה מיקרוסקופית (smlm). כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט אבל תכליתי עבור SMLM עם שערי מעלה קונבנציונאלי BODIPY בתוך שמרים חיים ותאי יונקים. הליך זה ניתן להשתמש כדי לרכוש תמונות ברזולוציה סופר ולעקוב אחר BODIPY-DII מדינות כדי לחלץ מידע הזמני של העיר bodipy מעלה. אנו להחיל את ההליך הזה כדי לפתור טיפות שומנים (המוני), חומצות שומן, ו-lysosomes החיים שמרים ותאי מיונקים בסולם אורך nanoscopic. יתר על כן, אנו מדגימים את יכולת הדמיה רב צבעי עם צבעים BODIPY כאשר נעשה שימוש בשילוב עם בבדיקות פלורסנט אחרים. תוצאות הנציג שלנו להראות את ההפצה המרחבית מרחבית וניידות של חומצות BODIPY שומן ושומנים ניטרליים בשמרים מתחת לתנאים ומוזנים. פרוטוקול ממוטב זה עבור SMLM ניתן להשתמש עם מאות שערים BODIPY זמין מסחרית והוא משאב שימושי כדי ללמוד תהליכים ביולוגיים בקנה המידה הרבה מעבר ליישומים של עבודה זו.

Introduction

מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה אחת (smlm) טכניקות כגון מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סערה) ומיקרוסקופ צילום מופעל-תמונה (PALM) התפתחה כשיטות ליצירת תמונות ברזולוציה גבוהה עם מידע מעבר למגבלת העקיפה האופטית של אבה1,2 ועבור מעקב אחר הדינמיקה של יחיד biomolecules3,4. אחת הדרישות עבור הבדיקות תואם SMLM היא היכולת לשלוט על מספר fluorophores פעיל בכל עת כדי למנוע חפיפה מרחבית של פונקציות התפשטות הנקודה שלהם (PSF). בכל אחד מאלפי מסגרות רכישת נתונים, המיקום של כל fluorophores פלורסנט נקבע אז עם ~ 20 הדיוק ננומטר על ידי התאמת הפונקציה המקבילה שלה התפשטות נקודה. באופן מסורתי, מהבהב על-off של fluorophores נשלטת באמצעות מיתוג סטוכסטי החלפת1,2,5 או כימית המושרה מהבהב6. גישות אחרות כוללות את ההפעלה המושרה של fluorogens על כריכה ארעית לחלבון fluorogen מפעיל7,8 ואת הכריכה ניתנת לתיכנות-unbinding של התוויות DNA oligomers בתוך השתקפות פנימית הכולל השתקפויות (tirf) או האור בגיליון עירור9. לאחרונה, דיווחו על אסטרטגיה הרומן תיוג רב-תכליתי עבור smlm10 שבו דיווחו בעבר אדום העביר dimeric (DII) מדינות של בורון קונבנציונאלי di-pyromethane (bodipy) מעלה מעלה11,12,13 הם באופן היווצרות ולהיות נרגש במיוחד מזוהה עם אדום העביר אורכי גל.

Bodipys הם בשימוש נרחב צבעים עם מאות משתנים כי במיוחד תווית sub-סלולריים תאים ו biomolecules14,15,16. בשל קלות השימוש שלהם והישימות בתאי החיים, משתני BODIPY הם מסחרית זמין עבור מיקרוסקופ זריחה קונבנציונאלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט וממוטב על איך מאות שערי הבודיפיה הזמינים מסחרית ניתן להשתמש עבור התאים החיים-SMLM. על ידי כוונון הריכוז של bodipy ונומרים ועל ידי אופטימיזציה של כוחות לייזר עירור, הדמיה וניתוח נתונים פרמטרים, איכות גבוהה סופר ברזולוציה תמונות מולקולה יחידה מעקב נתונים מושגת בתאי החיים. כאשר נעשה שימוש בריכוז נמוך (25-100 nM), שערי הבודיפיה יכולים לשמש בו ל-SMLM בערוץ האדום-הוזז ולצורך הקורסקופיה של מיקרוסקופ הקרינה הקונבנציונאלית בערוץ הפליטה המקובל. ניתן לנתח את נתוני המולקולה היחידה לכמת את הארגון המרחבי של מבנים מוכי תנועה ולחלץ את המצבים המפזרים של מולקולות בתאי החיים17. הזמינות של בדיקה BODIPY הן ירוק והן צורות אדומות מאפשר הדמיה מרובת צבעים כאשר נעשה שימוש בשילוב הנכון עם fluorophores תואמים אחרים.

בדוח זה, אנו מספקים פרוטוקול ממוטב לרכישת וניתוח של נתוני SMLM החיים באמצעות BODIPY-C12, bodipy (493/503), Bodipy-c12 אדום ו lysotracker-ירוק בצבעים מרובים. אנו פותרים חומצות שומן ושומנים ניטרליים בתוך שמרים ותאי יונקים חיים עם ~ 30 החלטה ננומטר. אנו עוד להדגים כי תאים שמרים לווסת את התפלגות מרחבית של חומצות שומן חיצוני מוסף בהתאם למצב חילוף החומרים שלהם. אנו מוצאים כי הוסיף חומצות שומן BODIPY (הפא) הוקליזציה לרשת האנדופלזמית (ER) ו טיפות השומנים (המזיהוי) תחת תנאי ההזנה ואילו האשכולות BODIPY-בצורה לא LD בקרום פלזמה על צום. אנו מרחיבים עוד יותר את היישום של טכניקה זו לליזומים ולתעודות זהות בתאי יונקים חיים. הפרוטוקול הממוטב שלנו ל-SMLM באמצעות שערי מעלה קונבנציונאלי בBODIPY יכול להיות משאב שימושי כדי ללמוד תהליכים ביולוגיים בסולם הננו עם מספר רב של בעלי הבניינים הזמינים BODIPY.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: עבור שיבוט שמרים ותיוג אנדוגני נא לעיין בפרסום האחרון שלנו10.

1. הכנת דגימות תאים שמרים להדמיה

  1. להכין תרבות לילה נוזלי של זן w303 שמרים. באמצעות מקל עץ סטרילי, ספוט כמות קטנה של תאים שמרים מצלחת אגר המכיל תמצית שמרים – peptone – דקסטרוז לתוך צינור תרבות עם ~ 2 מ ל של דקסטרוז סינתטי להשלים (SCD) בינונית. מודיית את הצינור לילה בחממה רועדת ב 270 סל ד ו 30 ° c.
  2. לבצע דילול בוקר 1:50 של התאים SCD. המשך התרבות תאים מדולל עבור 4 h ב 30 ° c בחממה 270 סל"ד לרעוד, המאפשר לתאים לצמוח בשלב מעריכי ולהגיע צפיפות אופטית (OD) של ~ 0.6.
    הערה: ההליך יכול להשתנות כאן בהתאם למצב חילוף החומרים שנלמד. שערי הבודיפיה אינם דורשים תאים בשלב הגידול האקספוננציאלי. עם זאת, להיות מכיר של פלואורסצנטית אוטומטי מתאים מתים במהלך השלב הנייח, כפי שהוא יכול לגרום לאות הרקע חזק מדי כדי לנתח בודד BODIPY-DII פולטים.
  3. ללימוד תאים צום, לגדל את התרבות שמרים עבור 2 ימים ללא חילופי מדיה.
  4. בתוך ~ 30 דקות לפני ציפוי התאים, מארג שמיכות עם ה80 μL של 0.8 mg/mL סטרילי Concanavalin A (קונה) ב-H מיונן2O בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, לשטוף את שמיכות שלוש פעמים עם מונו H2O.
  5. ב ~ 30 דקות לפני הדמיה, פיפטה את התאים על הזכוכית שמיכות, עם הנפח הנכון של SCD טריים כדי להשיג צפיפות אופטית של ~ 0.12 (בדרך כלל 60 μL תרבות שמרים ב OD ~ 0.6 ב 240 μL SCD). תנו לתאים להתיישב ולדבוק במשטח הקונה במשך 30 דקות.
  6. הוסף את המשלים BODIPY הרצוי ישירות לתוך שמיכות השינה בריכוז הסופי של ~ 100 nM.
    הערה: ניסוי מיטוב הריכוז BODIPY עשוי להידרש בהתאם לצפיפות המקומית Bodipy בתא הסלולר מסוים.

2. הכנת תאי מיונקים לדימות SMLM

  1. שמור על תאים U2OS היונקים ב-DMEM שאינו פלורסנט עם 10% סרום בפרה העוברי, 4 מ"מ גלוטמין, 1 mM נתרן פירובט ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין אנטיביוטיקה בבקבוקון T25.
    הערה: תאים יכולים גם להישמר ב-DMEM עם הסרום העוברי של 10% ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין אנטיביוטיקה, עם זאת, את המדיום צריך להיות מוחלף לפני הדמיה עם פתרון לא אוטומטי פלורסנט.
  2. פצל את התאים ב 70-80% שליטה 1:5 בבאר אחת של 8-היטב צלחת. תרבות התאים בצלחת 8-הבאר עבור 12 עד 24 שעות לפני הדמיה.
  3. הוסף BODIPY-C12, lysotracker גרין או כל המשלים bodipy אחרים בריכוז הסופי של 100 nM (פתרונות המניה diמתיל סולפוקסיד [dmso]) 10 דקות לפני הדמיה. הפעם יכול להשתנות בהתאם לניסוי הרצוי.
    הערה: ניתן לבצע הדמיה בטמפרטורת הסביבה (23 ° c) באמצעות פתרון הדמיה של תאים חיים. עם זאת, הדמיה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עם dmem לא פלורסנט מעורבב עם 10% סרום העובר העוברי, 4 מ"מ גלוטמין, 1 mm נתרן פירובט ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין אנטיביוטיקה מעדיפים לשמור על התאים קרוב יותר לתנאים פיסיולוגיים לעשות מסקנות ביולוגיות.

3. הכנת ציוד

  1. טעינת ערכות הסינון המתאימות בנתיב הפליטה בהתבסס על צבע הפליטה של BODIPY הנמצא בשימוש.
    הערה: שיקוף דיקרואיק ליבות (zt/405/488/561/640rdc) מפריד תחילה את העירור מאור הפליטה. הפליטה הירוקה (525 ננומטר) והפליטה האדומה (595 nm) מפוצלת לאחר מכן באמצעות מפצל דיקרואיק ארוך-מעבר (T562lpxr) ואחריו מסנני פס-פאס ET525/50 בערוץ הירוק ו-ET 595/50 בערוץ האדום. שני הערוצים מוקרן לאחר מכן לאזורים שונים של אותו שבב מצלמה. באופן דומה, הפליטה האדומה (595 nm) והפליטה הרחוקה-אדומה מפוצלת לראשונה על-ידי מפצל קורה ארוך-מעבר (FF652-Di01) ואחריו מסנני פס-פאס ET 610/75 באדום FF731/137 בערוץ האדום המרוחק.
  2. הפעל את המיקרוסקופ, בשלב המיקרוסקופ, לייזרים (488 nm, 561 nm) ומצלמה. כאן מיקרוסקופ הפוך עם מערכת המיקוד המושלם מצלמה EMCCD מקורר-68 ° c משמשים.
  3. הוסיפו טיפת שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ.
  4. פתח את תוכנת Hal4000 (ראה את טבלת החומרים) השולטת באור LED לדימות שדה בהיר, כוחות לייזר, תריסי לייזר והגדרות מצלמה לדימות. הגדר את הרווח של EMCCD ל-30 ואת טמפרטורת המצלמה ל-68 ° c. הכן את המצלמה והתוכנה המתאימה להקלטת סרטים ב-20 Hz.
    הערה: טכניקה זו חלה על כל מיקרוסקופ שדה רחב המסוגל ליצירת תמונות מיקרוסקופית לוקליזציה (PALM) ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (סטורם). התוכנה המתאימה עשויה להשתנות.
  5. הפעל את התנור בשלב המיקרוסקופ והגדר אותו לטמפרטורה של 37 ° c ולרמה2 של שיתוף של 5%. כוונן את צווארון התיקון האובייקטיבי בהתאם.
  6. הר את המדגם על הבמה המיקרוסקופ ולהתמקד עד מערכת המיקוד עוסקת. הזז את השלב באמצעות בקר הבמה עד שתאים בריאים יופיעו בשדה התצוגה.
    הערה: עבור דימות עם תאים שמרים בטמפרטורת החדר, אין צורך להפעיל את המזגן או CO2 שליטה.
  7. הפעל את לייזרים המתאימים עירור של ונומרים, כמו גם דימרס. עבור bodipy ירוק או lysotracker ירוק, אנו משתמשים 561 ננומטר לייזר כדי לרגש DII מדינות עבור smlm ו 488 לייזר ננומטר לרגש ונומרים עבור זריחה קונבנציונאלי.
    הערה: עבור האדום bodipy, להשתמש בלייזר 640 ננומטר לרגש DII מדינות עבור smlm ו 561 לייזר nm כדי להלהיב את ונומרים עבור זריחה קונבנציונאלי. עבור באדום BODIPY, להתאים את 561 ננומטר ו 640 כוחות לייזר ננומטר לדמיין את הזריחה בתפזורת בערוץ אדום ומולקולה אחת מתפרצת בערוץ הרחוק-אדום. הכוח אופייני 561 ננומטר הוא ~ 0.06 W/cm2 ו ~ 5 קילוואט/cm2 עבור 640 nm. עבור BODIPY ירוק, מצפה גם לראות את הזריחה המקובלת בערוץ פליטת ירוק תחת הריגוש nm 561. עבור BODIPY אדום, מצפה לראות את הזריחה המקובלת בערוץ האדום תחת 640 הריגוש ננומטר. אות זה נובע מפליטת אנטי סטוקס, אשר הופך להיות שימושי עבור מונומר/dimer תמונות לוקליזציה עם עירור לייזר רציפה.

4. רכישת נתונים

  1. טען רצפים תריס לייזר עבור עירור של ונומרים, כמו גם דימרס.
    הערה: אנחנו בדרך כלל משתמשים תשעה מולקולה בודדת עירור מסגרות ב 561 ננומטר ואחריו אחד מסגרת עירור קונבנציונאלי ב 488 nm. זה מציע אות בהיר קונבנציונאלי הרגיל ונמנע דולף של עוד 488 ננומטר להתרגש fluorophore כגון חלבון פלורסנט ירוק (GFP) לתוך הערוץ האדום לזיהוי מולקולה בודדת ביישומי דימות מרובי צבעים. לחילופין, הפעל את הלייזר 561 ננומטר ברציפות ולהסתמך על פליטת אנטי סטוקס עבור תמונות קונבנציונליות בערוץ אורך הגל הקצר.
  2. כוונן את כוחות הלייזר כגון מולקולה אחת התפרצויות פלואורסצנטית מזוהים בערוץ פליטת אדום העביר תחת 561 ננומטר, ו זריחה קונבנציונאלי מופיע בערוץ פליטה ירוק עם 488 הריגוש ננומטר. אופייני לייזר כוחות לייזר ננומטר 561 יהיה סביב 0.8-1 kW/cm2 עבור smlm, ו-0.035-0.07 W/cm2 עבור 488 לייזר nm במצב הדמיה של הקרינה המקובלת.
  3. בחר תיקיית יעד עבור סרטים ולהקליט מסגרות רכישה 5000-20000 כדי לאסוף מספיק לוקליזציה לשחזור תמונות ברזולוציה סופר.
  4. מעבר לשדות תצוגה שונים וחזור על השלבים שלעיל כדי לאסוף נתונים מתאים נוספים.

5. ניתוח נתונים ומעקב אחר מולקולה בודדת

  1. טען את הסרט לתוכנת ניתוח SMLM.
    הערה: ניתן להשתמש בכל תוכנה18 . אנו משתמשים בתובנה (ראה את הטבלה של חומרים) ולאמת את התוצאות באמצעות סופת רעמים19 תוסף עבור imagej (פיג'י).
  2. הדפס באופן חזותי את הסרט והתאם את הגדרות הניגודיות כך שניתן יהיה לראות את הבהוב המולקולה החד. אם יש צורך להגביל את האזור או את טווח המסגרות עבור ניתוח נתונים של SMLM אם חלקים של המדגם ממשיכים לנוע באופן רציף.
  3. קביעת פרמטרי זיהוי של מולקולה יחידה עבור התאמה עם PSFs בעלי 2D (ROI: 7 x 7 פיקסלים עם גודל פיקסל 160 ננומטר, רוחב 260-650 ננומטר, גובה > 50 פוטונים). מסך חזותי באמצעות כמה מסגרות לדוגמה כדי לבדוק את פרמטרי הזיהוי וכיצד לזהות באופן מהימן את ההתפרצויות הנפרדות של המולקולה היחידה (ראה איור 1C).
    הערה: פרמטרי זיהוי מסוימים, כגון גובה ורוחב, יכולים להיות מותאמים מעט כדי למטב את ההכרה באותות שנתפסים באופן חזותי של מולקולה בודדת.
  4. בצע ניתוח תמונה של SMLM עם פרמטרי הזיהוי הממוטב ולאחר מכן הפוך כל מולקולה בודדת בתור גאוס-מימדית שרוחבה משוקלל על-ידי השורש הריבועי ההופכי של מספר הפוטונים שאותר.
  5. להעריך את איכות הנתונים. השתמש בטווחי מסגרות מוגבלים כדי להתבונן בהפצות של מולקולה בודדת במקרים מסוימים יותר בזמן. זה יכול להסביר תנועה ארגונית במהלך רכישת נתונים.
  6. כדי לנתח עוד יותר את הפיזור המרחבי והדינמיקה של הפצות המולקולה, לייצא את רשימת המולקולה המתקבלת המכילה את נקודות הציון, מסגרות המראה, הפוטונים, הרוחב והגבהים של הלוגטים. יבא את רשימת המולקולה בהליכי ניתוח כתובים מותאמים אישית.
  7. לקבלת מידע מרחבי של התפלגות המולקולה היחידה, חשב את פונקציית ההתפלגות הרדיאלי ρ (r), המייצגת את צפיפות הלוקליזציה כפונקציה של המרחק הרדיאלי20. כדי להשיג ρ (r), לחשב מרחקים ייחודיים זוג חכם של כל לוקליזציה, לבנות את ההיסטוגרמה עם סלים במרכז ri עם גובה H (ri) ועם רוחב dr וחילוק על ידי 2πri* ד ר; (ρ (ri) = H (רא)/π (רא+ ד ר)2-ri2). לאחר מכן ניתן להשתמש בפונקציית ההתפלגות הרדיאלי כדי לכמת ולהשוות את מידת האשכולות, כמו גם את הגודל האופייני של אשכולות.
  8. לקבלת מידע דינמי אודות הדיפוזיה של מולקולות, קישור לוקליזציה המופיעים לדוגמה בתוך 3 פיקסלים (0.48 μm) במסגרות של רכישת נתונים רצופים כדי ליצור עקבות של מולקולה אחת.
    הערה: המרחק המקשר יהיה תלוי בדיפוזיה של מולקולות ובצפיפות של לוקליזציה. ניתן להעריך את מרחק הקישור המרבי על-ידי ניתוח צפיפות הלוקליזציה של כל מסגרת21,22. הצפיפות הממוצעת היתה נחושה להיות 0.043 לוקליזציה לכל יקרומטר2; כך רדיוס 0.48 יקרומטר היה בתוך צפיפות נמוכה מספיק כדי להבטיח כי מולקולות שונות לא קושרו יחד.
  9. ממוצע הdisplacements עבור זמני השהיה שונים Δt ממספר רב של עקבות הנמשכים לפחות שלוש פעמים השהיה כדי ליצור ממוצע בריבוע (MSD) לעומת העלילה Δt. התאם את העקומה MSD vs. Δt עם המשוואה MSD = 4DΔt + σ2 כדי לחשב את מקדם הדיפוזיה הממוצע D3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, אנו מציגים הכנה לדוגמה ממוטבת, הליך רכישת נתונים וניתוח של SMLM באמצעות שערי מעלה BODIPY מבוסס על הפרוטוקול לעיל (איור 1A). כדי להדגים דוגמה של זרימת העבודה לצורך רכישה וניתוח של נתוני SMLM, אנו מעסיקים את הפונקציה BODIPY (493/503) בשמרים כדי לפתור את הסמל מתחת למגבלת העקיפה האופטית (איור 1B-F). דוגמאות של מצבי הדמיה מרובת צבעים שונים של BODIPY בשילוב עם בדים אחרים כגון GFP, mEos2 מוצגים באיור 2. אנו מניפולציה את מצב חילוף החומרים שמרים על ידי גידול אותם באותו בינוני עבור ~ 48 h ולהראות כי BODIPY-C12 טפסים שאינם LD אשכולות בפריפריה התא על הצום בניגוד התאגדות שלהם לתוך מתחת התנאים הפד (איור 3). כדי להאריך עוד יותר את היכולת SMLM של מצוכי מעלה BODIPY לתאי היונקים, אנחנו התמונה BODIPY-C12 ו LysoTracker-גרין בתאי U2OS לחיות (איור 4).

Figure 1
איור 1: אופטימיזציה של רכישת נתונים smlm וניתוח באמצעות צבעים bodipy. (א) זרימת עבודה עבור אופטימיזציה של מולקולה אחת אותות זריחה לאחר עיבוד של נתוני smlm מתוך שערי מעלה bodipy. (ב) התמונה הובילה (משמאל), תמונה פלואורסצנטית קונבנציונאלי (באמצע, עירור: 488 nm, פליטה: 525 nm) והתמונה Anti-סטוקס (נכון, עירור: 561 nm, פליטה: 525 nm) של תאים שמרים מוכתם עם סמן זיהוי BODIPY (493/503). (ג) מסגרות smlm בודדות המציגות דאף זמרת DII פולטים (עירור: 561 nm, פליטה: 595 nm) בצפיפות נמוכה מדי (שמאל), צפיפות אופטימלית (אמצעית) וצפיפות גבוהה מדי (מימין). (ד) אופטימיזציה של פרמטרים של ניתוח smlm. עם הסף גבוה מדי מספר פוטון, התוכנה מחמיץ אותות מולקולה בודדת בודד (משמאל), מזהה את כל המולקולות עם סף פוטון מיטבי (באמצע) ומזהה לוקליזציה שווא עם ספי פוטון נמוך מדי (מימין). (ה) smlm תמונה של BODIPY (493/503) פותר את הגודל של המילד (שמאל, זום) עם קוטר ממוצע של 125 ננומטר. (ו) מעקב מולקולה אחת חושף דיפוזיה מוגבלת של BODIPY (493/503) בתוך האתר (משמאל). רשמים משמשים לחישוב עקומת הזמן של MSD לעומת השעון, המוצגים על התנהגות משנית בתוך ' מימין '. סרגל בקנה מידה = 1 μm, זום = 100 nm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה של smlm מרובה צבעים באמצעות שערי מעלה bodipy בתאי החיים. (א) דמות קונבנציונלית של Bodipy-C12 תחת 488 ננומטר הריגוש (משמאל). תמונה SMLM המקביל באמצעות מדינות DII של BODIPY-C12 תחת 561 nm (באמצע) ו זום (מימין) חושף Bodipy-C12 ב המתעוררים ההתגלות. (ב) תמונת הזריחה המקובלת של ER המסומנים Sec63-gfp תחת 488 העירור ננומטר (משמאל). במקביל הקליט תמונת הזריחה המקובלת של BODIPY-C12 אדום עם 561 ננומטר עירור (באמצע) ו SMLM התמונה באמצעות 640 העירור ננומטר (מימין). (ג) הדמיה בעלת שני צבעים מSec63-mEos2 ו-BODIPY-C12 ירוק DII מדינות. ראשון, mEos2 הוא התמונה עם גבוהה 405 ננומטר צילום הפעלה ו561 הריגוש nm (שמאל) ואחריו רכישת נתונים ארוכים ללא 405 ננומטר הפעלה (באמצע). סרגל קנה מידה = 1 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הפצת חומצת שומן דיפרנציאלית על צום בתאי שמרים. (א) סכמטי המתאר מצבים מטבולית שונים (מצב מוזן ומצב) מבוסס על משך הגידול במדיום scd. ב) תמונות פלואורסצנטית קונבנציונליות (למעלה) להראות כי BODIPY-C12 אדום שיתוף לוקליזציה עם BODIPY (493/503) תחת תנאים הניזון המציין התאגדות לתוך האתר. התמונה SMLM (נמוך יותר, שמאל) מראה צפוף BODIPY-C12 דקדטה ב ה ו עקבות מולקולה אחת (נמוך, ימין) התערוכה דיפוזיה לאורך הקרומים הסלולריים. (ג) בתנאי מחלה, בודיפיה-C12 טפסים בפריפריה של התא שאינם משותפים לוקליזציה עם המספר הגבוה: שמאל, האמצע, השמאל התחתון). תמונת SMLM פותרת את הדקדפות והסימנים הסגורים של BODIPY-C12 אדום (נמוך, ימין). (ד) פונקציית ההתפלגות הרדיאלי (משמאל) מראה באשכולות גבוהים יותר של BODIPY-בצום. העקירה ממוצע מרובע לעומת מגרש זמן של מעקב אחד מולקולה (מימין) מאשר השתק של BODIPY-C12 על צום. סרגל קנה מידה = 1 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הדמיה של צבעי bodipy בתאי U2OS מיונקים חיים. (A) התמונה המקובלת הפלואורסצנטית (משמאל) של BODIPY-C12 ב 488 ננומטר הריגוש. התמונה המתאימה SMLM באמצעות DII מדינות (מימין) ב 561 ננומטר מראה את התפלגות nanoscopic של Dii מדינות בתא U2OS. ניסות להראות מגניציות של טיפות השומנים (סרגל קנה מידה = 500 nm). (ב) הדמות המקובלת של lysosomes בתאי U2OS באמצעות Lysosomes ירוק ב 488 ננומטר עירור (משמאל). התמונה המתאימה SMLM של ליסוזומים משותק (מימין, סרגל בקנה מידה = 5 μm) ב 561 הריגוש nm. שיבוץ: תמונת smlm של עקיפה אופטית מוגבלת ליזוזום (סרגל בקנה מידה 100 ננומטר). התמונות של BODIPY-C12 נרשמו בפתרון הדמיה של תא חי ב -23 ° c. התמונות של lysosomes באמצעות הירוק Lysosomes נרשמו ב-DMEM לא פלורסנט עם 10% סרום העובר העוברי, 4 מ"מ גלוטמין, 1 mM נתרן פירובט ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין אנטיביוטיקה ב 37 ° c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה, הדגמנו כיצד שערי מצוכי קונבנציונאלי BODIPY ניתן להשתמש כדי להשיג תמונות SMLM עם סדר גודל שיפור בהיקף ברזולוציה מרחבית. שיטה זו מבוססת על ניצול שדווחו בעבר, אדום העבירמצבים של צבע BODIPY קונבנציונאלי, אשר בצורה מעוברת דרך מפגשים דו-מולקולריים. מצבים אלה יכולים להיות נרגשים במיוחד וזוהה עם גל אדום הזזה, הם דלילים וקצרים חיים מספיק עבור SMLM. על ידי כוונון ריכוז של bodipy ונומרים יחד עם פרמטרים לייזר, צפיפות אופטימלית של לוקליזציה ואות לרעש ניתן להשיג. פתרנו את התפלגות תאיים וניידות של מקבילים חומצת שומן ושומנים ניטרליים עם ~ 30 החלטה ננומטר (הנוסחה התיאורטית של תומפסון) בתאי שמרים חיים תחת המזון והתנאים. מצאנו גם כי ~ 40% של מדינות BODIPY DII להישאר על שתי מסגרות רכישת נתונים או יותר ב 20 הרץ, מאפשר מולקולת יחיד מעקב כדי לכמת את הניידות שלהם בתנאים שונים. התוצאות שלנו מציגות את הלוקליזציה הדיפרנציאלי ואת הניידות של BODIPY-פס על צום ומציע מנגנון הגנה נגד רעילות ליפובי. היכולת שלנו לעקוב אחר מולקולות BODIPY יחיד ולפתור את הגודל של המילד ואת BODIPY-FA מתחת למגבלת העקיפה האופטית תחת מצבי חילוף החומרים השונים אפשרי רק עם יכולת SMLM המפותחת של שערי הבודיפיה קונבנציונאלי. המנגנון המולקולרי המדויק מסלולים המעורבים בוויסות המרחב של התפלגות חומצת שומן וספיגת הם הנושא של לימודים עתידיים שלנו. יתרה מזאת, הרחבנו את יכולת ה-SMLM של מצופי הבודיפיה הקונבנציונלית לתאי היונקים החיים באמצעות פתרון בודיפיה-פס וליסוזומים בתאי U2OS.

באמצעות מצבי DII של מצובי מעלה bodipy קונבנציונאלי עבור smlm יש יתרונות על בבדיקות אחרות מאז מאות משתנים bodipy שונים הם מסחרית זמין כי תווית מולקולות ספציפיות או תאים סלולריים בתאי החיים. ההכנה לדוגמה היא קלה כמו הוספת צבע נמוך (~ 100 nM) ריכוזי לפני הדמיה ללא כביסה כלשהי. בניגוד לבדיקות אחרות PALM/סטורם כי אקונומיקה לאורך זמן, bodipy ונומרים מושפעים על ידי עירור של מדינות DII שלהם ולכן לספק מקור כמעט אף פעם לא מכלה לאותות מולקולה בודדת בהדמיה לטווח ארוך. מאז Dii מדינות עולות עקב מפגשים דו-מולקולריים ספונטנית, smlm באמצעות מדינות DII לא דורש מאגר הוסיף חיצונית כדי לגרום להבהב23. באופן דומה, אין צורך באנרגיה גבוהה צילום הפעלה כנדרש עבור מסונתז לאחרונה בגרסאות bodipy לגרסה24 או smlm של כמה צבעים בודיפיה קונבנציונאלי21, אשר יכול להיות מזיק לבריאות התא במהלך לטווח ארוךהדמיה 25,26.25 יתר על כן, SMLM עם DII מדינות יוצר דיכוי רקע פנימי של בדיקות בלתי מפורשות של אינטראקציה בגלל התלות הריבועית של מדינות Dii על הריכוז המונומר. לכן, ניגודיות גבוהה יותר מושגת בתמונות SMLM בהשוואה לגששים מסורתיים שהאות monomeric שלהם מזוהה.

הבודיטים מוצג בזרם הקרינה האנטי-סטוקס קלוש המאפשר עירור של ונומרים ודימרס עם לייזר יחיד בכוח עירור גבוה. מצד אחד, מאפיין זה יכול להיות מנוצל עבור הדמיה בו SMLM המקובלת כדי לעקוב ולפתור מבנים נעים. מצד שני, זה הופך את זה קשה יותר לשלב BODIPY DII מדינות עם בדים אחרים עבור הדמיה מרובת צבעים כמו אות bodipy תופס שני ערוצי פליטה. עם זאת, הדמיה מרובת צבעים אפשרי כאשר הבדיקות נבחרו בקפידה כפי שמוצג באיור 2B עם SEC63-gfp ו BODIPY-C12 אדום. בדומה לכך, SMLM עם שני צבעים רציפים אפשרי עם בדיקה אחרת של הפעלות צילום כמו mEos2 כפי שמוצג באיור 2C. שילובים אפשריים אחרים לשני צבעים SMLM כוללים את השימוש של בעלי מצוכי ירוק BODIPY ו 640 ננומטר צבעים להתרגש כגון JF646 ההילה תג27.

לסיכום, הצגנו פרוטוקול ממוטב עבור SMLM באמצעות צבעי BODIPY קונבנציונאלי לחקור את התפלגות הרקתית הטמפורלית של חומצות שומן, ניטרלי ליפיזומים בסולם האורך nanoscopic בתוך שמרים חיים ותאי יונקים. עם שינויים קלים, פרוטוקול זה יכול להיות ישים באופן שווה עבור SMLM עם מאות בעלי מעלה BODIPY אחרים על פני סוגי תאים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס R21GM127965.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  3. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
  4. Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077 (2015).
  5. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
  6. Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
  7. Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
  8. Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
  9. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  10. Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  11. Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
  12. Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
  13. Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
  14. Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
  15. Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
  16. Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
  17. Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
  18. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
  19. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
  20. Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
  21. Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  22. Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
  23. Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
  24. Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
  25. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
  26. Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
  27. Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).

Tags

ביוכימיה סוגיה 160 מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה מעקב יחיד עם מולקולה מיקרוסקופ לוקליזציה חד-מולקולות BODIPY דימרס שמרים תאי יונקים
קונבנציונלי BODIPY מעלה שערים עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה ומעקב יחיד מולקולה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adhikari, S., Banerjee, C.,… More

Adhikari, S., Banerjee, C., Moscatelli, J., Puchner, E. M. Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking. J. Vis. Exp. (160), e60950, doi:10.3791/60950 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter