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Biochemistry

लाइव-सेल सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी और एकल-अणु ट्रैकिंग के लिए पारंपरिक बॉडीपी कंजूगेट्स

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/60950
Automatic Translation
1, *1, *1,2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College
* These authors contributed equally

Summary

पारंपरिक बॉडीपी कंजूगेट्स का उपयोग लाइव-सेल एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम) के लिए उनके क्षणिक रूप से बनाने, लाल-स्थानांतरित जमीन राज्य डिमर्स के शोषण के माध्यम से किया जा सकता है। हम नैनोस्कोपिक लंबाई पैमाने पर जीवित स्तनधारी और खमीर कोशिकाओं में उपकोशिकीय तटस्थ लिपिड और फैटी एसिड को ट्रैक और हल करने के लिए एक अनुकूलित एसएमएलएम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम) तकनीक पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की ऑप्टिकल विवर्तन सीमा को दूर करती है और इंट्रासेलर संरचनाओं और ~ 20 एनएम परिशुद्धता के साथ जैव अणुओं की गतिशीलता को हल कर सकती है। SMLM के लिए एक शर्त फ्लोरोफोरस हैं जो अंधेरे से फ्लोरोसेंट राज्य में संक्रमण करते हैं ताकि डेटा अधिग्रहण फ्रेम के हजारों में से प्रत्येक में उनके बिंदु प्रसार कार्यों के स्थानिक-लौकिक ओवरलैप से बचने के लिए एक अंधेरे से फ्लोरोसेंट राज्य में संक्रमण हो। बोडीपी पारंपरिक माइक्रोस्कोपी में उपयोग किए जाने वाले कई कंजूगेट्स के साथ अच्छी तरह से स्थापित रंग हैं। लाल-स्थानांतरित बॉडीपी ग्राउंड-स्टेट डिमर्स (डीII)के क्षणिक गठन के परिणामस्वरूप उज्ज्वल एकल अणु उत्सर्जन होता है जो एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम) को सक्षम करता है। यहां हम पारंपरिक BODIPY के साथ एसएमएलएम के लिए एक सरल लेकिन बहुमुखी प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में जीवित है। इस प्रक्रिया का उपयोग सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने और बोप्पी कॉन्जुगेट्स की स्थानिक-लौकिक जानकारी निकालने के लिए एकल BODIPY-DII राज्यों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। हम इस प्रक्रिया को लिपिड बूंदों (एलडी), फैटी एसिड, और नैनोस्कोपिक लंबाई पैमाने पर रहने वाले खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में lysosomes को हल करने के लिए लागू होते हैं । इसके अलावा, हम अन्य फ्लोरोसेंट जांच के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किए जाने पर बॉडीपी रंगों के साथ बहु-रंग इमेजिंग क्षमता प्रदर्शित करते हैं। हमारे प्रतिनिधि परिणाम फेड और उपवास की स्थिति के तहत खमीर में BODIPY-फैटी एसिड और तटस्थ लिपिड की अंतर स्थानिक वितरण और गतिशीलता दिखाते हैं। SMLM के लिए इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग सैकड़ों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बॉडीपी कंजूगेट्स के साथ किया जा सकता है और इस काम के अनुप्रयोगों से परे नैनोस्केल पर जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी संसाधन है।

Introduction

एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (SMLM) तकनीकों जैसे स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) और फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) अब्बे की ऑप्टिकल विवर्तन सीमा1,,2 से परे जानकारी के साथ सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों को उत्पन्न करने और एकल जैव अणुओं की गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए3,,4के तरीकों के रूप में उभरा है । एसएमएलएम के साथ संगत जांच के लिए आवश्यकताओं में से एक उनके बिंदु प्रसार कार्यों (पीएसएफ) के स्थानिक ओवरलैप से बचने के लिए किसी भी समय सक्रिय फ्लोरोफोरस की संख्या को नियंत्रित करने की क्षमता है। डेटा अधिग्रहण फ्रेम के हजारों में से प्रत्येक में, प्रत्येक फ्लोरोसेंट फ्लोरोफोरस का स्थान तब अपने इसी बिंदु-प्रसार फ़ंक्शन को फिटिंग करके ~ 20 एनएम सटीकता के साथ निर्धारित किया जाता है। परंपरागत रूप से, फ्लोरोफोरस के ऑन-ऑफ निमिष को स्टोचस्टिक फोटोस्विचिंग1,,2,,5 या रासायनिक रूप से प्रेरित आंतरिक निमिष6के माध्यम से नियंत्रित किया गया है। अन्य दृष्टिकोणों में फ्लोरोजेन-सक्रिय प्रोटीन7,,8 के लिए क्षणिक बाध्यकारी पर फ्लोरोजेन की प्रेरित सक्रियता और कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) या प्रकाश पत्रक उत्तेजना9में लेबल किए गए डीएनए ओलिगोमर्स की प्रोग्रामेबल बाध्यकारी-अनबाइंडिंग शामिल है। हाल ही में, हमने एसएमएलएम10 के लिए एक उपन्यास और बहुमुखी लेबलिंग रणनीति की सूचना दी जिसमें पहले लाल-स्थानांतरित डिमेरिक (डीII)पारंपरिक बोरोन डी-पायरोमेथेन (BODIPY) के राज्यों की सूचना11,,12,,13 क्षणिक रूप से बनाने और विशेष रूप से उत्तेजित हो जाती है और लाल-स्थानांतरित तरंगदैर्ध्य के साथ पता लगाया जाता है।

बोडीपी का व्यापक रूप से सैकड़ों वेरिएंट के साथ रंगों का उपयोग किया जाता है जो विशेष रूप से उप - सेलुलर डिब्बों और जैव अणुओं14,15,16को लेबल करते हैं । जीवित कोशिकाओं में उपयोग और प्रयोज्यता में आसानी के कारण, बॉडीपी वेरिएंट पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। यहां, हम एक विस्तृत और अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं कि कैसे सैकड़ों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बॉडीपी कंजूगेट्स का उपयोग लाइव-सेल एसएमएलएम के लिए किया जा सकता है। बॉडीपी मोनोमर की एकाग्रता ट्यूनिंग करके और उत्तेजना लेजर शक्तियों, इमेजिंग और डेटा विश्लेषण मापदंडों, उच्च गुणवत्ता वाले सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों और एकल अणु ट्रैकिंग डेटा को जीवित कोशिकाओं में प्राप्त किया जाता है। जब कम एकाग्रता (25-100 एनएम) पर इस्तेमाल किया जाता है, तो बॉडीपी एंजुगेट्स का उपयोग लाल-स्थानांतरित चैनल में एसएमएलएम के लिए और पारंपरिक उत्सर्जन चैनल में सहसापेक्ष पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए किया जा सकता है। प्राप्त एकल अणु डेटा का विश्लेषण स्थिर संरचनाओं के स्थानिक संगठन की मात्रा निर्धारित करने और जीवित कोशिकाओं17में अणुओं के विसारक राज्यों को निकालने के लिए किया जा सकता है । हरे और लाल दोनों रूपों में बॉडीपी जांच की उपलब्धता अन्य संगत फ्लोरोफोरस के साथ सही संयोजन में उपयोग किए जाने पर बहु-रंग इमेजिंग के लिए अनुमति देती है।

इस रिपोर्ट में, हम कई रंगों में BODIPY-C12,BODIPY (493/503), BODIPY-C12 लाल और lysotracker-हरे रंग का उपयोग कर लाइव-सेल एसएमएलएम डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । हम ~ 30 एनएम संकल्प के साथ रहने वाले खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में फैटी एसिड और तटस्थ लिपिड का समाधान करते हैं। हम आगे प्रदर्शित करते हैं कि खमीर कोशिकाएं उनके मेटाबोलिक स्थिति के आधार पर बाहरी रूप से जोड़े गए फैटी एसिड के स्थानिक वितरण को विनियमित करती हैं। हम पाते हैं कि जोड़ा गया बॉडीपी-फैटी एसिड (एफए) फेड की स्थिति के तहत एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) और लिपिड बूंदों (एलडी) में स्थानीयकरण करता है जबकि बॉडीपी-एफएएस उपवास पर प्लाज्मा झिल्ली में गैर-एलडी समूह बनाते हैं। हम आगे इस तकनीक के आवेदन को जीवित स्तनधारी कोशिकाओं में छवि lysosomes और LDs के लिए विस्तार । पारंपरिक बॉडीपी कंजूगेट्स का उपयोग करके एसएमएलएम के लिए हमारा अनुकूलित प्रोटोकॉल असंख्य उपलब्ध बॉडीपी कंजूगेट्स के साथ नैनोस्केल पर जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी संसाधन हो सकता है।

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Protocol

नोट: खमीर क्लोनिंग और एंडोजेनस टैगिंग के लिए कृपया हमारे हाल के प्रकाशन10का उल्लेख करें ।

1. इमेजिंग के लिए खमीर सेल के नमूनों की तैयारी

  1. एक w303 खमीर तनाव की एक तरल रातोंरात संस्कृति तैयार करें। एक बाँझ लकड़ी की छड़ी का उपयोग करके, खमीर निकालने वाली एक आगर प्लेट से खमीर कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा को रखें- पेप्टोन-डेक्सट्रोस सिंथेटिक पूर्ण डेक्सट्रोस (एससीडी) माध्यम के ~ 2 मिलील के साथ एक संस्कृति ट्यूब में। ट्यूब को 270 आरपीएम और 30 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. एससीडी में कोशिकाओं के 1:50 सुबह कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। एक 270 आरपीएम मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए पतला कोशिकाओं संस्कृति जारी रखें, कोशिकाओं को घातीय चरण में बढ़ने और ~ 0.6 के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) तक पहुंचने की अनुमति देता है।
    नोट: प्रक्रिया यहां भिन्न हो सकती है जिसके आधार पर मेटाबोलिक स्थिति का अध्ययन किया जा रहा है। बॉडीपी कॉन्जूगेट्स को घातीय विकास चरण में कोशिकाओं की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, स्थिर चरण के दौरान मृत कोशिकाओं से ऑटोफ्लोरेसेंस के जानकार रहें, क्योंकि यह एकल बॉडीपी-डीII उत्सर्जकों का विश्लेषण करने के लिए पृष्ठभूमि संकेत भी मजबूत हो सकता है।
  3. उपवास कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए, मीडिया के आदान-प्रदान के बिना 2 दिनों के लिए खमीर संस्कृति को बढ़ाएं।
  4. कोशिकाओं को चढ़ाना से पहले ~ 30 न्यूनतम पर, कमरे के तापमान पर deionized एच2O में ०.८ मिलीग्राम/mL बाँझ Concanavalin A (कोना) के 80 μL के साथ एक कक्ष कवरग्लास इनक्यूबेट । 30 मिन के बाद, कवरग्लास को तीन बार डिओनाइज्ड एच2ओ के साथ धोएं।
  5. इमेजिंग से पहले ~ 30 किमी पर, कक्षकवरग्लास पर कोशिकाओं को पिपेट करें, ताजा एससीडी की सही मात्रा के साथ ~ 0.12 (आमतौर पर ओडी ~ 0.6 में 240 माइक्रोन एसएल एससीडी में ऑप्टिकल घनत्व प्राप्त करने के लिए ताजा एससीडी की सही मात्रा के साथ)। कोशिकाओं को 30 मिन के लिए कोना सतह का व्यवस्थित और पालन करने दें।
  6. ~ 100 एनएम की अंतिम एकाग्रता पर सीधे कक्ष कवरग्लास में वांछित बॉडीपी ईंजुगेट जोड़ें।
    नोट: एक विशेष सेलुलर डिब्बे में BODIPYs स्थानीय घनत्व के आधार पर एक बॉडीपी एकाग्रता अनुकूलन प्रयोग की आवश्यकता हो सकती है।

2. एसएमएम इमेजिंग के लिए स्तनधारी कोशिकाओं की तैयारी

  1. एक T25 फ्लास्क में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 4 mM ग्लूटामाइन, 1 mM सोडियम पायरुवेट और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं के साथ गैर-फ्लोरोसेंट डीएमईएम में स्तनधारी U2OS कोशिकाओं को बनाए रखें।
    नोट: कोशिकाओं को डीएमईएम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं के साथ भी बनाए रखा जा सकता है, हालांकि, गैर-ऑटोफ्लोरोसेंट समाधान के साथ इमेजिंग से पहले मध्यम का आदान-प्रदान करने की आवश्यकता होती है।
  2. कोशिकाओं को 8-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में 70-80% प्रवाह 1:5 पर विभाजित करें। इमेजिंग से पहले 12 से 24 घंटे के लिए 8-अच्छी तरह की प्लेट में कोशिकाओं को संस्कृति।
  3. इमेजिंग से पहले 100 एनएम (डाइमेथिल सल्फास ऑक्साइड [डीएमएसओ]) में स्टॉक समाधान) की अंतिम एकाग्रता पर बॉडीपी-सी12,लासोट्रैकर ग्रीन या किसी अन्य बॉडीपी को जोड़ें। यह समय वांछित प्रयोग के आधार पर भिन्न हो सकता है।
    नोट: इमेजिंग लाइव सेल इमेजिंग समाधान का उपयोग करपरिवेश तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर किया जा सकता है। हालांकि, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इमेजिंग गैर फ्लोरोसेंट डीएमईएम के साथ मिश्रित 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 4 एमएम ग्लूटामाइन, 1 mM सोडियम पायरुवेट और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं को कोशिकाओं को शारीरिक स्थितियों के करीब रखने और जैविक निष्कर्ष बनाने के लिए पसंद किया जाता है।

3. उपकरण तैयार करना

  1. इस्तेमाल किए जा रहे बॉडीपी के उत्सर्जन रंग के आधार पर उत्सर्जन पथ में उपयुक्त फिल्टर सेट माउंट करें।
    नोट: एक क्वाड-बैंड डिक्रोइक मिरर (zt/405/488/561/640rdc) पहले उत्सर्जन प्रकाश से उत्तेजना को अलग करता है । ग्रीन एमिशन (५२५ एनएम) और रेड एमिशन (५९५ एनएम) को फिर डिक्रोइक लॉन्ग-पास बीम स्प्लिटर (T562lpxr) से विभाजित किया जाता है और इसके बाद ग्रीन चैनल में बैंड-पास फिल्टर ET525/50 और रेड चैनल में ईटी 595/50 । इसके बाद दोनों चैनलों को एक ही कैमरा चिप के अलग-अलग क्षेत्रों में प्रक्षेपित किया जाता है। इसी तरह, लाल उत्सर्जन (५९५ एनएम) और सुदूर लाल उत्सर्जन पहले एक डिक्रोइक लांग-पास बीम स्प्लिटर (FF652-Di01) द्वारा विभाजित किया जाता है और इसके बाद बैंड-पास फिल्टर ईटी 610/75 में लाल और एफएफ731/137 में दूर लाल चैनल में ।
  2. माइक्रोस्कोप, माइक्रोस्कोप स्टेज, लेजर (488 एनएम, 561 एनएम) और कैमरा चालू करें। यहां एक सही फोकस सिस्टम के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप और एक EMCCD कैमरा -68 डिग्री सेल्सियस को ठंडा किया जाता है।
  3. माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें।
  4. Hal4000 सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिकादेखें) जो इमेजिंग के लिए उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग, लेजर शक्तियों, लेजर शटर और कैमरा सेटिंग्स के लिए एलईडी लाइट को नियंत्रित करता है। EMCCD लाभ को 30 और कैमरे का तापमान -68 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। 20 हर्ट्ज पर फिल्में रिकॉर्ड करने के लिए कैमरा और इसी सॉफ्टवेयर तैयार करें।
    नोट: यह तकनीक फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) और स्टोचेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म) इमेजिंग में सक्षम किसी भी व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर लागू होती है। इसी सॉफ्टवेयर अलग-अलग हो सकता है।
  5. माइक्रोस्कोप स्टेज हीटर चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 5% के सीओ2 स्तर तक सेट करें। तदनुसार उद्देश्य सुधार कॉलर समायोजित करें।
  6. माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना माउंट और ध्यान केंद्रित प्रणाली संलग्न जब तक ध्यान केंद्रित। देखने के क्षेत्र में स्वस्थ कोशिकाओं को दिखाई देने तक मंच नियंत्रक का उपयोग करके मंच को स्थानांतरित करें।
    नोट: कमरे के तापमान पर खमीर कोशिकाओं के साथ इमेजिंग के लिए, हीटर या सीओ2 नियंत्रण चालू करने की कोई आवश्यकता नहीं है।
  7. मोनोमर के साथ-साथ डिमर्स के उत्तेजना के लिए उपयुक्त लेजर चालू करें। BODIPY ग्रीन या LysoTracker हरे रंग के लिए, हम एक ५६१ एनएम लेजर का उपयोग करने के लिए SMLM और एक ४८८ एनएम लेजर के लिए डीद्वितीय राज्यों उत्तेजित करने के लिए पारंपरिक फ्लोरेसेंस के लिए मोनोमर उत्तेजित ।
    नोट: BODIPY लाल के लिए, एक ६४० एनएम लेजर का उपयोग करने के लिए SMLM और एक ५६१ एनएम लेजर के लिए डीद्वितीय राज्यों उत्तेजित करने के लिए पारंपरिक फ्लोरेसेंस के लिए मोनोमर उत्तेजित । BODIPY लाल के लिए, लाल चैनल और दूर लाल चैनल में एकल अणु फटने में थोक फ्लोरेसेंस की कल्पना करने के लिए ५६१ एनएम और ६४० एनएम लेजर शक्तियों को समायोजित करें । ५६१ एनएम के लिए ठेठ शक्ति ~०.०६ W/cm2 और ~5 किलोवाट/सेमी2 ६४० एनएम के लिए है । BODIPY ग्रीन के लिए, 561 एनएम उत्तेजना के तहत हरे उत्सर्जन चैनल में पारंपरिक फ्लोरेसेंस भी देखने की उम्मीद है। BODIPY लाल के लिए, ६४० एनएम उत्तेजना के तहत लाल चैनल में पारंपरिक फ्लोरेसेंस देखने की उम्मीद है । यह संकेत स्टोक्स विरोधी उत्सर्जन से उत्पन्न होता है, जो निरंतर लेजर उत्तेजना के साथ मोनोमर/डिमर सह-स्थानीयकरण छवियों के लिए उपयोगी हो जाता है ।

4. डेटा अधिग्रहण

  1. मोनोमर के साथ-साथ डिमर्स के उत्तेजना के लिए लेजर शटर दृश्यों को लोड करें।
    नोट: हम आम तौर पर ५६१ एनएम पर नौ एकल अणु उत्तेजना फ्रेम का उपयोग करें और ४८८ एनएम पर एक पारंपरिक उत्तेजना फ्रेम के बाद । यह एक उज्जवल पारंपरिक फ्लोरेसेंस सिग्नल प्रदान करता है और बहु-रंग इमेजिंग अनुप्रयोगों में लाल एकल अणु का पता लगाने चैनल में ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) जैसे एक और 488 एनएम एक्सीटेबल फ्लोरोफोर के लीक होने से बचा ता है। वैकल्पिक रूप से, 561 एनएम लेजर को लगातार चालू करें और कम तरंगदैर्ध्य चैनल में पारंपरिक छवियों के लिए स्टोक्स विरोधी उत्सर्जन पर भरोसा करें।
  2. लेजर शक्तियों को ऐसे ट्यून करें कि लाल-स्थानांतरित उत्सर्जन चैनल में 561 एनएम उत्तेजना के तहत एकल अणु फ्लोरेसेंस फटने का पता लगाया जाता है, और पारंपरिक फ्लोरेसेंस 488 एनएम उत्तेजना के साथ हरे उत्सर्जन चैनल में दिखाई देता है। ५६१ एनएम लेजर की ठेठ लेजर शक्तियां एसएमएलएम के लिए 0.8-1 किलोवाट/सेमी2 के आसपास होंगी, और पारंपरिक फ्लोरेसेंस इमेजिंग मोड में ४८८ एनएम लेजर के लिए 0.035-0.07 डब्ल्यू/सेमी2 ।
  3. सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों के पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त स्थानीयकरण एकत्र करने के लिए फिल्मों के लिए एक गंतव्य फ़ोल्डर चुनें और 5,000-20,000 अधिग्रहण फ्रेम रिकॉर्ड करें।
  4. देखने के विभिन्न क्षेत्रों में जाएं और अधिक कोशिकाओं से डेटा एकत्र करने के लिए ऊपर दिए गए चरणों को दोहराएं।

5. डेटा विश्लेषण और एकल अणु ट्रैकिंग

  1. फिल्म को एसएमएम विश्लेषण सॉफ्टवेयर में लोड करें।
    नोट: किसी भी सॉफ्टवेयर18 का उपयोग किया जा सकता है। हम इनसाइट का उपयोग करते हैं (सामग्री की तालिकादेखें) और इमेजजे (फिजी) के लिए थंडरस्टॉर्म19 प्लगइन का उपयोग करके परिणामों को क्रॉस-मान्य करें।
  2. नेत्रहीन फिल्म स्क्रीन और इसके विपरीत सेटिंग्स को समायोजित ऐसे है कि एकल अणु फ्लोरेसेंस निमिष दिखाई दे रहा है । यदि आवश्यक है तो क्षेत्र या SMLM डेटा विश्लेषण के लिए फ्रेम रेंज को प्रतिबंधित अगर नमूना के कुछ हिस्सों लगातार fluorescing हैं ।
  3. 2डी गॉसियन पीएसएफ (आरओआई: पिक्सेल साइज 160 एनएम, चौड़ाई 260-650 एनएम, ऊंचाई और 50 फोटॉन) के साथ फिटिंग के लिए सिंगल मॉलिक्यूल आइडेंटिफिकेशन पैरामीटर सेट करें। पहचान मापदंडों की जांच करने और अलग एकल अणु फ्लोरेसेंस फटने का मज़बूती से पता लगाने के लिए कुछ उदाहरण फ्रेम के माध्यम से नेत्रहीन स्क्रीन (चित्रा 1Cदेखें)।
    नोट: ऊंचाई और चौड़ाई जैसे कुछ पहचान मापदंडों को नेत्रहीन कथित एकल अणु फ्लोरेसेंस संकेतों की मान्यता को अनुकूलित करने के लिए थोड़ा समायोजित किया जा सकता है।
  4. अनुकूलित पहचान मापदंडों के साथ एसएमएलएम छवि विश्लेषण करें और फिर प्रत्येक एकल अणु को 2डी गॉसियन के रूप में प्रस्तुत करें जिसकी चौड़ाई फोटॉनों की पता की गई संख्या के विलोम वर्ग रूट द्वारा भारित है।
  5. डेटा की गुणवत्ता का आकलन करें। समय में अधिक विशिष्ट उदाहरणों पर एकल अणु वितरण का निरीक्षण करने के लिए प्रतिबंधित फ्रेम पर्वतमाला का उपयोग करें। यह डेटा अधिग्रहण के दौरान ऑर्गेनेल आंदोलन के लिए खाते में जा सकते हैं।
  6. अणु वितरण के स्थानिक वितरण और गतिशीलता का और विश्लेषण करने के लिए, निर्देशांक, उपस्थिति के फ्रेम, फोटॉन, चौड़ाई और स्थानीयकरण की ऊंचाइयों वाली प्राप्त अणु सूची का निर्यात करें। अणु सूची को कस्टम लिखित विश्लेषण प्रक्रियाओं में आयात करें।
  7. एकल अणु वितरण की स्थानिक जानकारी प्राप्त करने के लिए, रेडियल वितरण समारोह (आर) की गणना करें, जो स्थानीयकरण के घनत्व को रेडियल दूरी20के एक समारोह के रूप में दर्शाता है। सभी स्थानीयकरणों की अनूठी जोड़ी वार दूरियों की गणना करने के लिए, ऊंचाई एच (आरआई)के साथ आरआई पर केंद्रित डिब्बे के साथ हिस्टोग्राम का निर्माण करें और चौड़ाई के साथ डॉ और 20ri* drद्वारा विभाजित करें; (ri)= एच (ri)i/i22 रेडियल वितरण समारोह का उपयोग क्लस्टरिंग की डिग्री के साथ-साथ समूहों के विशिष्ट आकार की मात्रा और तुलना करने के लिए किया जा सकता है।
  8. अणुओं के प्रसार के बारे में गतिशील जानकारी प्राप्त करने के लिए, एकल अणु निशान बनाने के लिए लगातार डेटा अधिग्रहण फ्रेम में 3 पिक्सल (0.48 माइक्रोन) के भीतर उदाहरण के लिए दिखाई देने वाले स्थानीयकरणको लिंक करें।
    नोट: लिंकिंग दूरी अणुओं के प्रसार और स्थानीयकरण के घनत्व पर निर्भर करेगी। प्रत्येक फ्रेम21,22में स्थानीयकरण के घनत्व का विश्लेषण करके अधिकतम लिंकिंग दूरी का अनुमान लगाया जा सकता है . औसत घनत्व प्रति माइक्रोन20.043 स्थानीयकरण होना निर्धारित किया गया था; इस प्रकार एक 0.48 माइक्रोन त्रिज्या एक कम पर्याप्त घनत्व के भीतर था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि विभिन्न अणुओं को एक साथ नहीं जोड़ा गया था।
  9. औसत अलग अंतराल समय के लिए विस्थापन एक मतलब चुकता विस्थापन (एमएसडी) बनाम एक साजिश बनाने के लिए कम से कम तीन अंतराल बार स्थाई कई निशान से । औसत प्रसार गुणांक डी3की गणनाकरने के लिए समीकरण एमएसडी = 4DΟt + 2 के साथ एमएसडी बनाम वक्र फिट करें।

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Representative Results

यहां, हम ऊपर प्रोटोकॉल(चित्रा 1A)के आधार पर बॉडीपी कॉन्जुगेट्स का उपयोग करके एसएमएलएम के लिए एक अनुकूलित नमूना तैयारी, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। एसएमएलएम डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए कार्यप्रवाह का एक उदाहरण प्रदर्शित करने के लिए, हम ऑप्टिकल विवर्तन सीमा(चित्रा 1B-F)-Fसे नीचे एलडी को हल करने के लिए खमीर में BODIPY (493/503) को नियोजित करते हैं। जीएफपी, एमओ2 जैसे अन्य जांचों के साथ मिलकर बॉडीपी के विभिन्न बहु-रंग इमेजिंग मोड के उदाहरण चित्रा 2में दिखाए गए हैं। हम उन्हें ~ 48 एच के लिए एक ही माध्यम में बढ़ रही द्वारा खमीर में मेटाबोलिक राज्य में हेरफेर और पता चलता है कि BODIPY-C12 रूपों स्थिर गैर-एलडी समूहों को खिलाया परिस्थितियों में LDs में उनके निगमन के विपरीत उपवास पर सेल परिधि में(चित्रा 3)। स्तनधारी कोशिकाओं के लिए BODIPY conjugates की SMLM क्षमता का विस्तार करने के लिए, हम कैडिपी-C12 और LysoTracker-ग्रीन में लाइव U2OS कोशिकाओं(चित्रा 4)की छवि है ।

Figure 1
चित्रा 1: बॉडीपी रंगों का उपयोग करके एसएमएलएम डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण का अनुकूलन। (ए)एकल अणु फ्लोरेसेंस संकेतों को अनुकूलित करने और बॉडीपी कंजूगेट्स से एसएमएलएम डेटा के बाद प्रसंस्करण के लिए कार्यप्रवाह। (ख)एलईडी छवि (बाएं), पारंपरिक फ्लोरेसेंस छवि (मध्य, उत्तेजना: ४८८ एनएम, उत्सर्जन: ५२५ एनएम) और विरोधी स्टोक्स छवि (दाएं, उत्तेजना: ५६१ एनएम, उत्सर्जन: ५२५ एनएम) खमीर कोशिकाओं के एलडी मार्कर BODIPY (493/503) के साथ दाग । (ग)एकल SMLM फ्रेम गायन BODIPY डीद्वितीय उत्सर्जक दिखा (उत्तेजना: ५६१ एनएम, उत्सर्जन: ५९५ एनएम) बहुत कम घनत्व (बाएं), इष्टतम घनत्व (मध्य) और बहुत अधिक घनत्व (दाएं) पर । (D)एसएमएलएम विश्लेषण मापदंडों का अनुकूलन। एक बहुत अधिक फोटॉन संख्या दहलीज के साथ, सॉफ्टवेयर वैध एकल अणु संकेतों (बाएं) को याद करता है, एक इष्टतम फोटॉन दहलीज (मध्य) के साथ सभी अणुओं का पता लगाता है और बहुत कम फोटॉन थ्रेसहोल्ड (दाएं) के साथ झूठे स्थानीयकरण का पता लगाता है। (ई)बॉडीपी (493/503) की एसएमएलएम छवि 125 एनएम के औसत व्यास के साथ एलडी (बाएं, ज़ूम) के आकार को हल करती है। (एफ)एकल अणु ट्रैकिंग एलडी (बाएं) के अंदर BODIPY (493/503) के सीमित प्रसार का पता चलता है । निशान का उपयोग एमएसडी बनाम टाइम वक्र की गणना करने के लिए किया जाता है, जो एलडी (दाएं) के अंदर उप-विसारक व्यवहार को प्रदर्शित करता है। स्केल बार = 1 माइक्रोन, ज़ूम = 100 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बहु रंग SMLM इमेजिंग रहने वाले कोशिकाओं में BODIPY conjugates का उपयोग कर । (ए)४८८ एनएम उत्तेजना (बाएं) के तहत BODIPY-C12 की पारंपरिक छवि । इसी SMLM छवि 561 एनएम उत्तेजना (मध्य) और ज़ूम (दाएं) उभरते LDs में BODIPY-C12 खुलासा BODIPY-C12 के डीद्वितीय राज्यों का उपयोग कर ।(B)488 एनएम उत्तेजना (बाएं) के तहत Sec63-GFP के साथ लेबल ईआर की पारंपरिक फ्लोरेसेंस छवि। इसके साथ ही 561 एनएम उत्तेजना (मध्य) और एसएमएलएम छवि के साथ बोप्पी-सी 12 लाल की पारंपरिक फ्लोरेसेंस छवि दर्ज की गई 640 एनएम उत्तेजना (दाएं) का उपयोग करके। (C)सेक्63-mEos2 और BODIPY-C12 ग्रीन डीII राज्यों की अनुक्रमिक दो रंग एसएमएलएम इमेजिंग। सबसे पहले, mEos2 उच्च 405 एनएम फोटो सक्रियण और 561 एनएम उत्तेजना (बाएं) के साथ इमेज्ड है जिसके बाद 405 एनएम सक्रियण (मध्य) के बिना लंबे डेटा अधिग्रहण के बाद। स्केल बार = 1 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: खमीर कोशिकाओं में उपवास पर अंतर फैटी एसिड वितरण। (A)एससीडी माध्यम में वृद्धि की अवधि के आधार पर विभिन्न मेटाबोलिक राज्यों (फेड और उपवास की स्थिति) का वर्णन करते हुए योजनाबद्ध। ख) पारंपरिक फ्लोरेसेंस छवियां (शीर्ष) से पता चलता है कि BODIPY-C12 लाल सह BodiPY (493/503) के साथ स्थानीयता खिलाया शर्तों के तहत LDs में शामिल होने का संकेत है । SMLM छवि (कम, बाएं) एलडी में घने BODIPY-C12 puncta से पता चलता है और एकल अणु निशान (कम, सही) सेलुलर झिल्ली के साथ प्रसार का प्रदर्शन । (ग)उपवास की स्थिति के तहत, बॉडीपी-C12 सेल परिधि में पुक्टा बनाता है जो एलडीएस (ऊपरी: बाएं, मध्यम, निचले बाएं) के साथ सह-स्थानीयकरण नहीं करता है। SMLM छवि BODIPY-C12 लाल (निचले, सही) के puncta और सीमित निशान हल करता है । (D)रेडियल डिस्ट्रीब्यूशन फंक्शन (बाएं) उपवास पर बॉडीपी-एफएएस के उच्च क्लस्टरिंग को दिखाता है । एकल अणु ट्रैकिंग (दाएं) के समय की साजिश बनाम मतलब वर्ग विस्थापन उपवास पर BODIPY-C12 के स्थिरीकरण की पुष्टि करता है । स्केल बार = 1 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: लाइव स्तनधारी U2OS कोशिकाओं में BODIPY रंगों की इमेजिंग । (A)488 एनएम उत्तेजना में BODIPY-C12 की पारंपरिक फ्लोरेसेंस छवि (बाएं) । 561 एनएम उत्तेजना में डीII राज्यों (दाएं) का उपयोग करके इसी एसएमएम छवि U2OS सेल में डीII राज्यों के नैनोस्कोपिक वितरण को दर्शाती है। इनसेट लिपिड बूंदों (स्केल बार = 500 एनएम) के आवर्धन दिखाते हैं। (ख)U2OS कोशिकाओं में lysosomes की पारंपरिक छवि 488 एनएम उत्तेजना (बाएं) पर LysoTracker हरे रंग का उपयोग कर. 561 एनएम उत्तेजना पर स्थिर lysosomes (दाएं, पैमाने पर बार = 5 μm) की इसी SMLM छवि। इनसेट: एक ऑप्टिकली विवर्तन की एसएमएलएम छवि सीमित lysosome (स्केल बार 100 एनएम) । बॉडीपी-C12 छवियों को 23 डिग्री सेल्सियस पर लाइव सेल इमेजिंग समाधान में दर्ज किया गया था। लाइसोट्रैकर ग्रीन का उपयोग करने वाले लाइसोसोम की छवियों को गैर-फ्लोरोसेंट डीएमईएम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 4 एमएम ग्लूटामाइन, 1 मीटर सोडियम पायरुवेट और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर दर्ज किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हमने दिखाया कि कैसे पारंपरिक BODIPY conjugates स्थानिक संकल्प में परिमाण सुधार के एक आदेश के साथ SMLM छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह विधि पहले रिपोर्ट की गई, पारंपरिक बॉडीपी रंगों के लाल-स्थानांतरित डीII राज्यों का शोषण करने पर आधारित है, जो द्वि-आणविक मुठभेड़ों के माध्यम से क्षणिक रूप से बनती है। इन राज्यों को विशेष रूप से उत्साहित किया जा सकता है और लाल स्थानांतरित तरंगदैर्ध्य के साथ पता लगाया जा सकता है और विरल और अल्पकालिक SMLM के लिए पर्याप्त रहते हैं । लेजर मापदंडों के साथ-साथ बॉडीपी मोनोमर की एकाग्रता को ट्यूनिंग करके, स्थानीयकरण और सिग्नल-टू-शोर का इष्टतम घनत्व प्राप्त किया जा सकता है। हमने फेड और उपवास की स्थिति के तहत जीवित खमीर कोशिकाओं में ~ 30 एनएम संकल्प (सैद्धांतिक थॉमसन के सूत्र) के साथ फैटी एसिड एनालॉग और तटस्थ लिपिड के इंट्रासेलुलर वितरण और गतिशीलता का समाधान किया। हमने यह भी पाया कि BODIPY डीII राज्यों के ~ 40% 20 हर्ट्ज पर दो या अधिक डेटा अधिग्रहण फ्रेम के लिए रहते हैं, जिससे एकल-अणु ट्रैकिंग विभिन्न परिस्थितियों में अपनी गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम होती है। हमारे परिणाम उपवास पर BODIPY-FAs के अंतर स्थानीयकरण और गतिशीलता दिखाते हैं और लिपोटॉक्सिकिटी के खिलाफ एक सुरक्षा तंत्र का सुझाव देते हैं। एकल बॉडीपी अणुओं को ट्रैक करने और विभिन्न मेटाबोलिक राज्यों के तहत ऑप्टिकल विवर्तन सीमा से नीचे एलडीएस और बॉडीपी-एफए पुक्टा के आकार को हल करने की हमारी क्षमता केवल पारंपरिक बॉडीपी कॉन्जूगेट्स की विकसित एसएमएलएम क्षमता के साथ संभव है। फैटी एसिड वितरण और तेज के स्थानिक विनियमन में शामिल सटीक आणविक तंत्र और रास्ते हमारे भविष्य के अध्ययनों का विषय हैं । इसके अलावा, हमने U2OS कोशिकाओं में BODIPY-FAs और lysosomes को हल करके स्तनधारी कोशिकाओं को जीवित करने के लिए पारंपरिक BODIPY की एसएमएलएम क्षमता का विस्तार किया।

SMLM के लिए पारंपरिक BODIPY conjugates के डीद्वितीय राज्यों का उपयोग अन्य जांच पर लाभ है क्योंकि सैकड़ों विभिन्न बॉडीपी वेरिएंट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं जो जीवित कोशिकाओं में विशिष्ट अणुओं या सेलुलर डिब्बों को लेबल करते हैं। नमूना तैयारकरना बिना किसी धुलाई के इमेजिंग से पहले कम (~ 100 एनएम) सांद्रता पर रंगे को जोड़ने जितना आसान है। अंय PALM के विपरीत/समय के साथ ब्लीच, BODIPY मोनोमर अपने डीद्वितीय राज्यों के उत्तेजना से अप्रभावित है और इसलिए दीर्घकालिक इमेजिंग में एकल अणु संकेतों के लिए एक लगभग कभी नहीं घट स्रोत प्रदान करते हैं । चूंकि डीद्वितीय राज्य सहज द्वि-आणविक मुठभेड़ों के कारण उत्पन्न होते हैं, इसलिए डीII राज्यों का उपयोग करके एसएमएलएम कोनिमिष 23को प्रेरित करने के लिए कोई बाहरी रूप से जोड़ा गया बफर की आवश्यकता नहीं होती है। इसी तरह, नए संश्लेषित फोटो-एक्टिवेट बॉडीपीसंस्करण24 या कुछ पारंपरिक बॉडीपी रंगों21के एसएमएलएम के लिए आवश्यक उच्च ऊर्जा फोटो-सक्रियण की कोई आवश्यकता नहीं है, जो दीर्घकालिक इमेजिंग25,,26के दौरान सेल स्वास्थ्य के लिए हानिकारक हो सकता है। इसके अलावा, डीद्वितीय राज्यों के साथ एसएमएलएम मोनोमर एकाग्रता पर डीII राज्यों की चतुर्भुज निर्भरता के कारण गैर-विशेष रूप से बातचीत की जांच का एक अंतर्निहित पृष्ठभूमि दमन बनाता है। इसलिए, पारंपरिक जांच की तुलना में एसएमएलएम छवियों में एक उच्च विपरीत प्राप्त किया जाता है जिसका मोनोमेरिक संकेत पता लगाया जाता है।

BODIPYs एक बेहोश विरोधी स्टोक्स फ्लोरेसेंस का प्रदर्शन करता है जो उच्च उत्तेजना शक्ति पर एक लेजर के साथ मोनोमर और डिमर्स के उत्तेजना को सक्षम बनाता है। एक तरफ, इस संपत्ति को एक साथ पारंपरिक फ्लोरेसेंस और एसएमएलएम इमेजिंग के लिए ट्रैक करने और चलती संरचनाओं को हल करने के लिए शोषण किया जा सकता है। दूसरी ओर, यह बहु रंग इमेजिंग के लिए अन्य जांच के साथ BODIPY डीII राज्यों गठबंधन करना कठिन बनाता है क्योंकि बॉडीपी सिग्नल दो उत्सर्जन चैनलों पर रह रहा है। हालांकि, बहु रंग इमेजिंग संभव है जब जांच ध्यान से के रूप में Sec63-GFP और BODIPY-C12 लाल के साथ चित्रा 2B में दिखाया गया है चुना जाता है । इसी तरह, अनुक्रमिक दो रंग SMLM अन्य फोटो-सक्रिय जांच के साथ संभव है जैसे mEos2 जैसा कि चित्रा 2 Cमें दिखाया गया है। दो रंग एसएमएलएम के लिए अन्य संभावित संयोजनों में हरे बोप्पी कंजूगेट्स का उपयोग और 640 एनएम उत्तेजनीय रंग जैसे जेएफ646 हेलो टैग27से बंधे हैं।

संक्षेप में, हमने एसएमएलएम के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है जो पारंपरिक बॉडीपी रंगों का उपयोग करके फैटी एसिड, तटस्थ लिपिड और जीवित खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में नैनोस्कोपिक लंबाई पैमाने पर स्थानिक-लौकिक वितरण की जांच कर रहा है। मामूली संशोधनों के साथ, यह प्रोटोकॉल एसएमएलएम के लिए समान रूप से लागू हो सकता है जिसमें सैकड़ों अन्य बॉडीपीई विभिन्न प्रकारों में संजोए हुए हैं।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय आयुर्विज्ञान संस्थान ने पुरस्कार संख्या R21GM127965 के तहत समर्थन दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

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References

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बायोकेमिस्ट्री इश्यू 160 फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी सिंगल-मॉलिक्यूल ट्रैकिंग सिंगल-मॉलिक्यूल लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी बॉडीपी ग्राउंड-स्टेट डिमर यीस्ट स्तनधारी कोशिकाएं
लाइव-सेल सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी और एकल-अणु ट्रैकिंग के लिए पारंपरिक बॉडीपी कंजूगेट्स
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Adhikari, S., Banerjee, C., Moscatelli, J., Puchner, E. M. Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking. J. Vis. Exp. (160), e60950, doi:10.3791/60950 (2020).

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