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Biochemistry

ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/60950
Automatic Translation
1, *1, *1,2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, Twin Cities, Physics and Nanotechnology (PAN), 2Middlebury College
* These authors contributed equally

Summary

従来のBODIPYコンジュゲートは、一過性形成、赤シフト地盤状態ダイマーの開発を通じて、生細胞単一分子局在化顕微鏡(SMLM)に使用することができます。我々は、生きている哺乳類および酵母細胞における細胞内中性脂質および脂肪酸をナノスコピック長さスケールで追跡し、解決するための最適化されたSMLMプロトコルを提示する。

Abstract

一分子局在化顕微鏡(SMLM)技術は、従来の蛍光顕微鏡の光学回折限界を克服し、細胞内構造と生体分子のダイナミクスを〜20nmの精度で解決することができます。SMLMの前提条件は、何千ものデータ取得フレームのそれぞれでポイントスプレッド機能の時空間的な重複を避けるために、暗い状態から蛍光状態に移行する蛍光HOREです。BODIPYは、従来の顕微鏡で使用される多数のコンジュゲートを備えた確立された染料です。赤シフトBODIPY地中状態ダイマー(DII)の一過性形成は、明るい単一分子放出をもたらし、単一分子局在顕微鏡(SMLM)を可能にする。ここでは、生きている酵母および哺乳類細胞における従来のBODIPYコンジュゲートを用いたSMLMのためのシンプルだが汎用性の高いプロトコルを提示する。この手順は、超解像画像を取得し、BODIPY-DII状態を追跡してBODIPYコンジュゲートの時空間的情報を抽出するために使用できます。この手順を応用して、ナノスコピック長さスケールで生きている酵母や哺乳動物細胞の脂質滴(LD)、脂肪酸、リソソームを解決します。また、他の蛍光プローブと併用した場合の、BODIPY色素によるマルチカラーイメージング能力を実証しています。我々の代表結果は、供給および断食条件下で酵母におけるBODIPY脂肪酸および中性脂質の差動空間分布および移動性を示す。SMLM用のこの最適化されたプロトコルは、市販の何百ものBODIPYコンジュゲートで使用することができ、この研究の用途をはるかに超えてナノスケールで生物学的プロセスを研究するのに有用なリソースです。

Introduction

確率的光学再構成顕微鏡(STORM)や光活性化局在化顕微鏡(PALM)などの単一分子局在化顕微鏡(SMLM)技術は、アッベの光学回折限界1,22を超える情報を持つ超解像画像を生成する方法として、そして単一1生体分子33,44のダイナミクスを追跡する方法として浮上している。SMLMと互換性のあるプローブの要件の1つは、ポイントスプレッド関数(PSF)の空間的な重複を避けるために、アクティブフルオロフォアの数をいつでも制御できることです。何千ものデータ取得フレームのそれぞれで、各蛍光蛍光蛍光色素の位置は、その対応するポイントスプレッド関数をフィッティングすることによって〜20 nmの精度で決定されます。従来、フルオロフォアのオンオフ点滅は、確率的な光スイッチング11、2、5、2,5または化学的に誘発された固有の点滅6によって制御されてきた。他のアプローチとしては、蛍光物質活性化タンパク質77,88への過渡的結合時の蛍光物質の誘導活性化と、全内部反射蛍光(TIRF)またはライトシート励起における標識DNAオリゴマーのプログラマブル結合結合(TIRF)が含まれる。最近、従来のホウ素二重火メタン(BODIPY)コンジュゲート11、12、1312,13の赤シフト二量体(DII)状態が一時的に形成され、赤シフト波長で特異的に励起され検出されるSMLM10の新しい多目的なラベリング戦略を報告しました。11

BODIPYs は、細胞下の区画と生体分子14,,15,,16に特異的に標識する何百もの変異体を有する色素として広く使用されている。生細胞での使いやすさと適用性のために、BODIPY変異体は従来の蛍光顕微鏡で市販されています。ここでは、何百もの市販のBODIPYコンジュゲートをライブセルSMLMに使用する方法に関する詳細かつ最適化されたプロトコルについて説明します。BODIPYモノマーの濃度を調整し、励起レーザーパワー、イメージング、データ解析パラメータを最適化することにより、生細胞で高品質の超高解像度画像と単一分子追跡データが得られます。低濃度(25-100 nM)で使用する場合、BODIPYコンジュゲートは、赤シフトチャネルのSMLMと従来の発光チャネルにおけるコナルコンルジェンス用蛍光顕微鏡に同時に使用することができます。得られた単一分子データを分析して、不動構造の空間的組織を定量化し、生細胞17における分子の拡散状態を抽出することができる。緑色と赤色の両方の形態のBODIPYプローブの利用可能性は、他の互換性のあるフルオロフォアとの適切な組み合わせで使用する場合、マルチカラーイメージングを可能にします。

本レポートでは、複数色のBODIPY-C 12、BODIPY(493/503)、BODIPY-C12赤、リソトラッカーグリーンを使用して、ライブセル12SMLMデータを取得および分析するための最適化されたプロトコルを提供します。生きている酵母細胞や哺乳動物細胞の脂肪酸と中性脂質を、30nmの分解能で分解します。さらに、酵母細胞が代謝状態に応じて外部付加脂肪酸の空間分布を調節することを実証する。加えたBODIPY-脂肪酸(FA)は、摂食条件下で小胞体(ER)および脂質液滴(LD)に局地的に局部化するのに対し、BODIPY-FAは断食時に血漿膜中に非LDクラスターを形成することを発見した。我々は、生きている哺乳動物細胞におけるリソソームおよびLDを画像化するために、この技術の応用をさらに拡大する。従来の BODIPY コンジュゲートを使用した SMLM 用の最適化プロトコルは、使用可能な無数の BODIPY コンジュゲートを使用してナノスケールで生物学的プロセスを研究するのに役立つリソースになります。

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Protocol

注:酵母クローニングと内因性タグ付けについては、最近の出版物10を参照してください。

1. 酵母細胞サンプルのイメージング用調製

  1. w303酵母株の液体一晩培養液を調製する。滅菌木製スティックを使用して、酵母エキス-ペプトン-デキストロースを含む寒天プレートから少量の酵母細胞を、合成完全デキストロース(SCD)培地の〜2 mLで培養管に入れ、その中に少量の酵母細胞を見つけます。270rpmおよび30°Cの揺れインキュベーターでチューブを一晩インキュベートする。
  2. SCDで細胞の1:50朝希釈を行います。270rpmの振盪インキュベーターで30°Cで4時間希釈した細胞を培養し続け、細胞を指数相で増殖させ、〜0.6の光学密度(OD)に到達させる。
    注:この手順は、研究されている代謝状態によって異なる場合があります。BODIPY コンジュゲートは、指数成長段階で細胞を必要としません。.しかし、単一のBODIPY-DIIエミッタを分析するには強すぎるバックグラウンドシグナルを引き起こす可能性がありますので、静止期の間に死んだ細胞からの自己蛍光を認識してください。
  3. 断食細胞を研究するために、培地交換なしで2日間酵母培養を成長させます。
  4. 細胞をめっきする前に~30分で、室温で脱イオン化したH2Oに0.8mg/mLの無菌コンカナバリンA(ConA)の80 μLのチャンバーカバーグラスをインキュベートします。30分後、脱イオン化したH2Oでカバーグラスを3回洗います。
  5. イメージングの30分前に、チャンバーカバーグラス上の細胞をピペットし、新鮮なSCDの正しい体積で〜0.12の光学密度を達成する(通常、OD〜0.6で240 μL SCDで60 μL酵母培養)。細胞を落ち着かせ、ConA表面に30分間接着させます。
  6. 所望のBODIPYコンジュゲートをチャンバーカバーグラスに直接加え、最終濃度の100 nMで加えます。
    注:特定のセルラーコンパートメントのBODIPYsローカル密度に応じて、BODIPY濃度最適化実験が必要な場合があります。

2. SMLMイメージング用哺乳動物細胞の調製

  1. T25フラスコで10%胎児ウシ血清、4 mMグルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を用いて、非蛍光性DMEMの哺乳動物U2OS細胞を維持します。
    注:細胞は、10%のウシ胎児血清および1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を用いてDMEMで維持することもできるが、非自己蛍光溶液でイメージングする前に培地を交換する必要がある。
  2. 70-80%の合流率1:5で細胞を8ウェルプレートの単一のウェルに分割します。8ウェルプレートの細胞をイメージング前に12〜24時間培養する。
  3. 画像化の10分前に、100 nM(ジメチルスルホキシド[DMSO]のストック溶液)の最終濃度で、BODIPY-C 12、LysoTracker Greenまたは他のBODIPYコンジュゲートを追加します。この時間は、所望の実験に応じて変化し得る。
    メモ:ライブセルイメージングソリューションを使用して、周囲温度(23°C)でイメージングを行うことができます。しかし、37°Cおよび5%CO2での2非蛍光性DMEMでのイメージングは、10%のウシ胎児血清、4mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を混合して、細胞を生理学的状態に近づけ、生物学的結論を下すために好ましい。

3. 設備準備

  1. 使用されている BODIPY の放出色に基づいて、適切なフィルタ セットをエミッション パスにマウントします。
    メモ:クワッドバンド二色ミラー(zt/405/488/561/640rdc)は、最初に励起と発光光を分離します。次に、緑の放出(525 nm)と赤の放出(595 nm)は、二色性ロングパスビームスプリッター(T562lpxr)によって、次いでグリーンチャネルのバンドパスフィルタET525/50、赤チャネルのET 595/50によって分割されます。2つのチャンネルは、同じカメラチップの異なる領域に投影されます。同様に、赤い放射(595 nm)と遠赤色の放出は、最初に二色性ロングパスビームスプリッター(FF652-Di01)によって分割され、次いでバンドパスフィルタET 610/75が赤色で、FF731/137は遠赤色チャネルで分割されます。
  2. 顕微鏡、顕微鏡ステージ、レーザー(488 nm、561 nm)、カメラをオンにします。ここでは、完璧なフォーカスシステムと-68°Cに冷却されたEMCCDカメラを備えた反転顕微鏡が使用されています。
  3. 顕微鏡の目的に浸漬油の滴を加える。
  4. 明視野イメージング、レーザーパワー、レーザーシャッター、イメージング用カメラ設定のLEDライトを制御するHal4000ソフトウェア(材料表参照)を開きます。EMCCDゲインを30に、カメラ温度を-68 °Cに設定します。20 Hzで映画を録画するためにカメラと対応するソフトウェアを準備します。
    注:この技術は、光活性化局在化顕微鏡(PALM)および確率的光学再構成顕微鏡(STORM)イメージングが可能な広視野顕微鏡に適用されます。対応するソフトウェアは異なる場合があります。
  5. 顕微鏡ステージヒーターをオンにし、37°Cの温度とCO2レベル5%に設定します。目的の補正カラーを適宜調整します。
  6. サンプルを顕微鏡ステージに取り付け、フォーカスシステムがかみ合うまで焦点を合わせます。正常なセルが視野に表示されるまで、ステージコントローラーを使用してステージを移動します。
    注:室温で酵母細胞をイメージングする場合、ヒーターまたはCO2コントロールをオンにする必要はありません。
  7. モノマーとダイマーの励起に適したレーザーをオンにします。BODIPYグリーンまたはライソトラッカーグリーンの場合、SMLMのDII状態を励起するために561 nmレーザーを使用し、従来の蛍光のためにモノマーを励起するために488 nmレーザーを使用します。
    注:BODIPY赤色の場合は、640 nmレーザーを使用してSMLMのDII状態を励起し、561 nmレーザーを使用して従来の蛍光のためにモノマーを励起します。BODIPY 赤の場合は、561 nm および 640 nm レーザーパワーを調整して、赤チャネルのバルク蛍光を視覚化し、遠赤色チャネルで単一分子バーストを表示します。561 nmの典型的な電力は、640 nmの場合は〜0.06 W/cm2、〜5 kW/cm2です。BODIPYグリーンの場合、561 nm励起の下の緑の放出チャネルで従来の蛍光も見ることを期待する。BODIPY赤色の場合、640 nm励起下の赤色チャネルに従来の蛍光が見えることを期待する。この信号は、連続的なレーザー励起を伴うモノマー/ダイマーの共局在画像に有用となる抗ストークス発光から生じる。

4. データ取得

  1. モノマーとダイマーの励起のためのロードレーザーシャッターシーケンス。
    注: 通常、561 nm で 9 つの単一分子励起フレームを使用し、その後に 488 nm で 1 つの従来の励起フレームを使用します。これは明るい従来の蛍光シグナルを提供し、多色画像化の適用の赤い単一分子の検出チャネルに緑の蛍光蛋白質(GFP)のような別の488 nmの興奮性蛍光色素の漏出を避ける。あるいは、561 nmレーザーを連続的にオンにし、短波長チャネルの従来の画像に対する抗ストークス発光に依存します。
  2. 561 nm励起下の赤ずれた発光チャネルで単一分子蛍光バーストが検出されるようにレーザーパワーを調整し、488nm励起の緑色放射チャネルに従来の蛍光が現れます。561 nmレーザーの典型的なレーザーパワーは、SMLMでは約0.8-1 kW/cm2、従来の蛍光イメージングモードでは488 nmレーザーの場合は0.035-0.07 W/cm2です。2
  3. 映画の保存先フォルダを選択し、5,000~20,000 の取得フレームを記録して、超高解像度イメージを再構築するのに十分なローカリゼーションを収集します。
  4. 別の視野に移動し、上記の手順を繰り返して、より多くのセルからデータを収集します。

5. データ分析と単一分子トラッキング

  1. ムービーを SMLM 解析ソフトウェアにロードします。
    注: 任意のソフトウェア18を使用できます。私たちは、INSIGHT (資料の表を参照)を使用し、imageJ (フィジー) の ThunderSTORM19プラグインを使用して結果をクロス検証します。
  2. 映像を視覚的にスクリーニングし、単一分子蛍光点滅が見えるようコントラスト設定を調整する。必要に応じて、サンプルの一部が継続的に蛍光を発している場合、SMLMデータ分析のための領域またはフレーム範囲を制限する。
  3. 2D ガウス PSF(ROI: ピクセル サイズ 160 nm、幅 260~650 nm、高さ > 50 光子を持つ 7 x 7 ピクセル)に適合するための単一分子識別パラメータを設定します。いくつかのフレーム例を視覚的にスクリーニングして識別パラメータを確認し、単一分子の蛍光バーストを確実に検出する(図1Cを参照)。
    注: 高さや幅などの特定の識別パラメータは、視覚的に知覚された単一分子蛍光シグナルの認識を最適化するために、わずかに調整することができます。
  4. 最適化された識別パラメータを使用して SMLM 画像解析を実行し、検出されたフォトン数の逆平方根によって幅が重み付けされた 2D ガウシアンとして各分子をレンダリングします。
  5. データの品質を評価します。制限されたフレーム範囲を使用して、より特定のインスタンスでの単一分子分布を時間的に観察します。これは、データ取得中のオルガネラの動きを説明することができます。
  6. さらに、分子分布の空間分布とダイナミクスを分析するには、取得した分子リストをエクスポートし、その座標、外観のフレーム、光子、幅、および高さを含む局在化します。カスタムの作成された分析手順で分子リストをインポートします。
  7. 単一分子分布の空間情報を得るためには、放射状距離20の関数としての局在の密度を表す放射状分布関数ρ(r)を計算する。ρ(r)を得るために、すべてのローカリゼーションのユニークな対方向距離を計算し、高さH(ri)でriを中心としたビンを持ち、幅drで2πri*drで除算してヒストグラムを構築します。(ρ(ri)= H(r i)/π(ri+dr)2-ri2)。iラジアル分布関数を使用して、クラスターの度合いとクラスターの特性サイズを定量化し、比較することができます。
  8. 分子の拡散に関する動的な情報を得るために、連続したデータ取得フレーム内の例えば3ピクセル(0.48 μm)以内に現れる局在化をリンクして、単一分子の痕跡を作成します。
    注: リンク距離は、分子の拡散と局在の密度によって異なります。最大リンク距離は、各フレーム21,22,22における局在の密度を分析することによって推定することができる。平均密度はμmあたり0.043の局在性を2と判断した。したがって、半径0.48μmは、異なる分子が相互にリンクされていないことを保証するのに十分な低密度の範囲内でした。
  9. 少なくとも 3 回のラグタイムを持続する複数のトレースからの異なるラグタイム Δt の変位を平均して、平均平方変位(MSD)と Δt プロットを作成します。MSD と Δt の曲線を式 MSD = 4DΔt + σ2に合わせて、平均拡散係数 D3を計算します。

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Representative Results

ここでは、上記のプロトコルに基づいたBODIPYコンジュゲートを用いたSMLMの最適化されたサンプル調製、データ取得および分析手順を提示する(図1A)。SMLMデータを取得して分析するワークフローの例を示すために、酵母にBODIPY(493/503)を採用し、光回折限界を下回るLDを解決します(図1B-F)。-F図2に、GFP、mEos2などの他のプローブと組み合わせたBODIPYの異なるマルチカラーイメージングモードの例を示す。酵母の代謝状態を~48時間同じ培地で増殖させることで、酵母の代謝状態を操作し、BODIPY-C12が、供給条件下でのLDへの組み込みとは対照的に、断食時に細胞周辺において非移動性非LDクラスターを形成することを示す(図3)。さらに、BODIPYコンジュゲートのSMLM能力を哺乳動物細胞に拡張するために、生きたU2OS細胞でBODIPY-C12とライソトラッカーグリーンを画像化します(図4)。

Figure 1
図1:BODIPY色素を用いたSMLMデータ取得と解析の最適化(A)単一分子蛍光信号の最適化およびBODIPYコンジュゲートからのSMLMデータの後処理のワークフロー(B)LED画像(左)、従来の蛍光画像(中間、励起:488nm、発光:525nm)および抗ストークス画像(右、励起:561nm、発光:525nm)の酵母細胞のLDマーカーで染色されたBODIPY(493/503)。(C)単一のSMLMフレームは、あまりにも低密度(左)、最適密度(中間)および高密度(右)でのシンジBODIPY DIIエミッタ(励起:561 nm、放出:595 nm)を示す。(D) SMLM 解析パラメータの最適化あまりにも高い光子数のしきい値を使用すると、ソフトウェアは有効な単一分子信号(左)を逃し、最適な光子閾値(中間)を持つすべての分子を検出し、あまりにも低い光子閾値(右)で偽の局在を検出します。(E)BODIPY (493/503) の SMLM 画像は、平均直径 125 nm の LD (左、ズーム) のサイズを解決します。(F)単一分子追跡は、内部のBODIPY(493/503)の内部の限定拡散を明らかにする(左)。トレースは、MSD と時間曲線の計算に使用され、これは、LD 内でサブディフューシャブ動作を示します (右)。スケールバー = 1 μm、ズーム = 100 nm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:生細胞におけるBODIPYコンジュゲートを用いたマルチカラーSMLMイメージング(A)488nm励起下BODIPY-C12の従来の画像(左)。A561 nm励起(中央)下のBODIPY-C12のDII状態を用いた対応するSMLM画像(中央)およびズーム(右)は、新興のLDでBODIPY-C12を明らかにする。(B)488nm励起下下のSec63-GFPで標識されたERの従来の蛍光像(左)。B640 nm励起(右)を用いて、561 nm励起(中央)とSMLM画像を用いたBODIPY-C12赤色の従来の蛍光画像を同時に記録した。(C) Sec63-mEos2 および BODIPY-C12 緑色 DII状態の連続的な 2 色 SMLM イメージング。まず、mEos2は高い405 nmの光活性化と561 nmの励起(左)に続いて405 nm活性化なしで長いデータ取得(中央)で画像化される。スケールバー= 1 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:酵母細胞における断食時の微分脂肪酸分布.(A) SCD培地の成長期間に基づいて異なる代謝状態(供給および絶食状態)を記述する概略図。B)従来の蛍光画像(上)は、BODIPY-C12赤色が、Dへの取り込みを示す供給条件下でBODIPY(493/503)と共局することを示す。SMLM画像(下、左)は、LDの緻密なBODIPY-C12穿刺を示し、単一分子の痕跡(下、右)は細胞膜に沿って拡散を示す。(C) 断食状態の下で、BODIPY-C12 は、セル周辺に穿刺を形成し、LD(左、中央、左下)と共局化しない。SMLM画像は、BODIPY-C12赤(下、右)の穿刺と閉じ込められた痕跡を解決します。(D) ラジアル分布関数(左)は断食時のBODIPY-FAのクラスタリングが高いことを示す。単一分子トラッキングの平均平方変位と時間プロット(右)は断食時にBODIPY-C12の固定化を確認します。スケールバー = 1 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:生きた哺乳類U2OS細胞におけるBODIPY色素のイメージング(A)488 nm励起時のBODIPY-C12の従来の蛍光画像(左)。561 nm励起時のDII状態(右)を用いた対応するSMLM画像は、U2OS細胞におけるDII状態のナノスコピック分布を示す。インセットは、脂質滴の倍率を示す(スケールバー= 500 nm)。(B)488nmの励起でLysoTrackerグリーンを用いたU2OS細胞のリソソームの従来の画像(左)。B561 nmの励起における不動リソソーム(右、スケールバー=5μm)の対応するSMLM画像。インセット:光学的に回折限定リソソーム(スケールバー100nm)のSMLM画像。23°Cの生細胞イメージング溶液にBODIPY-C12画像を記録した。LysoTracker greenを使用したリソソームの画像は、37°Cで10%のウシ胎児血清、4mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を用いた非蛍光性DMEMに記録された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

このプロトコルでは、従来のBODIPYコンジュゲートを使用して、空間解像度の桁違いの改善を伴うSMLM画像を得る方法を実証しました。この方法は、従来のBODIPY色素の以前に報告された赤シフトDII状態を利用することに基づいており、これは二分子的な出会いを通じて一時的に形成される。これらの状態は、特に赤ずれた波長で励起され、検出され、SMLMには十分にまばらで短命です。レーザーパラメータとともにBODIPYモノマーの濃度を調整することで、局在化と信号対雑音の最適な密度を実現できます。我々は、供給および絶食条件下で生きている酵母細胞において、脂肪酸類似体および中性脂質の細胞内分布と移動性を、約30nm分解能(理論上のトンプソンの公式)で解決した。また、BODIPY DII状態の約40%が20Hzで2つ以上のデータ取得フレームにとどまり、単一分子トラッキングが異なる条件下での移動性を定量化することを可能にすることがわかりました。我々の結果は断食時のBODIPY-FAの差異の局在および移動性を示し、脂肪毒性に対する保護メカニズムを示唆する。単一のBODIPY分子を追跡し、異なる代謝状態下で光学回折限界以下のLPDおよびBODIPY-FA穿刺のサイズを解決する能力は、従来のBODIPYコンジュゲートの開発されたSMLM能力でのみ可能です。脂肪酸分布と取り込みの空間調節に関わる正確な分子メカニズムと経路は、今後の研究のテーマです。さらに、U2OS細胞におけるBODIPY-FAおよびリソソームを解決することにより、従来のBODIPYコンジュゲートのSMLM機能を生きた哺乳類細胞に拡張しました。

SMLMのための従来のBODIPYコンジュゲートのDII状態を使用することは、生きている細胞内の特定の分子または細胞コンパートメントを標識する何百もの異なるBODIPY変異体が市販されているので、他のプローブよりも利点を有する。サンプル調製は、洗浄せずにイメージングする前に、低濃度(〜100nM)で染料を添加するのと同じくらい簡単です。時間の経過とともに漂白する他のPALM/STORMプローブとは対照的に、BODIPYモノマーはDII状態の励起の影響を受けず、長期的なイメージングにおいて単一分子信号の枯渇源をほとんど提供しません。DII状態は自発的な二分子的な遭遇のために生じるので、DII状態を使用するSMLMは、点滅23を誘導するために外部に追加されたバッファを必要としない。同様に、新たに合成された光活性化可能なBODIPYバージョン24またはSMLMの一部の従来のBODIPY色素21に必要な高エネルギーの光活性化は必要ないが、これは、長期間のイメージング25,26,26の間に細胞の健康に有害であり得る。さらに、DII状態のSMLMは、単量体濃度に対するDII状態の二次依存性のために、非特異的に相互作用するプローブの固有のバックグラウンド抑制を作成する。したがって、SMLM画像では、単量体信号が検出された従来のプローブと比較して、より高いコントラストが得られます。

BODIPYsは、高い励起力で単一のレーザーでモノマーおよびダイマーの励起を可能にするかすかな抗ストークス蛍光を示す。一方で、この特性は、移動構造を追跡し、解決するために、同時に従来の蛍光とSMLMイメージングのために利用することができます。一方、BODIPY信号が2つの発光チャネルを占めるので、BODIPY DII状態を他のプローブと組み合わせてマルチカラーイメージングを行うのも難しくなります。ただし、図2BでSec63-GFPとBODIPY-C12赤色を使用してプローブを慎重に選択した場合、マルチカラーイメージングが可能です。同様に、図2Cに示すように、mEos2のような他の写真活性化可能なプローブでも、順次2色SMLMが可能です。2色SMLMの他の可能な組み合わせは、ハロータグ27に結合したJF646のような緑色のBODIPYコンジュゲートおよび640 nmの興奮性染料の使用を含む。

要約すると、我々は、生きている酵母および哺乳動物細胞におけるナノスコピック長さスケールでの脂肪酸、中性脂質およびリソソームの時空間分布を調べるために従来のBODIPY色素を用いてSMLM用に最適化されたプロトコルを提示した。マイナーな変更により、このプロトコルは、異なる細胞タイプ間の何百もの他のBODIPYコンジュゲートを有するSMLMにも同様に適用可能である。

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Disclosures

著者らは競合する利益を宣言しない。

Acknowledgments

本論文で報告された研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所が、受賞番号R21GM127965の下で支援した。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BODIPY C12 ThermoFisher D3822 Green fatty acid analog
BODIPY C12 Red ThermoFisher D3835 Red fatty acid analog
BODIPY(493/503) ThermoFisher D3922 Neutral lipid marker
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2010 Cell immobilization on glass surface
Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base US Biological D9515 Amino acids for SCD
Dextrose Sigma-Aldrich G7021 Carbon source for SCD
Eight Well Cellvis C8-1.58-N Chambered Coverglasses
Eight Well, Lb-Tek II Sigma-Aldrich Chambered Coverglasses
ET525/50 Chroma Bandpass filter
ET595/50 Chroma Bandpass filter
ET610/75 Chroma Bandpass filter
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 Serum
FF652 Semrock Beam splitter
FF731/137 Semrock Bandpass filter
FluoroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 Cell culture medium
Hal4000 Zhuang Lab, Harvard University Data acquisition software
Ixon89Ultra DU-897U Andor EMCCD camera for photon detection
Laser 405, 488, 561, 640 nm CW-OBIS Lasers for excitation
Insight3 Zhuang Lab, Harvard University Single molecule localization software
L-Glutamine Gibco 25030-081 Amino acid required for cell culture
live-cell imaging solution ThermoFisher A14291DJ Imaging buffer
Lysotracker Green ThermoFisher L7526 Bodipy based lysosome marker
Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)
Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A Nikon Oil immersion objective
Penicillin streptomycin Gibco 15140-122 Antibiotics
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 Supplement for cell culture
T562lpxr Chroma Beam splitter
Trypsin-EDTA Gibco 15400-054 Dissociation of adherent cell
W303 MATa strain Horizon-Dharmacon YSC1058 Parental yeast strain
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y1250 Nitrogen base without amino-acids
zt405/488/561/640rdc Chroma Quadband dichroic mirror

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生化学、160号、蛍光顕微鏡、超解像顕微鏡、単一分子追跡、単一分子局在化顕微鏡、BODIPY、グランドステートダイマー、酵母、哺乳類細胞
ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート
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Adhikari, S., Banerjee, C., Moscatelli, J., Puchner, E. M. Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking. J. Vis. Exp. (160), e60950, doi:10.3791/60950 (2020).

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