Konvensjonelle BODIPY-konjugater for live-cell superoppløsningsmikroskopi og enkeltmolekylsporing
Summary
Konvensjonelle BODIPY konjugater kan brukes til live-celle single-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) gjennom utnyttelse av deres forbigående forming, rød-forskjøvet bakken tilstand dimmers. Vi presenterer en optimalisert SMLM-protokoll for å spore og løse subcellulære nøytrale lipider og fettsyrer i levende pattedyr og gjærceller på nanoskopisk lengdeskala.
Abstract
Enkel molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) teknikker overvinne den optiske diffraksjon grensen for konvensjonell fluorescens mikroskopi og kan løse intracellulære strukturer og dynamikken i biomolekyler med ~ 20 nm presisjon. En forutsetning for SMLM er fluoroforeer som går fra en mørk til fluorescerende tilstand for å unngå spatio-temporal overlapping av deres punktspredningsfunksjoner i hver av de tusenvis av datainnsamlingsrammer. BODIPYs er veletablerte fargestoffer med mange konjugater som brukes i konvensjonell mikroskopi. Den forbigående dannelsen av rød-forskjøvet BODIPY ground-state dimers (DII) resulterer i lyse enkeltmolekylutslipp slik at enkeltmolekyl lokalisering mikroskopi (SMLM). Her presenterer vi en enkel, men allsidig protokoll for SMLM med konvensjonelle BODIPY konjugater i levende gjær og pattedyrceller. Denne prosedyren kan brukes til å skaffe superoppløseligeII bilder og til å spore enkelt BODIPY-D II-tilstander for å trekke ut spatio-temporal informasjon om BODIPY konjugater. Vi bruker denne prosedyren for å løse lipiddråper (LDer), fettsyrer og lysosomer i levende gjær og pattedyrceller på nanoskopisk lengdeskala. Videre demonstrerer vi multi-farge bildebehandling evne med BODIPY fargestoffer når de brukes sammen med andre fluorescerende sonder. Våre representative resultater viser differensial romlig distribusjon og mobilitet av BODIPY-fettsyrer og nøytrale lipider i gjær under matet og fastende forhold. Denne optimaliserte protokollen for SMLM kan brukes med hundrevis av kommersielt tilgjengelige BODIPY konjugater og er en nyttig ressurs for å studere biologiske prosesser på nanoskalaen langt utover anvendelsene av dette arbeidet.
Introduction
Single-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) teknikker som stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM) og foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) har dukket opp som metoder for å generere superoppløselige bilder med informasjon utover Abbes optiske diffraction grense1,,2 og for å spore dynamikken i enkelt biomolekyler3,4. Et av kravene til sonder som er kompatible med SMLM er muligheten til å kontrollere antall aktive fluorofofager når som helst for å unngå romlig overlapping av deres punktspredningsfunksjoner (PSF). I hver av de tusenvis av datainnsamlingsrammer bestemmes plasseringen av hver fluorescerende fluorofore med ~ 20 nm presisjon ved å tilpasse sin tilsvarende punktspredningsfunksjon. Tradisjonelt har på-off blinkende av fluorofore kontrollert gjennom stokastiske bilderstitching1,,2,,5 eller kjemisk indusert indre blinkende6. Andre tilnærminger inkluderer indusert aktivering av fluorogener ved forbigående binding til et fluorogenaktiverende protein7,,8 og den programmerbare bindingen-unbinding av merkede DNA-oligomerer i total intern refleksjonfluorescens (TIRF) eller lysarkeksitasjon9. Nylig rapporterte vi en ny og allsidig merkingstrategi for SMLM10 der tidligere rapporterte rød-forskjøvet dimeric (DII) tilstander av konvensjonelle bor di-pyromethane (BODIPY) konjugerer11,12,13 er forbigående forming og blir spesielt begeistret og oppdaget med rød-skift bølgelengder.
BodiPYs er mye brukt fargestoffer med hundrevis av varianter som spesifikt etikett sub-cellulære rom og biomolekyler14,,15,,16. På grunn av deres brukervennlighet og anvendelighet i levende celler, er BODIPY-varianter kommersielt tilgjengelige for konvensjonell fluorescensmikroskopi. Her beskriver vi en detaljert og optimalisert protokoll om hvordan hundrevis av kommersielt tilgjengelige BODIPY-konjugater kan brukes til live-celle SMLM. Ved å justere konsentrasjonen av BODIPY monomerer og ved å optimalisere eksitasjon laser krefter, bildebehandling og dataanalyse parametere, høy kvalitet super-oppløsning bilder og enkelt molekyl sporing data er oppnådd i levende celler. Når den brukes ved lav konsentrasjon (25-100 nM), kan BODIPY konjugater samtidig brukes til SMLM i den rødskiftede kanalen og for korrelativ konvensjonell fluorescensmikroskopi i den konvensjonelle utslippskanalen. De oppnådde enkeltmolekyldataene kan analyseres for å kvantifisere den romlige organiseringen av immobile strukturer og å trekke ut de diffusive tilstander av molekyler i levende celler17. Tilgjengeligheten av BODIPY-sonder i både grønne og røde former gjør det mulig å bilde av flere farger når de brukes i riktig kombinasjon med andre kompatible fluorofofager.
I denne rapporten gir vi en optimalisert protokoll for å anskaffe og analysere live-celle SMLM-data ved hjelp av BODIPY-C12,BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rød og lysotracker-grønn i flere farger. Vi løser fettsyrer og nøytrale lipider i levende gjær og pattedyrceller med ~ 30 nm oppløsning. Vi viser videre at gjærceller regulerer den romlige fordelingen av eksternt tilsatte fettsyrer avhengig av deres metabolske tilstand. Vi finner at tilsatt BODIPY-fettsyrer (FA) lokalisere til endoplasmic reticulum (ER) og lipid dråper (LDs) under matet forhold mens BODIPY-FAs danner ikke-LD klynger i plasmamembranen ved faste. Vi utvider videre anvendelsen av denne teknikken til bildelysosomer og LDer i levende pattedyrceller. Vår optimaliserte protokoll for SMLM ved hjelp av konvensjonelle BODIPY konjugater kan være en nyttig ressurs for å studere biologiske prosesser på nanoskalaen med de utallige tilgjengelige BODIPY konjugatene.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen demonstrerte vi hvordan konvensjonelle BODIPY konjugater kan brukes til å skaffe SMLM-bilder med en størrelsesorden forbedring i romlig oppløsning. Denne metoden er basert på å utnytte tidligere rapporterte, rød-forskjøvet DII tilstander av konvensjonelle BODIPY fargestoffer, som forbigående dannes gjennom bimolekylære møter. Disse tilstandene kan være spesielt begeistret og oppdaget med rød-forskjøvet bølgelengder og er sparsomme og kortvarig nok for SMLM. Ved å justere kons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under tildeling nummer R21GM127965.
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
References
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), 4077 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
- Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
- Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
- Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2′-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
- Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
- Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
- Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
- Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
- Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).
