Summary
Konvansiyonel BODIPY konjugatları, geçici olarak oluşan, kırmızı-shifted yer durumu dimerlerinin sömürülmesi yoluyla canlı hücreli tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) için kullanılabilir. Nanoskobik uzunluk ölçeğinde yaşayan memeli ve maya hücrelerindeki hücre altı nötr lipitleri ve yağ asitlerini izlemek ve çözmek için optimize edilmiş bir SMLM protokolü salıyoruz.
Abstract
Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) teknikleri konvansiyonel floresan mikroskobun optik kırınım sınırını aşmak ve hücre içi yapıları ve biyomoleküllerin dinamiklerini ~20 nm hassasiyetle çözebilir. SMLM için bir ön koşul, binlerce veri toplama çerçevesinin her birinde nokta yayma işlevlerinin mekansal-zamansal çakışmasını önlemek için karanlıktan floresan duruma geçiş yapan floroforlardır. BODIPYs konvansiyonel mikroskopikullanılan çok sayıda konjuge ile iyi kurulmuş boyalar vardır. Kırmızı-shifted BODIPY yer-hal dimerlerinin (DII)geçici oluşumu, tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) sağlayan parlak tek molekül salınımı ile sonuçlanır. Burada yaşayan maya ve memeli hücrelerinde geleneksel BODIPY konjugatları ile SMLM için basit ama çok yönlü bir protokol salıyoruz. Bu yordam, süper çözünürlüklü görüntüler elde etmek ve BODIPY konjugalarının mekano-zamansal bilgilerini ayıklamak için tek bodipy-DII durumlarını izlemek için kullanılabilir. Bu işlemi, nanoskobik uzunluk ölçeğinde yaşayan maya ve memeli hücrelerindeki lipid damlacıklarını (LD'ler), yağ asitlerini ve lizozomları gidermek için uyguluyoruz. Ayrıca, diğer floresan problarla birlikte kullanıldığında BODIPY boyaları ile çok renkli görüntüleme yeteneğini gösteriyoruz. Temsili sonuçlarımız, beslenen ve oruç lu koşullarda mayadaki BODIPY-yağ asitlerinin ve nötr lipidlerin diferansiyel uzamsal dağılımını ve hareketliliğini göstermektedir. SMLM için bu optimize edilmiş protokol, ticari olarak kullanılabilen yüzlerce BODIPY konjugasyonuyla kullanılabilir ve bu çalışmanın uygulamalarının çok ötesinde nano ölçekte biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir kaynaktır.
Introduction
Tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) gibi stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ve foto-aktive lokalizasyon mikroskobu (PALM) teknikleri Abbe optik kırınım sınırı1ötesinde bilgi ile süper çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için yöntemler olarak ortaya çıkmıştır1 ,2 ve tek biyomoleküllerin dinamiklerini izlemek için3,4. SMLM ile uyumlu problar için gereksinimlerden biri, nokta yayma fonksiyonlarının (PSF) mekansal çakışmasını önlemek için herhangi bir zamanda aktif florofor sayısını kontrol edebilme yeteneğidir. Binlerce veri toplama çerçevesinin her birinde, her floresan floresan floresan floresan'ın konumu, karşılık gelen nokta yayma fonksiyonuna uygun olarak ~20 nm hassasiyetle belirlenir. Geleneksel olarak, floroforların on-off yanıp stochastic fotoanahtarlama11,2,,5 veya kimyasal olarak intrinsic yanıp sönen6ile kontrol edilmiştir. Diğer yaklaşımlar bir florojen aktive proteingeçicibağlama üzerine florojen indüklenen aktivasyon dahil7 ,8 ve toplam iç yansıma floresan (TIRF) veya hafif levha uyarma etiketli DNA oligomerlerin programlanabilir bağlayıcı-bağlayıcı olmayan9. Son zamanlarda, smlm için yeni ve çok yönlü etiketleme stratejisi bildirdi10 hangi daha önce rapor kırmızı-shifted dimeric (DII) konvansiyonel bor di-pirometan (BODIPY) durumları11,,12,13 geçici olarak şekillendirme ve özellikle heyecanlı olmak ve kırmızı-shifted dalga boyları ile tespit.
BODIPYs yaygın olarak kullanılan boyalar özellikle etiket alt hücresel bölmeleri ve biyomolekülleri yüzlerce ile boyalar14,15,16. Canlı hücrelerde kullanım kolaylığı ve uygulanabilirliği nedeniyle, BODIPY varyantları konvansiyonel floresan mikroskobu için ticari olarak mevcuttur. Burada, yüzlerce ticari olarak kullanılabilen BODIPY konjugatlarının canlı hücreli SMLM için nasıl kullanılabileceğini anlatan ayrıntılı ve optimize edilmiş bir protokol açıklıyoruz. BODIPY monomerlerinin konsantrasyonu ayarı ve uyarma lazer güçleri, görüntüleme ve veri analizi parametreleri optimize edilerek, canlı hücrelerde yüksek kaliteli süper çözünürlüklü görüntüler ve tek molekül izleme verileri elde edilir. Düşük konsantrasyonda (25-100 nM) kullanıldığında, BODIPY konjugatları aynı anda kırmızı kaydırmalı kanalda SMLM ve konvansiyonel emisyon kanalında korgöreceli konvansiyonel floresan mikroskopi için kullanılabilir. Elde edilen tek molekül verileri hareketsiz yapıların mekansal organizasyonunu ölçmek ve canlı hücrelerdeki moleküllerin diffüzive durumlarını ayıklamak için analiz edilebilir17. BODIPY problarının hem yeşil hem de kırmızı formlarda kullanılabilirliği, diğer uyumlu floroforlarla doğru kombinasyonda kullanıldığında çok renkli görüntülemeye olanak tanır.
Bu raporda, bodipy-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 kırmızı ve lisotracker-yeşil birden fazla renk kullanarak canlı hücre SMLM verilerinin elde alınması ve analiz için optimize edilmiş bir protokol sağlık edin. Canlı maya ve memeli hücrelerindeki yağ asitlerini ve nötr lipitleri ~30 nm çözünürlükte çözeriz. Ayrıca maya hücrelerinin metabolik durumlarına bağlı olarak dıştan eklenen yağ asitlerinin mekansal dağılımını düzenlediğini de gösteriyoruz. Eklenen BODIPY-yağ asitlerinin (FA) endoplazmik retikulum (ER) ve lipid damlacıklarına (LD) beslenen koşullar altında lokalize olduğunu, BODIPY-FAs'lerin ise açlık üzerine plazma zarında LD dışı kümeler oluşturduğunu görüyoruz. Bu tekniğin uygulanmasını yaşayan memeli hücrelerindeki görüntü ve ld'lere de genişletiyoruz. Konvansiyonel BODIPY konjugatlarını kullanarak SMLM için optimize edilmiş protokolümüz, mevcut sayısız BODIPY konjugatları ile nano ölçekte biyolojik süreçleri incelemek için yararlı bir kaynak olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Maya klonlama ve endojen etiketleme için lütfen son yayınımız10'abakın.
1. Görüntüleme için maya hücresi örneklerinin hazırlanması
- Bir w303 maya zorlanma bir sıvı gecede kültür hazırlayın. Steril bir ahşap sopa kullanarak, maya ekstresi içeren bir agar plaka maya hücrelerinin küçük bir miktar nokta-pepton-dekstroz sentetik tam dekstroz ~ 2 mL ile bir kültür tüpü içine (SCD) orta. Tüpü gece boyunca 270 rpm ve 30 °C'de sallayarak bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
- SCD'deki hücrelerin sabah 1:50 seyreltilmesini gerçekleştirin. Seyreltilmiş hücreleri 30 °C'de 4 saat boyunca 270 rpm sallayarak inkübatörde kültüre devam edin, böylece hücreler üstel fazda büyüyebilir ve ~0,6 optik yoğunluğa (OD) ulaşabilirsiniz.
NOT: İşlem burada hangi metabolik durum üzerinde çalışıldığına bağlı olarak değişebilir. BODIPY konjugatları üstel büyüme aşamasında ki hücreleri gerektirmez. Ancak, sabit faz sırasında ölü hücrelerden gelen otofloresan farkında olun, tek BODIPY-DII yayıcılar analiz etmek için çok güçlü bir arka plan sinyali neden olabilir gibi. - Açlık hücrelerini incelemek için, medya alışverişi olmadan 2 gün boyunca maya kültürünü büyütün.
- Hücreleri kaplamadan ~30 dakika önce oda sıcaklığında deiyonize H2O'da 80 mg/mL steril Concanavalin A (ConA) ile odacıklı bir kapak camı kuluçkaya yatırın. 30 dakika sonra, deiyonize H2O ile üç kez kapak camı yıkayın.
- Görüntülemeden önce ~30 dk'da, pipet odacıklı kapak camındaki hücreler, ~0,12 optik yoğunluk elde etmek için doğru taze SCD hacmine sahip (genellikle 240 μL SCD'de OD~0,6'da 60 μL maya kültürü). Hücreleri yerleşmek ve 30 dakika cona yüzeyine yapışır.
- ~ 100 nM son konsantrasyonunda odacıklı coverglass doğrudan istenilen BODIPY eşlenik ekleyin.
NOT: Belirli bir hücresel bölmedeki BODIPYs yerel yoğunluğuna bağlı olarak bir BODIPY konsantrasyon optimizasyonu deneyi gerekebilir.
2. SMLM görüntüleme için memeli hücrelerinin hazırlanması
- Bir T25 şişesinde %10 fetal sığır serumu, 4 mM glutamin, 1 mM sodyum pirüuvat ve %1 penisilin-streptomisin antibiyotikler ile floresan olmayan DMEM'deki memeli U2OS hücrelerini koruyun.
NOT: DMEM'de %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin antibiyotikleri ile hücreler de tutulabilir, ancak otofloresan olmayan bir solüsyon ile görüntülemeden önce ortamın değiştirilmesi gerekmektedir. - Hücreleri %70-80'lik bir birleşmeyle 8 kuyunun tek bir kuyusu içinde 1:5'te bölün. Kültür görüntüleme den önce 12-24 saat için 8-iyi plaka hücreleri.
- BODIPY-C12,LysoTracker Yeşil veya başka bir BODIPY 100 nM (dimetil sülfoksit stok çözümleri [DMSO]) 10 dk önce görüntüleme son konsantrasyonunda eşlenik ekleyin. Bu süre istenilen deneye göre değişebilir.
NOT: Canlı hücre görüntüleme solüsyonu kullanılarak ortam sıcaklığında (23 °C) görüntüleme yapılabilir. Ancak, %10 fetal sığır serumu, 4 mM glutamin, 1 mM sodyum pirüuvat ve %1 penisilin-streptomisin antibiyotiklerile karıştırılarak floresan olmayan DMEM ile %37 °C ve %5 CO2'de görüntüleme, hücreleri fizyolojik koşullara yakın tutmak ve biyolojik sonuçlara varmak için tercih edilir.
3. Ekipman hazırlama
- Kullanılan BODIPY emisyon rengine göre emisyon yoluna uygun filtre kümelerini monte edin.
NOT: Dört bantlı dikroik ayna (zt/405/488/561/640rdc) önce uyarma yı emisyon ışığından ayırır. Yeşil emisyon (525 nm) ve kırmızı emisyon (595 nm) daha sonra bir dichroic uzun pas Kiriş bölücü (T562lpxr) ve band-pass filtreleri ET525/50 yeşil kanal ve ET 595/50 kırmızı kanal da takip tarafından bölünür. İki kanal daha sonra aynı kamera çipinin farklı alanlarına yansıtılır. Benzer şekilde, kırmızı emisyon (595 nm) ve uzak kırmızı emisyon ilk dichroic uzun pas kiriş bölücü (FF652-Di01) tarafından daha sonra bant-pass filtreleri ET 610/75 kırmızı ve FF731/137 uzak kırmızı kanal da ayrılır. - Mikroskop, mikroskop aşaması, lazerler (488 nm, 561 nm) ve kamerayı açın. Burada mükemmel bir odak lama sistemine sahip ters bir mikroskop ve -68 °C'ye soğutulmuş bir EMCCD kamera kullanılmaktadır.
- Mikroskop hedefi üzerine bir damla daldırma yağı ekleyin.
- Parlak alan görüntüleme, lazer güçleri, lazer panjurlar ve görüntüleme için kamera ayarları için LED ışığını kontrol eden Hal4000 yazılımını (Malzeme Tablosu'nabakın) açın. EMCCD kazancını 30'a, kamera sıcaklığını -68 °C'ye ayarlayın. 20 Hz'de film kaydetmek için kamerayı ve ilgili yazılımı hazırlayın.
NOT: Bu teknik, foto-aktive lokalizasyon mikroskobu (PALM) ve stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) görüntüleme yeteneğine sahip geniş alan mikroskobu için geçerlidir. İlgili yazılımlar değişebilir. - Mikroskop kademeli ısıtıcıyı açın ve 37 °C'lik bir sıcaklığa ve %5 CO2 seviyesine ayarlayın. Nesnel düzeltme yakasını buna göre ayarlayın.
- Numuneyi mikroskop aşamasına monte edin ve odaklama sistemi devreye girene kadar odaklanın. Görünüm alanında sağlıklı hücreler görünene kadar sahne denetleyicisini kullanarak sahneyi taşıyın.
NOT: Oda sıcaklığında maya hücreleri ile görüntüleme için ısıtıcıyı veya CO2 kontrolünü açmanız gerekmez. - Monomerlerin uyarılması için uygun lazerleri ve dimerleri açın. BODIPY yeşil veya LysoTracker yeşil için, biz SMLM için DII durumları heyecanlandırmak için 561 nm lazer ve geleneksel floresan için monomerler heyecanlandırmak için 488 nm lazer kullanın.
NOT: BODIPY kırmızısı için, SMLM için DII durumlarını heyecanlandırmak için 640 nm lazer ve konvansiyonel floresan için monomerleri heyecanlandırmak için 561 nm lazer kullanın. BODIPY kırmızısı için, 561 nm ve 640 nm lazer güçlerini ayarlayarak kırmızı kanaldaki toplu floresanve uzak kırmızı kanaldaki tek molekül patlamalarını görselleştirin. 561 nm için tipik güç ~ 0.06 W/cm2 ve ~ 5 kW/ cm2 640 nm için. BODIPY yeşil için, aynı zamanda 561 nm uyarma altında yeşil emisyon kanalında geleneksel floresan görmek için bekliyoruz. BODIPY kırmızı için, 640 nm uyarma altında kırmızı kanalda geleneksel floresan görmek için bekliyoruz. Bu sinyal anti-Stokes salınımından kaynaklanır, bu da sürekli lazer uyarma ile monomer/dimer co-lokalizasyon görüntüleri için yararlı hale gelir.
4. Veri toplama
- Monomerlerin ve dimerlerin uyarılması için lazer deklanşör dizilerini yükleyin.
NOT: Biz genellikle 561 nm'de dokuz tek moleküllü uyarma çerçevesi ve ardından 488 nm'de bir konvansiyonel uyarma çerçevesi kullanırız. Bu daha parlak bir konvansiyonel floresan sinyali sunar ve çok renkli görüntüleme uygulamalarında kırmızı tek moleküllü algılama kanalına yeşil floresan protein (GFP) gibi başka bir 488 nm uyarılabilir floresan florofor sızıntısını önler. Alternatif olarak, 561 nm lazeri sürekli olarak açın ve daha kısa dalga boyu kanalındaki geleneksel görüntüler için anti-Stokes salınımına güvenin. - Lazer güçlerini, tek moleküllü floresan patlamalarının 561 nm uyarma altında kırmızı kaydırmalı emisyon kanalında algılanıp 488 nm uyarma ile yeşil emisyon kanalında görünmesi gibi ayarlayın. 561 nm lazerin tipik lazer güçleri SMLM için 0,8-1 kW/cm2, geleneksel floresan görüntüleme modunda 488 nm lazer için 0,035-0,07 W/cm2 civarında olacaktır.
- Filmler için bir hedef klasör seçin ve süper çözünürlüklü görüntüleri yeniden oluşturmak için yeterli yerelleştirmeleri toplamak için 5.000-20.000 edinme çerçeveleri kaydedin.
- Daha fazla hücreden veri toplamak için farklı görüş alanlarına geçin ve yukarıdaki adımları yineleyin.
5. Veri analizi ve tek moleküllü izleme
- Filmi bir SMLM analiz yazılımına yükleyin.
NOT: Herhangi bir yazılım18 kullanılabilir. INSIGHT kullanıyoruz (Malzeme Tablosu'nabakın) ve imageJ (Fiji) için ThunderSTORM19 eklentisini kullanarak sonuçları çapraz doğrulıyoruz. - Filmi görsel olarak tarayanın ve tek moleküllü floresan yanıp sönme nin görünür olması gibi kontrast ayarlarını ayarlayın. Gerekirse, numunenin parçaları sürekli floresan ise, SMLM veri analizi için bölge veya çerçeve aralığını kısıtlayın.
- 2D Gaussian PSF'lere (RoI: piksel boyutu 160 nm, genişlik 260-650 nm, yükseklik > 50 foton) takmak için tek molekül tanımlama parametrelerini ayarlayın. Tanımlama parametrelerini kontrol etmek ve farklı tek molekülfloresan patlamalarını güvenilir bir şekilde tespit etmek için bazı örnek kareler aracılığıyla görsel olarak tarayabilirsiniz (Bkz. Şekil 1C).
NOT: Yükseklik ve genişlik gibi belirli tanımlama parametreleri, görsel olarak algılanan tek moleküllü floresan sinyallerinin tanınmasını optimize etmek için biraz ayarlanabilir. - SMLM görüntü analizini en iyi leştirilmiş tanımlama parametreleriyle gerçekleştirin ve ardından her bir molekülü algılanan foton sayısının ters kare köküyle ağırlığıyla genişliği 2D Gaussian olarak işleyin.
- Verilerin kalitesini değerlendirin. Zaman içinde daha belirli durumlarda tek molekül dağılımları gözlemlemek için sınırlı çerçeve aralıkları kullanın. Bu veri toplama sırasında organel hareketi için hesap olabilir.
- Molekül dağılımlarının uzamsal dağılımını ve dinamiklerini daha fazla analiz etmek için, yerelleştirmelerin koordinatlarını, çerçevelerini, fotonları, genişliklerini ve yüksekliklerini içeren elde edilen molekül listesini dışa aktarın. Molekül listesini özel yazılı analiz yordamlarında içe aktarın.
- Tek molekül dağılımının mekansal bilgilerini elde etmek için, radyal mesafe20'ninbir fonksiyonu olarak yerelleştirmelerin yoğunluğunu temsil eden radyal dağılım fonksiyonunu (r) hesaplayın. Ρ(r) elde etmek için, tüm yerelleştirmelerin benzersiz çift eki mesafelerini hesaplamak için, histogramı ri yüksekliği H(ri)ile ortalanmış kutularla ve bir genişlik dr ile inşa edin ve 2πri*dr ile bölün; (ρ(ri) = H(rii)/π(r i +dr)2-ri2).i Radyal dağılım işlevi daha sonra kümeleme derecesini ve kümelerin karakteristik boyutunu ölçmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir.
- Moleküllerin difüzyonu hakkında dinamik bilgi edinmek için, tek molekül izleri oluşturmak için ardışık veri toplama çerçevelerinde örneğin 3 piksel (0,48 μm) içinde görünen yerelleştirmeleri bağla.
NOT: Bağlantı mesafesi moleküllerin difüzyonuna ve lokalizasyon yoğunluğuna bağlıdır. Maksimum bağlantı mesafesi, her karedeki yerelleştirmelerin yoğunluğu analiz edilerek tahmin edilebilir21,22. Ortalama yoğunluk 0.043 lokalizasyon başına 2 olarakbelirlenmiştir; böylece 0.48 μm yarıçapı farklı moleküllerin birbirine bağlı olmadığından emin olmak için yeterince düşük yoğunluktaydı. - Ortalama kare deplasman (MSD) ve Δt arsa oluşturmak için en az üç gecikme kez süren birden fazla izlemeδt farklı gecikme süreleri için yer değiştirmeleri. Ortalama difüzyon katsayısını hesaplamak için MSD vs. Δt eğrisini MSD = 4DΔt + σ2 denklemine sığdırın ve ortalama difüzyon katsayısı D3'ühesaplayabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, yukarıdaki protokole dayalı BODIPY konjugatları kullanarak SMLM için optimize edilmiş bir numune hazırlama, veri toplama ve analiz prosedürü saçıyoruz (Şekil 1A). SMLM verilerinin elde edilip analiz edilebilmek için iş akışına bir örnek göstermek için, optik kırınım sınırının(Şekil 1B-F)altındaki LD'leri çözmek için mayada BODIPY (493/503) kullanırız. Bodipy'nin GFP, mEos2 gibi diğer problarla birlikte farklı çok renkli görüntüleme modlarına örnekler Şekil 2'degösterilmiştir. Biz ~ 48 h için aynı ortamda onları büyüyerek maya metabolik durumu manipüle ve bodipy-C12 beslenen koşullar altında LDs içine dahil aksine oruç üzerine hücre çevresinde hareketsiz olmayan LD kümeleri formları göstermektedir(Şekil 3). BODIPY konjugatlarının SMLM kapasitesini memeli hücrelerine daha da genişletmek için, canlı U2OS hücrelerinde BODIPY-C12 ve LysoTracker-green görüntülerini görüntüliyoruz(Şekil 4).
Şekil 1: Bodipy boyaları kullanılarak SMLM veri toplama ve analizinin optimizasyonu. (A) Tek molekülfloresan sinyallerini optimize etmek ve BODIPY konjugatörlerinden SMLM verilerinin işlenmesi sonrası için iş akışı. (B) LED görüntü (solda), geleneksel floresan görüntü (orta, uyarma: 488 nm, emisyon: 525 nm) ve anti-Stokes görüntü (sağ, uyarma: 561 nm, emisyon: 525 nm) LD marker BODIPY (493/503) ile boyanmış maya hücreleri. (C) Tek SMLM çerçeveler singe BODIPY DII yayıcılar gösteren (uyarma: 561 nm, emisyon: 595 nm) çok düşük yoğunlukta (sol), optimal yoğunluk (orta) ve çok yüksek yoğunlukta (sağ). (D) SMLM analiz parametrelerinin optimizasyonu. Çok yüksek foton sayısı eşiği ile, yazılım geçerli tek molekül sinyalleri özlüyor (sol), optimal foton eşiği (orta) ile tüm molekülleri algılar ve çok düşük foton eşikleri (sağ) ile yanlış yerelleştirmeler algılar. (E) BODIPY SMLM görüntü (493/503) 125 nm ortalama çapı ile LDs (sol, zoom) boyutunu çözer. (F) Tek molekül takibi, BODIPY(493/503) içinde lds (sol) sınırlı difüzyon ortaya koymaktadır. İzler, LD'lerin içinde alt-diffusive davranış sergileyen MSD ve zaman eğrisini hesaplamak için kullanılır (sağda). Ölçek çubuğu = 1 μm, yakınlaştırma = 100 nm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Canlı hücrelerde BODIPY konjugatları kullanılarak çok renkli SMLM görüntüleme. (A) BODIPY-C12'nin 488 nm uyarma altında konvansiyonel görüntüsü (solda). 561 nm uyarma altında BODIPY-C12 DII durumları kullanarak karşılık gelen SMLM görüntü (orta) ve zoom (sağda) ortaya BODIPY-C12 ortaya çıkan LDs. (B) 488 nm uyarma altında Sec63-GFP ile etiketlenmiş ER konvansiyonel floresan görüntü (solda). Aynı anda 640 nm uyarma (sağda) kullanarak 561 nm uyarma (orta) ve SMLM görüntü ile BODIPY-C12 kırmızı konvansiyonel floresan görüntü kaydedildi. (C) Sıralı iki renkli SMLM görüntüleme Sec63-mEos2 ve BODIPY-C12 yeşil DII durumları. İlk olarak, mEos2 yüksek 405 nm fotoaktivasyon ve 561 nm uyarma (solda) ve ardından 405 nm aktivasyon (orta) olmadan uzun veri toplama ile görüntülenir. Ölçek çubuğu = 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Maya hücrelerinde oruç üzerine diferansiyel yağ asidi dağılımı. (A) SCD ortamındaki büyüme süresine göre farklı metabolik durumları (beslenen ve oruç lu durum) tanımlayan şema. B) Konvansiyonel floresan görüntüleri (üstte) BODIPY-C12 kırmızısı BODIPY (493/503) ile birlikte, DD'lere dahil olduğunu gösteren beslenen koşullar altında birlikte lokalize olduğunu göstermektedir. SMLM görüntü (alt, sol) lds yoğun BODIPY-C12 puncta gösterir ve tek molekül izleri (alt, sağ) hücresel membranlar boyunca difüzyon sergiler. (C) Oruç altında, BODIPY-C12 hücre çevresinde lds ile eş-lokalize olmayan puncta formları (üst: sol, orta, sol). SMLM görüntü BODIPY-C12 kırmızı (alt, sağ) puncta ve sınırlı izleri çözer. (D) Radyal dağılım fonksiyonu (solda) oruçlurken BODIPY-FAs'ın daha yüksek kümelenmesini gösterir. Tek molekül izlemenin ortalama kare deplasmanı ve zaman çizimi (sağda) bodipy-C12'nin oruç üzerine hareketsizliğini doğrular. Ölçek çubuğu = 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Canlı memeli U2OS hücrelerinde BODIPY boyalarının görüntülenmesi. (A) BODIPY-C12'nin 488 nm uyarma da konvansiyonel floresan görüntüsü (solda). 561 nm uyarmada DII durumlarını (sağda) kullanan ilgili SMLM görüntüsü, U2OS hücresindeki DII durumlarının nanoskobik dağılımını gösterir. Insets lipid damlacıkları büyütme (ölçek çubuğu = 500 nm) göstermektedir. (B) 488 nm uyarma (solda) lysoTracker yeşil kullanarak U2OS hücrelerinde lyzozomların konvansiyonel görüntü. 561 nm uyarma da hareketsiz lizozomların (sağ, ölçek çubuğu = 5 μm) ilgili SMLM görüntüsü. Inset: Optik kırınım sınırlı lizom (ölçek çubuğu 100 nm) SMLM görüntü. BODIPY-C12 görüntüleri 23 °C'de canlı hücre görüntüleme çözeltisinde kaydedildi. LysoTracker yeşili kullanan lysoTracker'ların görüntüleri floresan olmayan DMEM'de %10 fetal sığır serumu, 4 mM glutamin, 1 mM sodyum pirüuvat ve %1 penisilin-streptomisin antibiyotikler ile 37 °C olarak kaydedildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, geleneksel BODIPY konjugatlarının uzamsal çözünürlükte büyüklük iyileştirme sisiyle SMLM görüntülerini elde etmek için nasıl kullanılabileceğini gösterdik. Bu yöntem, daha önce rapor edilmiş, kırmızı yalıtılı DII durumları geleneksel BODIPY boyalar, geçici olarak iki moleküler karşılaşmalar yoluyla form sömürü dayanmaktadır. Bu durumlar özellikle heyecanlı ve kırmızı kaymış dalga boyları ile tespit edilebilir ve seyrek ve SMLM için yeterince kısa ömürlü. BODIPY monomerlerinin konsantrasyonu lazer parametreleri ile birlikte ayarı ile lokalizasyonların ve sinyal-gürültünün optimum yoğunluğu sağlanabilir. Yağ asidi analoglarının ve nötr lipidlerin hücre içi dağılımını ve hareketliliğini ~ 30 nm çözünürlükte (teorik Thompson formülü) beslenen ve oruç lu koşullarda yaşayan maya hücrelerinde çözdük. Ayrıca BODIPY DII devletlerinin ~% 40 20 Hz iki veya daha fazla veri toplama çerçeveleri için kalmak, farklı koşullar altında hareketlilik ölçmek için tek molekül izleme sağlayan bulundu. Sonuçlarımız bodipy-FAs'ın oruçlu olarak diferansiyel lokalizasyonunu ve hareketliliğini göstermekte ve lipotoksisiteye karşı bir koruma mekanizması önermektedir. Tek BODIPY moleküllerini takip etme ve farklı metabolik durumlar altında optik kırınım limitinin altındaki LD'lerin ve BODIPY-FA puncta'nın boyutunu çözme yeteneğimiz ancak konvansiyonel BODIPY konjugatörlerinin geliştirilmiş SMLM yeteneği ile mümkündür. Yağ asidi dağılımı ve alımının mekansal düzenlenmesinde yer alan moleküler mekanizmalar ve yollar gelecekteki çalışmalarımızın konusudur. Ayrıca, U2OS hücrelerindeki BODIPY-FAs ve lizozomları çözerek, geleneksel BODIPY konjugatlarının SMLM yeteneğini canlı memeli hücrelerine genişlettik.
SMLM için geleneksel BODIPY konjugatörlerinin DII durumlarının kullanılması, canlı hücrelerdeki belirli molekülleri veya hücresel bölmeleri etiketleyen yüzlerce farklı BODIPY varyantı ticari olarak mevcut olduğundan, diğer problara göre avantajlara sahiptir. Numune hazırlama, herhangi bir yıkama olmadan görüntülemeden önce boyayı düşük (~100 nM) konsantrasyonlarda eklemek kadar kolaydır. Zaman içinde ağartıcı olan diğer PALM/STORM sondalarının aksine, BODIPY monomerleri DII durumlarının uyarılmasından etkilenmezler ve bu nedenle uzun süreli görüntülemede tek molekül sinyalleri için neredeyse hiç tükenmemiş bir kaynak sağlarlar. DII durumları spontan iki moleküler karşılaşmalar nedeniyle ortaya çıkalı olduğundan, DII durumlarını kullanan SMLM yanıp sönme23'ütetiklemek için harici olarak eklenen tampon gerektirmez. Benzer şekilde, yeni sentezlenen fotoğraf aktivasyon bodipy sürümleri için gerekli olduğu gibi yüksek enerjili foto-aktivasyon için gerek yoktur24 veya Bazı geleneksel BODIPY boyalar SMLM21, uzun süreli görüntüleme sırasında hücre sağlığı için zararlı olabilir25,26. Ayrıca, DII durumları ile SMLM monomer konsantrasyonu DII devletlerin kuadratik bağımlılığı nedeniyle non-özellikle etkileşim probları doğal bir arka plan bastırma oluşturur. Bu nedenle, SMLM görüntülerde monomerik sinyali algılanan geleneksel problara kıyasla daha yüksek bir kontrast elde edilir.
BODIPYs yüksek uyarma gücü tek bir lazer ile monomerler ve dimers uyarma sağlayan soluk bir anti-Stokes floresan sergiler. Bir yandan, bu özellik aynı anda konvansiyonel floresan ve SMLM görüntüleme için izleme ve hareketli yapıları çözmek için kullanılabilir. Diğer taraftan, BODIPY sinyali iki emisyon kanalını kaplar gibi, çok renkli görüntüleme için diğer problar ile BODIPY DII durumları birleştirmek zorlaştırır. Ancak, problar Şekil 2B'de Sec63-GFP ve BODIPY-C12 kırmızısı ile gösterildiği gibi özenle seçildiğinde çok renkli görüntüleme mümkündür. Benzer şekilde, şekil 2C'degösterildiği gibi, sıralı iki renkli SMLM, mEos2 gibi diğer foto-aktive edileme probları ile mümkündür. İki renkli SMLM için diğer olası kombinasyonlar yeşil BODIPY konjugatve 640 nm uyarılabilir boyalar jf646 gibi halo etiketi27bağlı kullanımı içerir.
Özetle, yaşayan maya ve memeli hücrelerinde nanoskobik uzunluk ölçeğinde yağ asitleri, nötr lipidler ve lizozomların sabır-temporal dağılımını araştırmak için geleneksel BODIPY boyaları kullanarak SMLM için optimize edilmiş bir protokol sunduk. Küçük değişikliklerle, bu protokol farklı hücre türlerinde yüzlerce diğer BODIPY konjugatıyla Birlikte SMLM için eşit derecede uygulanabilir olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.
Acknowledgments
Bu yayında bildirilen araştırma, R21GM127965 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror |
References
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).
- Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
- Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
- Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
- Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
- Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
- Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
- Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
- Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
- Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).
