Summary
Præsenteret her er en protokol til at evaluere hæmning effekten af kemiske forbindelser mod in vitro intracellulære vækst af Toxoplasma gondii ved hjælp af en luciferase-baseret vækst assay. Teknikken anvendes til at bekræfte hæmningspecificitet ved genetisk sletning af det tilsvarende målgen. Hæmning en LHVS mod TgCPL protease evalueres som et eksempel.
Abstract
Toxoplasma gondii er en protozoer patogen, der i vid udstrækning påvirker den menneskelige befolkning. De nuværende antibiotika, der anvendes til behandling af klinisk toxoplasmose er begrænsede. Desuden, de udviser bivirkninger i visse grupper af mennesker. Derfor opdagelse af nye terapeutiske for klinisk toxoplasmose er bydende nødvendigt. Det første skridt i nye antibiotika udvikling er at identificere kemiske forbindelser, der viser høj effekt i hæmning af parasitvækst ved hjælp af en høj gennemløb screening strategi. Som et obligat intracellulært patogen kan Toxoplasma kun replikere i værtsceller, hvilket forbyder brugen af optiske absorbansmålinger som en hurtig indikator for vækst. Præsenteret her er en detaljeret protokol for en luciferase-baseret vækst analyse. Som et eksempel, denne metode bruges til at beregne fordobling tid af vilde-type Toxoplasma parasitter og måle effekten af morflære-leucyl-homophenyl-vinyl sulfon phenyl (LHVS, en cystein protease-målretning sammensatte) med hensyn til hæmning af parasitten intracellulær vækst. Også beskrevet, er en CRISPR-Cas9-baseret gen sletning protokol i Toxoplasma ved hjælp af 50 bp homologe regioner for homologi-afhængige rekombination (HDR). Ved at kvantificere hæmningseffekten af LHVS i vildtype og TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-lignende protease)-mangelfuld parasitter, er det påvist, at LHVS hæmmer vildtype parasit vækst mere effektivt end Δcpl vækst, hvilket tyder på, at TgCPL er et mål, lHVS binder sig til i Toxoplasma. Den høje følsomhed og nem betjening af denne luciferase-baserede vækstanalyse gør den velegnet til overvågning af Toxoplasma-spredning og evaluering af lægemidlets effektivitet på en høj gennemløbsmåde.
Introduction
Toxoplasma gondii er en meget vellykket forpligte intracellulære parasit, der inficerer cirka en tredjedel af den menneskelige befolkning. Denhøje transmissionshastighed skyldes hovedsagelig dens forskellige transmissionsveje, herunder forbrug af utilstrækkeligt kød, eksponering for pattedyrsreservoirer og medfødt transmission under fødslen. T. gondii forårsager hovedsagelig opportunistiske infektioner , der kan føre til alvorlig sygelighed og dødelighed hos immunkompromitterede personer1,2,3,4,5,6. De antibiotika , der i øjeblikket anvendes til behandling af akut toxoplasmose, er særligt ineffektive til behandling af medfødte og latente infektioner og forårsager alvorlige reaktioner hos nogle personer3,7,8. Således er der et presserende behov for at identificere nye terapeutiske eksisterer. Forståelse af forskellene i subcellulære processer i Toxoplasma og dets vært vil bidrage til at identificere potentielle narkotika mål. Derfor er der behov for effektive og bekvemme genommanipulationsteknikker for at undersøge rollerne af de enkelte gener i Toxoplasma. Derudover, Toxoplasma tilhører phylum Apicomplexa, som omfatter flere andre væsentlige menneskelige patogener, såsom Plasmodium spp. og Cryptosporidium spp. Derfor kan Toxoplasma bruges som en model organisme til at hjælpe med at studere grundlæggende biologi i andre apicomplexan parasitter.
For at identificere nye antibiotika mod mikrobielle patogener udføres der i første omgang screening af et bibliotek med kemiske forbindelser med høj gennemløb for at bestemme deres effektivitet i undertrykkelsen af mikrobiel vækst. Indtil videre er der udviklet flere mikropladebaserede vækstanalyser til måling af intracellulær vækst af T. gondii (dvs. radioaktiv3H-uracil inkorporering-baseret kvantificering9, kvantitativ ELISA-baseret parasitpåvisning ved hjælp af T. gondii-specifikke antistoffer10,,11, reporter proteinbaseret måling ved hjælp af β-galactosidase eller YFP-ekspres Toxoplasma stammer12,,13, og en nyligt udviklet højt indhold billeddannelse assay14).
Disse individuelle strategier har alle unikke fordele; visse begrænsninger begrænser dog også deres anvendelse. For eksempel, da Toxoplasma kun kan replikere inden for nucleated dyreceller, autofluorescens og ikke-specifik binding af anti-T. gondii antistoffer til værtsceller forårsage interferens i fluorescens-baserede målinger. Desuden kræver brugen af radioaktive isotoper særlig sikkerhedsoverensstemmelse og potentielle sikkerhedsproblemer. Nogle af disse analyser er mere velegnede til at vurdere væksten på et enkelt tidspunkt i stedet for løbende overvågning af væksten.
Præsenteret her er en luciferase-baseret protokol for kvantificering af intracellulære Toxoplasma vækst. I en tidligere undersøgelse blev Nanoluc luciferase-genet klonet under Toxoplasma tubulinpromotor, og denne luciferase ekspressionskonstruktion blev transfected til vilde (RHΔku80Δhxg stamme) parasitter for at skabe en RHΔku80Δhxg::NLuc stamme (benævnt RHΔku80::NLuc herefter)15. Denne stamme tjente som forældrenes stamme for intracellulær vækst bestemmelse og gensletning i denne undersøgelse. Ved hjælp af RHΔku80::NLuc stamme, parasit vækst i human forhuden fibroblaster (HFFs) blev overvåget over en 96 h periode efter infektion til at beregne parasit fordobling tid.
Desuden kan lhvs hæmningseffekt mod parasitvækst bestemmes ved at plotte Toxoplasma-vækstrater i forhold til serielle LHVS-koncentrationer for at identificere IC50-værdien. Tidligere litteratur har rapporteret, at TgCPL er et vigtigt mål for LHVS hos parasitter , og at behandling med LHVS nedsætter udviklingen af akutte og kroniske Toxoplasma-infektioner 16,17,18,19. Derudover blev RHΔku80::NLuc brugt som forældrestamme for genommodifikation for at generere en TgCPL-mangelfuldstamme (RHΔku80Δcpl::NLuc), og hæmningen af LHVS blev målt i forhold til denne mutant. Ved at observere en upshift af IC50 værdier for LHVS i TgCPL-mangelfuldparasitter i forhold til WT stamme, blev det valideret, at TgCPL er målrettet af LHVS in vivo.
I denne protokol, RHΔku80::NLuc bruges som forældrenes stamme, som mangler en effektiv ikke-homolog end-sammenføjning vej (NHEJ), hvilket letter dobbelt crossover homologi-afhængige rekombination (HDR)20,21. Derudover er 50 bp homologe regioner flankeret i begge ender af en lægemiddelresistenskassette af PCR. PCR-produktet fungerer som en reparationsskabelon til at fjerne hele genlocus via HDR ved hjælp af CRISPR-Cas9-baserede genomredigeringsværktøjer. Sådanne korte homologe regioner kan nemt indarbejdes i primere, hvilket giver en bekvem strategi for produktion af reparationsskabelonen. Denne protokol kan ændres til at udføre universel gensletning og endogen genmærkning.
For eksempel, i vores seneste publikation, tre protease gener, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-lignende protease), og TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-lignende protease 1), blev genetisk ablated i TgCRT (Toxochloroquine-resistens transportør)-mangelfuld parasitter ved hjælp af denne metode15. Derudover blev TgAMN (et formodet aminopeptidmiddel N [TgAMN, TGGT1_221310]) endogent mærket15. Lourido-laboratoriet rapporterede også ved hjælp af korte homologe regioner i intervallet 40-43 bp til indførelse af stedstyret genmutation og endogen genmærkning i Toxoplasma-genomet ved hjælp af en lignende metode22. Disse vellykkede genom modifikationer tyder på, at en 40-50 bp homolog region er tilstrækkelig til effektiv DNA rekombination i TgKU80-mangelfuldstamme, som i høj grad forenkler genom manipulation i Toxoplasma gondii.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toxoplasma gondii er kategoriseret i risikogruppe 2 og skal håndteres på biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2). Protokollen er blevet gennemgået og godkendt af Udvalget for Institutionel Biosikkerhed ved Clemson University.
1. Luciferase-baserede Toxoplasma vækst assay
- Frø human forhuden fibroblaster (HFFs) 1 uge før parasitten inokulering for at sikre, at værtsceller er fuldt sammenflydende. Udfør en mock assay i en gennemsigtig plade for at sikre, at parasitter forbliver intracellulære i hele evalueringsperioden.
BEMÆRK: Her udføres analysen i 96 brøndmikroplader. Ifølge eksperimentelle behov, kan det skaleres op til 384 eller 1536 godt mikroplader. - Toxoplasma-parasitter overføres til flydende HFF2 dage før brug ved at overføre ~0,3-0,4 ml fuldt lysede parasitter til en T25-kolbe. Inkuber inficerede værtsceller ved 37 °C med 5% CO2 i 2 dage.
- Sprøjte 5 ml frisklysede parasitter gennem en 21 G sikkerhedsnål 5x for at befri intracellulære parasitter, derefter passere gennem et 3 μm filter for at fjerne værtscelleaffald. Skyl restparasitter ud af kolben med 7 ml fenolrødfrit D10-medium, hvorefter filteret passerer gennem filteret igen.
- Der centrifugeres parasitter ved 1000 x g i 10 min ved stuetemperatur (RT). Hæld supernatanten af og resuspender pellet i 10 ml phenol rød-fri D10 medier.
- Tæl parasitter ved hjælp af et hæmocytometer til at bestemme koncentrationen.
- Fortyndede parasitter til 1 x 104 parasitter/ml for den vilde type (WT) stamme. For vækst-mangelfuld parasit stammer, øge koncentrationen i overensstemmelse hermed at observere en betydelig stigning i luciferase signaler.
- Aspirate medier omhyggeligt fra 96 godt mikroplader præ-seedede med HFFs og pode 150 μL af parasitten resuspension i brønde i et format på tre kolonner og fem rækker, som repræsenterer tre tekniske replikater og fem tidspunkter.
- Mikropladen inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 4 timer.
- Aspirate medier omhyggeligt fra brøndene for at fjerne ikke-invaderede parasitter, derefter fylde brønde med RT phenol rød-fri medier i hver række (bortset fra den første række).
- Der blandes lige store mængder PBS- og 2x luciferase-analysebuffer, og luciferasesubstratet fortyndes til 12,5 μM.
- Der tilsættes 100 μL fortyndet luciferasesubstrat i hver brønd i den øverste række. Mikropladerne på RT inkuberes i 10 minutter, så cellerne kan lyse helt.
- Mål luciferaseaktiviteten ved hjælp af en mikropladelæser. Pladelæserindstillingerne er angivet i tabel 1. Hver læsning repræsenterer det oprindelige antal invaderede parasitter på 4 h post-infektion.
- Gentag trin 1.9-1.12 for hver række hver 24 timer i 4 dage uden at ændre mediet. Disse aflæsninger afspejler det samlede antal replikerede parasitter ved 24 h, 48 h, 72 h og 96 h post-infektion.
- Beregn de gennemsnitlige aflæsninger på hvert tidspunkt og dividere dem med den gennemsnitlige aflæsninger på 4 h for at bestemme foldændringer i parasitvækst over tid.
- Plotte data ved hjælp af grafsoftware. En repræsentativ vækstlæsetabel og parceller af RHΔku80::NLuc-parasitter er vist i figur 1A,B.
- For at beregne fordoblingstiden afbildes log2-værdierne for foldændringer på de enkelte tidspunkter over inkubationstiden. Brug en lineær regressionsfunktion til at beregne hældningen, som repræsenterer fordoblingstiden for hver stamme (Figur 1A,C).
2. Evaluering af kemisk forbindelsehæmningseffekt mod Toxoplasma-vækst
BEMÆRK: Her præsenteres evaluering af hæmningen af LHVS i Toxoplasma-væksten som et eksempel. Otte forskellige koncentrationer af LHVS testes, og der udføres tre tekniske replikater for hver af de tre biologiske replikater for både RHΔku80::NLuc og RHΔku80Δcpl::NLuc-stammer.
- Før parasitinfektionen, frø HFFs til 96 godt mikroplader i formatet af tre rækker og ni kolonner for en biologisk replikat pr sammensatte pr stamme. Værtsceller får lov til at vokse i mindst 7 dage før brug.
- Pass RHΔku80::NLuc og RHΔku80Δcpl::NLuc parasitter i 2 dage før brug. Følg trin 1.2-1.6 for parasitrensning og kvantificering. Resuspender parasitter i fenol rød-frie medier ved 1 x 104 parasitter/ ml.
- Aspirerer medier fra en plade, der indeholder flydende HFFs og podehver brønd med 150 μL parasitresuspension. Mikropladen inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 4 timer.
- LHVS fremstilles ved otte forskellige koncentrationer i et reservoir med 12 brøndved seriefortynding. Generelt er koncentrationerne faldet med tre gange på en seriel fortyndingmåde.
BEMÆRK: Den laveste koncentration reduceres med 6.561 gange i forhold til den højeste koncentration. Folden ændring af fortynding kan justeres i overensstemmelse hermed baseret på forskellige egenskaber af de enkelte forbindelser. - Ved 4 h post-infektion, aspirate medier til at fjerne ikke-invaderede parasitter og fylde hver brønd fra kolonner 2-9 med 150 μL medier suppleret med LHVS i forskellige koncentrationer. Lad den første kolonne fyldt med almindeligt medium til at fungere som en ikke-behandlet kontrol.
- Mikropladen inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i yderligere 96 timer.
- Udfør trin 1.9-1.11 og mål luciferase aktivitet af de enkelte brønde.
- Gennemsnit luciferase aktiviteterne af tre tekniske replikater fra brønde af hver enkelt LHVS koncentration.
- Den gennemsnitlige luciferaseaktivitet for hver LHVS-koncentration divideres med den gennemsnitlige luciferaseaktivitet fra ikke-behandlede parasitter for at beregne den normaliserede luciferaseaktivitet som en procentdel.
- Plotte de normaliserede luciferaseaktiviteter i forhold til de enkelte LHVS-koncentrationer ved hjælp af grafsoftware (figur 2). Hæmning af pyrimethamin mod parasitvækst måles også som en kontrol. Pyrimethamin er et klinisk antibiotikum, der anvendes til behandling af akut toxoplasmose ved at hæmme folinsyremetabolismen i Toxoplasma.
- Beregn IC50-værdierne for individuelle forbindelser ved hjælp af den indlejrede metode i grafsoftwaren, normaliseret respons vs. [inhibitor], under regressionsprogrammet "dosis-respons-hæmning". IC50 beregnes ved hjælp af følgende formel:
Y = 100/(1 + X/IC50)
Hvor: Y repræsenterer normaliserede luciferase aktiviteter inficerede celler under forskellige koncentrationer af inhibitor, og X repræsenterer individuelle koncentrationer af inhibitor.
3. CRISPR-Cas9-baseret gensletning i Toxoplasma-parasitter
- Generation af en plasmid konstruktion, der udtrykker guide RNA (sgRNA) og Cas9 til sletning af et gen af interesse
- Gå til www.ToxoDB.org og hente hele genkodningsekvensen, herunder introner og exons, sammen med 1,5 kb 5'-UTRs og 3'-UTRs (uoversatte områder).
BEMÆRK: Her er TgCPL (TGGT1_321530) målrettet som et repræsentativt eksempel. - Kopier den hentede TgCPL-sekvens til sekvensanalysesoftwaren (se Materialetabel for navn og version) og mærk 5'- og 3'-UTR-regionerne.
- Vælg ikonet Funktioner på den øverste menulinje, og vælg derefter Kloning | Find CRISPR-websteder.
- Vælg 3'(Cas9)' for placeringen af PAM-webstedet, og vælg den mappe, der indeholder Toxoplasma-genomsekvensen, i specificitetsscoringssektionen. Lad resten af indstillingerne være som standard.
- Vælg et sgRNA med følgende to kriterier: 1) viser en høj specificitetscore, generelt >98%, og 2) mangler et G efter NGG, en protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens. Den valgte sgRNA er normalt placeret på steder tæt på starten og stoppe codons af genet af interesse.
- Kopier sekvensen af den valgte sgRNA, og indsæt den i følgende primerskabelon.
Delen i rødt repræsenterer den valgte TgCPL sgRNA-sekvens. Det kan erstattes med forskellige sgRNAs for forskellige gener af interesse.
BEMÆRK: Hvis det valgte sgRNA ikke starter med G, skal du tilføje G i begyndelsen af sgRNA for at forbedre dets udtryk. - Udfør en PCR-reaktion for at ændre det allerede eksisterende plasmid, der udtrykker sgRNA (figur 3A), som er rettet mod Toxoplasma uracil phosphoribosyltransferase (TgUPRT)genet 23 ved hjælp af en PCR-forblanding med indstillingerne i tabel 2.
- Kør PCR-produktet på en agarosegel for at bekræfte vellykket forstærkning. Et PCR-produkt på 10 kb forventes at blive forstærket (figur 3B).
- Uddrag PCR produktet ved hjælp af en DNA gel ekstraktion kit og rundrunding det ved hjælp af en site-rettet mutagenesis kit. Se tabel 3 for opskriften. Inkuber reaktionen i 10-20 min på RT.
- Omdan det cirkulæriserede PCR-produkt til E. coli, og vælg 10 kloner til yderligere verifikation af inkorporeringen af designet sgRNA.
- Vokse to kloner og ekstrakt plasmider. Skær de rensede plasmider med BamHI og EcoRV. Kandidatplasmiderne giver to bånd på 2,4 kb og 7,2 kb (Figur 3C).
- Send plasmider ne til Sanger-sekvensering ved hjælp af M13-tilbagevendte primere for at bekræfte en vellykket udskiftning af TgUPRT sgRNA med det designede sgRNA (Figur 3D).
- Gå til www.ToxoDB.org og hente hele genkodningsekvensen, herunder introner og exons, sammen med 1,5 kb 5'-UTRs og 3'-UTRs (uoversatte områder).
- Generering af reparationsskabelon til gensletning via HDR-mekanisme
- Ifølge målretningsstederne for den valgte sgRNA skal du finde 50 bp 5'-UTRs eller 3'-UTRs af målgenet for homologiafhængig rekombination (HDR, se diskussionsafsnit). Udvælgelsen af regioner følger nedenstående kriterier, afhængigt af placeringen af sgRNA-målene.
- Hvis spaltningsstedet ved Cas9 er placeret opstrøms fra startkodonen, skal du vælge følgende: en 50 bp DNA-sekvens opstrøms fra spaltningsstedet som den venstre HDR-region og en 50 bp DNA-sekvens nedstrøms fra stopcodon som den højre HDR-region.
- Hvis spaltningsstedet ved Cas9 er mellem start- og stopcodonerne, skal du vælge følgende: en 50 bp DNA-sekvens opstrøms fra startcodon som venstre HDR-region og en 50 bp DNA-sekvens nedstrøms fra stop codon som den højre HDR-region.
- Hvis spaltningsstedet ved Cas9 er placeret nedstrøms fra stop codon, skal du vælge følgende: en 50 bp DNA-sekvens opstrøms fra starten codon som den venstre HDR-region og en 50 bp DNA-sekvens nedstrøms fra spaltningsstedet som den højre HDR-region.
BEMÆRK: For TgCPL-genet er spaltningsstedet placeret mellem start- og stopcodonerne. Således er følgende primere designet til at forstærke reparationsskabelonen ved hjælp af pMDC64 som skabelon, der koder en pyrimethaminresistenskassette. Sekvenserne i sort glød til pMDC64 plasmid til PCR forstærkning. De områder, der er mærket med rødt, er TgCPL-specifikkesekvenser for homolog rekombination.
- Udfør PCR ved hjælp af en PCR-forblanding under pcr-betingelserne, der er beskrevet i tabel 4.
- Pcr-produktet køres på en agarosegel (figur 3E) efterfulgt af gelekstraktion og standardnukleinsyrekvantificeringsprocedurer.
BEMÆRK: Hvis det forventede bånd ikke kan forstærkes, skal du optimere PCR-betingelserne og/eller skifte primerpar.
- Ifølge målretningsstederne for den valgte sgRNA skal du finde 50 bp 5'-UTRs eller 3'-UTRs af målgenet for homologiafhængig rekombination (HDR, se diskussionsafsnit). Udvælgelsen af regioner følger nedenstående kriterier, afhængigt af placeringen af sgRNA-målene.
- Toxoplasma transfektion
- Pass RHΔku80::NLuc parasitter i 2 dage i en T25 kolbe indeholdende confluent HFFs. En T25 kolbe af fuldt lysede parasitter er tilstrækkelig til to til tre transfections.
- Parasitparasitter, der renser sprøjte og filtrerer som beskrevet i trin 1.2. Resuspender parasitter i cytomix buffer og spin ned på 1.000 x g i 10 min på RT.
- Vask pelleterede parasitter med 10 ml cytomixbuffer, og tiparasitterne spindes ned ved 1.000 x g i 10 min.
- Hæld forsigtigt supernatanten af og resuspender parasitterne i samme buffer i en koncentration på 1 x 108 parasitter/ml.
- 2 μg reparationsskabelon-DNA blandes med 20 μg af sgRNA/Cas9-udtryksplasmiderne (masseforhold = 1:5, svarende til et 1:3 molarforhold). Hvis forstærkningsudbyttet for reparationsskabelonen er lavt, skal du reducere inputtet af begge DNA-stykker i overensstemmelse hermed. Der kan anvendes mindst 0,5 μg reparationsskabelon.
- 400 μL resuspension af parasitter, DNA og 5 μL af 200 mM ATP/500 mM reduceret glutathion (GSH) blandes i et 1,5 ml centrifugerør. Der anbrings det samlede volumen til 500 μL med cytomixbuffer, hvis det er nødvendigt.
- Blandingen af parasitter og DNA overføres til en elektroporationskuvet (4 mm mellemrumsbredde) og elektroporation (2 kV spænding, 50 Ω modstand) ved hjælp af et elektroporationsapparat.
- Elektropolerede parasitter overføres til en T25-kolbe indeholdende flydende HFF'er i frisk D10-medium. Påfør passende antibiotikum til valg af lægemidler efter 24 timer.
- Hold stof selektivt pres, indtil væksten af de transgene parasitter er stabil.
- Rense genomisk DNA fra knockout populationen og kontrollere for integration af pyrimethaminresistens kassette i TgCPL locus ved PCR. Efter bekræftet, gå videre til punkt 3.4. Hvis ikke, udføre en anden runde af parasittransfektion og udvælgelse af lægemidler. Manglende evne til at opdage den korrekte integration af lægemiddelresistenskassette tyder normalt på, at målgenet er afgørende, eller at genlocus ikke er tilgængeligt.
- Kloning af knockout parasitter
- Frø to 96 brønd mikroplader med HFF celler og inkubere ved 37 °C og 5% CO2 i 1 uge før kloning parasitter.
- Pass ~ 0,3-0,4 ml af populationen af transgene parasitter i en T25 kolbe indeholdende confluent HFFs og dyrke dem i 2 dage. Overvej at overføre flere parasitter, hvis mutanten viser vækstdefekter.
BEMÆRK: For at opnå det bedste udbytte og levedygtighed, er værtscellerne stærkt inficeret af parasitterne, og de fleste af parasitterne holdes i den intracellulære fase. - Sprøjteinficerede værtsceller og filterrense frisklysede parasitter som nævnt i trin 1.3. Resuspender parasitterne i D10 medium og spin dem ned på 1.000 x g i 10 min på RT.
- Resuspender de pelleterede parasitter i 10 ml D10 medium.
- Tæl parasitter ved hjælp af et hæmocytometer til at bestemme parasitkoncentrationen.
- Der foresfortyndes to trin for at bringe koncentrationen til 10 parasitter/ml i D10-medium suppleret med det relevante antibiotikum. Normalt fortyndes den oprindelige parasitresuspension med 1.000 gange, efterfulgt af en anden fortynding til 10 parasitter/ml.
- Aspirate medier fra 96 brønd mikroplader indeholdende confluent HFFs og pode 150 μL af fortyndede parasitter i hver brønd.
- Inkuberpladerne ved 37 °C med 5% CO2 i 7 dage uden forstyrrelser for at tillade plaquedannelse. Inkubationstiden kan være længere, hvis transgene parasitter udviser vækstdefekter.
- Screen pladerne ved hjælp af en fase-kontrast mikroskop og markere kun brønde, der indeholder en enkelt plaque.
- Udfør koloni-PCR for at identificere korrekte kloner.
- Brug pipettespidser til at skrabe bunden af hver brønd til at løfte inficerede HFF monolayers.
- Rør 75 μL af cellens resuspension fra hver markeret godt ind i 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Centrifugerør i 10 min ved maksimal hastighed ved RT. Omhyggeligt aspirat supernatanten og resuspender pellet i 10,25 μL lysis buffer indeholdende fortyndingbuffer og DNA-frigivelse additiv i sættet (Tabel af materialer).
- Prøverne inkuberes i 4 min ved RT og derefter 2 min ved 98 °C. Derefter kan prøverne bruges til PCR eller opbevares ved -20 °C indtil brug. Tre sæt PCR-reaktioner bruges til at teste for integration af lægemiddelresistenskassetten og tab af det pågældende gen (figur 4A). Se tabel 5 for PCR-reaktionsopsætning og tabel 6 for termocyclerindstillinger.
- Identificer de korrekte kloner, og overfør fire kloner til T25-kolber indeholdende flydende HFFs.
- Efter individuelle kloner lyse værtsceller, rense genomic DNA for yderligere PCR verifikation.
- Hvis et antistof, der genkender det protein af interesse, er til rådighed, skal du følge en standard immunblotting procedure for at kontrollere tab af målet protein i de korrekte Toxoplasma knockouts. Repræsentative billeder til screening af en TgCPL-sletningsmutanter vist i figur 4B,C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 er et eksempel på en vækstkurve for RHΔku80::NLuc-stammen og den afledte beregning for fordoblingstiden. Generelt, analysen udføres i tre tekniske replikater for hver af de tre biologiske replikater at tage højde for variationer af luciferase aktivitet aflæsninger. For at beregne den normaliserede fold ændring af parasitvækst, hver læsning på 24-96 h post-infektion blev divideret med den indledende læsning på 4 h post-infektion, som afspejler udgangsmængden af levende parasitter i analysen (Figur 1A,B). Med hensyn til bestemmelse af parasit fordobling tid, log2 værdier af de normaliserede fold ændringer af parasitvækst blev plottet mod hvert tidspunkt. Dernæst blev plottet udsat for en lineær regressionsfunktion for at opnå hældningen, hvilket repræsenterer fordoblingstid (figur 1C).
Hæmningseffekten af LHVS i vilde og Δcpl-stammer blev bestemt ved at plotte luciferaseaktiviteter mod otte inhibitorkoncentrationer i figur 2. Det er vigtigt at medtage inficerede celler uden inhibitor behandling for normalisering af rå luciferase aktiviteter i analysen. Desuden kræves der et mock-eksperiment, der udføres i en klar mikroplade, for at analysen kan sikre, at parasitterne stadig befinder sig i det intracellulære stadium ved afslutningen af analyseperioden.
I figur 3vises generering og validering af en sgRNA-ekspressionskonstruktion rettet mod TgCPL og produktion af en reparationsskabelon til TgCPL-sletning. De 20 bp sgRNA matchende til TgUPRT genet kodet i den oprindelige plasmid blev muteret til DNA-sekvensen rettet mod TgCPL genet via PCR-baserede site-rettet mutagenesis. For at opnå dette blev DNA-sekvenserne, der koder for sgRNA'erne, der genkender forskellige gener, udviklet til den forreste primer, mens den omvendte primer blev holdt uændret for at forenkle primerdesign.
Figur 3A viser et zoomet ind-område af sgRNA-DNA-sekvenserne rettet mod TgUPRT-genet i den oprindelige skabelon plasmid samt det primersæt, der anvendes til generering af den lineariserede sgRNA-ekspressionsvektor. Figur 3B viser et repræsentativt gelbillede af det lineariserede TgCPL-rettetmod sgRNA-udtryk plasmid. Figur 3C viser begrænsningen endonuclease fordøjelse af den cirkulæriserede TgCPL-målretningsgRNA udtryk plasmid. En M13 omvendt primer blev brugt til at sekvensere det integrerede guide RNA inden for den sgRNA-ekspressionsvektor, der genereres for det specifikke gen. I figur 3Dblev det sekvenserede DNA-område justeret til plasmidskabelonen for bekræftelse af vellykket mutagenese. Figur 3E illustrerer start- og slutområderne for pyrimethaminbestandietten, der viser, hvor primerne kan producere reparationsskabelonen til TgCPL-gensletning. Reparationsskabelonen blev PCR-forstærket og læsset i en 1% agarose gel til størrelsesverifikation og gelekstraktion.
Den overordnede strategi for TgCPL-knockoutgenerering og -screening er vist i figur 4. Tre sæt primere vist i figur 4A blev brugt til at screene TgCPL-sletningparasitter for korrekt integration af 5'- og 3'-ARMs og sletning af TgCPL-kodningsekvens. Som vist i figur 4Budvælges syv til otte kloner generelt til screening i første omgang. Screeningen starter normalt med at kontrollere for sletning af kodningssekvensen for det gen af interesse. Dette efterfølges af påvisning af 5' og 3'-ARMs, hvilket hjælper med at minimere det samlede antal kloner, der skal screenes. Yderligere verifikation ved immunblotting, der vises i figur 4C, kan udføres, hvis der findes et antistof, der genkender målproteinet.
Figur 1: Intracellulær vækstkvantificering for Toxoplasma parasitter ved hjælp af en luciferase-baseret metode. (A) Raw luciferase aktivitet aflæsninger i et regneark software. Aflæsningerne ved 24 h, 48 h, 72 h og 96 h post-infektion blev normaliseret mod de indledende aflæsninger ved 4 h post-infektion til beregning af folden ændringer i parasitvækst. (B) De normaliserede data blev gennemsnit og afbildet. (C) Log2-værdierne for foldændringerne blev også afbildet og udsat for lineær regression med henblik på bestemmelse af parasittens fordoblingstid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vurdering af hæmningseffekt af LHVS og pyrimethamin ved hjælp af luciferasebaseret vækstanalyse. Parasitter blev podet ind i en 96 brønd mikroplade i 4 timer for at give mulighed for invasion af værtsceller. Ikke-invaderede parasitter blev vasket væk, og pladen var fyldt med medier, der indeholder forskellige koncentrationer af LHVS eller pyrimethamin og inkuberet i yderligere 96 timer før bestemmelse af luciferase aktivitet. De målte luciferaseaflæsninger for parasitter behandlet med individuelle inhibitorkoncentrationer blev normaliseret mod det signal, der blev påvist fra ubehandlede parasitter. Dataene blev afbildet i et grafprogram, og der blev udført en regressionsanalyse for IC50-bestemmelse. Analysen blev gentaget i tre biologiske replikater med tre tekniske replikater hver. Data repræsenterer middelværdien ± SEM, n = 3 biologiske replikater. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Generering af plasmidkonstruktionen, der udtrykker sgRNA-rettet mod TgCPL og produktion af en reparationsskabelon til TgCPL-sletning. (A) Den oprindelige pSAG1-Cas9-sgRNA-UPRT plasmid23 blev ændret via et stedsrettet mutagenesesæt til erstatning af sgRNA-modering af TgUPRT-genet til TgCPL. SgRNA-kodningsområdet er udvidet til at vise områder, som primerne anneal er. Efter PCR blev den muterede plasmid lineariseret og lastet i en 1% agarose gel til verifikation af vellykket forstærkning, efterfulgt af gelekstraktion. (B) Gelbilledet af pcr-forstærket lineariseret sgRNA-udtrykskonstruktion. (C)Efter gelekstraktion blev PCR-produktet cirkliseret og efterfølgende omdannet til E. coli. Klonerne indeholdende de forventede plasmider blev screenet af begrænsning endonuclease fordøjelse og DNA sekventering. Båndstørrelserne efter DNA-fordøjelsen var 7,2 bp og 2,4 kb. Bandet genereret af uspecifik kavalergang fra endonucleases er mærket af stjerne. (D) Den Mellemvendte Primer, der er mærket i figuren, blev brugt til at sekvensere det muterede guide RNA-område inden for den genererede SgCPL-vektor,der er målrettet mod TgRNA-udtryk. Den sekvenserede DNA-region blev justeret til plasmid skabelon for at bekræfte vellykket mutagenesis. (E)I denne undersøgelse blev 50 bp homologe regioner, der svarede til 5'- og 3'-UTRs tgCPL, udviklet til primere til forstærkning af reparationsskabelonen og flankeret i 5'- og 3'-enderne af henholdsvis PCR's 400'er-resistensstyrke. Agarose gel elektroforese blev brugt til at kontrollere den korrekte størrelse af PCR produkt før gel ekstraktion. Reparationsskabelonens forventede størrelse er ~2,7 kb. Normalt kan 5-6 μg reparationsskabelon fås fra 200 μL PCR-reaktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: PCR og immunblotting bekræftelse af TgCPL-mangelfuld parasitter. (A) Et skematisk diagram, der viser de generelle strategier for TgCPL-sletningi Toxoplasma og PCR-baseret screening af de korrekte TgCPL knockout kloner. De primere, der anvendes til screeningen er mærket. (B) PCR og agarose gel elektroforese blev anvendt til at vælge kloner, der indeholder den korrekte integration af pyrimethaminresistens kassette i TgCPL locus og tab af TgCPL genet. Δ cpl-populationenscpl genomiske DNA fungerede som en positiv kontrol ved 5'- og 3'-ARM detektion, mens WT genomisk DNA blev anvendt til påvisning af TgCPL-genet som en positiv kontrol. Vand blev brugt i stedet for DNA skabelon i PCR reaktioner til at tjene som en negativ kontrol. De forventede bånd er angivet med pile, mens uspecifikke PCR-forstærkninger er mærket af stjerner. (C) Klon 1 identificeret ved PCR-screening blev dyrket i vævskultur for cellelysat præparat og yderligere immunblotting analyse for at bekræfte tabet af TgCPL udtryk i knockout. TgActin blev brugt som ladekontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Luciferase: | Slutpunkt |
| Integrationstid: | 1 s |
| Filtersæt - Emission: | Fuldt lys |
| Optik: | Top |
| Få: | 135 |
| Læs hastighed: | Normal |
| Forsinkelse: | 100 ms. |
| Læsehøjde: | 4,5 mm |
Tabel 1: Indstillinger for mikropladelæser til måling af luciferase-aktivitet under luciferase-baserede Toxoplasma-vækstanalyse.
| Indledende denaturering: | 98 °C i 5 min. |
| 25 cyklusser af | |
| Denaturering: | 98 °C for 5 s |
| Udglødning: | 60 °C for 15 s |
| Udvidelse: | 72 °C i 1 min. |
| Endelig udvidelse: | 72 °C i 10 min. |
Tabel 2: Termocyclerindstillinger for generering af sgRNA-ekspressionsvektor.
| Prøve | Volumen (μl) |
| PCR-produkt (10-50 ng) | 1 |
| 2X KLD (kinase, ligase, DpnI) Reaktionsbuffer | 5 |
| 10x KLD enzym mix | 1 |
| Nuclease-frit vand | 3 |
| Samlede | 10 |
Tabel 3: Reaktionsopskrift på cirkularisering af sgRNA-ekspressionsvektor.
| Indledende denaturering: | 98 °C i 5 min. |
| 35 cyklusser af | |
| Denaturering: | 98 °C for 15 s |
| Udglødning: | 58 °C for 15 s |
| Udvidelse: | 72 °C for 30 s pr kb |
| Endelig udvidelse: | 72 °C i 10 min. |
Tabel 4: Termocyclerindstilling til generering af reparationsskabelon.
| Prøve | Volumen (μl) |
| total Toxoplasma genomisk DNA | 1 |
| Fremadprimer (25 μM) | 0.2 |
| Omvendt primer (25 μM) | 0.2 |
| 2x PCR master forblanding | 5 |
| Nuclease-frit vand | 3.6 |
| Samlede | 10 |
Tabel 5: Koloni PCR reaktion opskrift til screening enkelt Toxoplasma kloner.
| Indledende denaturering: | 98 °C i 5 min. |
| 35 cyklusser af | |
| Denaturering: | 98 °C for 5 s |
| Udglødning: | 55 - 62 °C for 5 s |
| Udvidelse: | 72 °C for 20 s pr kb |
| Endelig udvidelse: | 72 °C i 1 min. |
Tabel 6: Termocycler indstilling til screening enkelt Toxoplasma kloner.
| Cytomix buffer | 25 mM HEPES, pH 7,6, 120 mM KCl, 10 mM K2HPO4/KH2PO4,5 mM MgCl2,0.015 mM CaCl2og 2 mM EGTA. |
| D10 mellem | DMEM 1X (Corning, Cat #: 10-013-CV), 10 mM HEPES, 10% (v/v) Kosmisk KalvESerum (Hyclone, Kat #: SH30087.03), 1 mM natriumpyruvat, 4 mM L-glutamin, 100 enheder/ml penicillin og 100 μg/mL streptomycin. |
| Phenol rød-fri medium | DMEM/ Stærkt modificeret (Hyclone, Kat #: SH30284.02), 10 mM HEPES, 10% (v/v) Kosmisk Kalveserum (Hyclone, Kat #: SH30087.03), 1 mM natriumpyruvat, 4 mM L-glutamin, 100 enheder/ml penicillin og 100 μg/mL streptomycin. |
| 2x nluc buffer | 100 mM MES, pH 6.0, 1mM CDTA, 0,5% Tergitol, 0,05% Mazu DF 204, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 35 mM Thiourea. |
Supplerende tabel 1: Opskrifter på buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
++Denne protokol beskriver en luciferase-baseret protokol til vurdering af intracellulær Toxoplasma vækst og evaluere hæmning effekten af kemiske forbindelser mod parasitvækst. Sammenlignet med de eksisterende strategier til måling af intracellulær Toxoplasma vækst, denne metode udviser høj følsomhed og specificitet. Mens overvågning parasit vækst, en mock assay i en klar 96 godt mikroplade anbefales at bekræfte, at den testede stamme ikke for tidligt lyse værtsceller inden udgangen af evalueringsperioden. Ellers vil luminescensaflæsningerne ikke nøjagtigt afspejle parasitvækst, da Toxoplasma kun replikerer i værtsceller.
Det er blevet observeret, at phenol rødt farvestof hurtigt slukker luciferase aktivitet, hvilket kan resultere i betydelige forskelle i luciferase aflæsninger blandt tekniske replikater på grund af en forsinkelse i individuelle godt målinger af pladelæseren. Derfor er det optimalt at forberede HFFs i phenol rød-fri medium før såning i 96 godt mikroplader. Også, i tilfælde af høj luciferase aktivitet, cross-well interferens kan føre til betydelig variation blandt de omkringliggende brønde udviser stærk luciferase aktivitet. Derfor anbefales det at placere en tom kolonne mellem hver stamme.
Specifikt for RHΔku80::NLuc stamme, 1.500 parasitter er podet ind i hver brønd for vækst analyse. Da fordoblingstiden for WT Toxoplasma parasitter er ~ 6-8 h24, forventes det at se en stigning i luciferase aktivitet med 8- til 16-fold ved 24 h post-infektion. Visse stammer med betydelige vækstfejl vil dog kun give en mindre stigning i luciferaseaktiviteten. Hvis den oprindelige parasit inokulum er lav, vil den iboende variation i luciferaseaktivitet derfor maskere observationen af en stigning i luminescens i vækstperioden. Derfor anbefales det at vaccinere et højere antal parasitter for at opnå en nøjagtig fold ændring for stammer med vækstmangler.
I protokollen følger det vejledende RNA-design de generelle regler, der anvendes til CRISPR-Cas9-baseret genommodifikation i pattedyrceller25. I øjeblikket leverer mange typer software og onlineplatforme tjenester til guide RNA-design i forskellige organismer, såsom CHOPCHOP26, E-CRISP27og EuPaGDT28. Her bruges kommerciel software (Table of Materials) til at designe sgRNA. Sammenlignet med de tidligere nævnte online-programmer, denne software giver et lokalt miljø for sgRNA design. Den beregner aktivitets - og specificitetsscorer for hver kandidat sgRNA ved hjælp af en tidligere offentliggjort algoritme25,29.
Teknisk set kan enhver sgRNA placeret i et gen af interesse, der indeholder en høj specificitet score effektivt mægle spaltning af genomisk DNA for downstream homologi-afhængige rekombination. I praksis foretrækkes sgRNA rettet mod en region tæt på start- eller stopcodon. Gener af interesse kan endogent epitop-tagged ved hjælp af sgRNA, som genererer en dobbelt-strandede hul i slutningen af genet. Endogent tagging af et gen før dets sletning vil hjælpe med at bekræfte gentab via immunblotting detektion i tilfælde af, at et antistof mod det protein af interesse ikke er tilgængelig. Epitop-tagging af et gen kan også hjælpe med at bestemme den subcellulære placering af det protein af interesse via immunfluorescens mikroskopi. Hvis målgenet er afgørende, kan sgRNA-genkendelse af genets startregion desuden anvendes til erstatning af dets cognate promotor til en tetracyklin-responsiv promotor for at generere en betinget knockout.
Derudover beskriver protokollen en teknik til gensletning i Toxoplasma ved at erstatte TgCPL-genet med en pyrimethaminresistenskassette. Ved at bruge forskellige plasmid skabeloner kodning andre resistens kassetter, efterforskere kan ændre primer sekvenser til at indarbejde andre antibiotikaresistens gener i reparation skabelon via PCR. Desuden kan denne protokol ændres til at udføre andre genom modifikationer, såsom endogen gentmærkning, promotor udskiftning, og site-rettet mutagenese. Det er bemærkelsesværdigt, at de homologe regioner, der anvendes i denne protokol, kun er 50 bp lange. En separat undersøgelse med succes anvendt 40-43 bp homolog DNA sekvenser til at indføre single-nukleotid mutationer og gen epitop tagging i Toxoplasma parasitter22. Homologe DNA-sekvenser i så kort længde kan let indarbejdes i primere. Selv om vi ikke kvantitativt evaluere HDR effektivitet for denne særlige længde af homologe region, ser det ud til, at en 40-50 bp region er tilstrækkelig til effektiv DNA rekombination i TgKu80-mangelfuld Toxoplasma stamme, som det fremgår af en vellykket genetisk manipulation af flere gener for nyligopnået 15,22.
Under effekten bestemmelse af kemiske forbindelser, hvis den potentielle lægemiddel mål gen er afgørende, en sammenligning af forskydninger i IC50 værdier mellem vildtype og knockout stammer er ikke praktisk. I dette scenario, en analyse direkte måling af evne til kemiske forbindelser til at hæmme rekombinant protein aktivitet er nødvendig for at vurdere effekten og specificitet af narkotika. Nyere litteratur rapporterede fitness score af individuelle gener i Toxoplasma ved at udføre et genom bred CRISPR skærm30, som kan tjene som en guide til at hjælpe med at vurdere vanskeligheden ved at generere en lige knockout mutant for genet af interesse.
Samlet set beskriver protokollen en vellykket afslutning af en luciferase-baseret intracellulær Toxoplasma vækstanalyse og en evalueringsstrategi for kemiske hæmmere mod Toxoplasma vækst. Også detaljeret er en CRISPR-Cas9-baseret genom redigering protokol for gensletning i Toxoplasma parasitter, som har været meget udbredt i marken. Individuelle laboratorier kan ændre den beskrevne protokol i henhold til eksperimentelle behov, såsom endogen gentmærkning, skift af lægemiddelmarkeringsmarkører og ændring af evalueringsperioden for intracellulær parasitvækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Drs. Sibley og Carruthers for deling pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid og anti-TgCPL og TgActin antistoffer. Dette arbejde blev støttet af Clemson Startup fund (til Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Oftalmology Career-Starter Research Grant (til Z.D.), et pilottilskud til en NIH COBRE-bevilling P20GM109094 (til Z.D.) og NIH R01AI143707 (til Z.D.). Finansieringsgiverne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejde manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
- Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
- Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
- Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
- Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
- Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
- Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
- Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
- Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
- Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
- McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
- Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
- Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
- Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
- Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
- Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
- Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
- Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
- Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
