Summary
Presenteras här är ett protokoll för att utvärdera hämning effekten av kemiska föreningar mot in vitro intracellulära tillväxten av Toxoplasma gondii med hjälp av en luciferase-baserad tillväxt analys. Tekniken används för att bekräfta hämningss specificitet genom genetisk borttagning av motsvarande målgen. Hämningen av LHVS mot TgCPL proteas utvärderas som ett exempel.
Abstract
Toxoplasma gondii är en protozoisk patogen som i stor utsträckning påverkar den mänskliga befolkningen. De nuvarande antibiotika som används för behandling av klinisk toxoplasmos är begränsade. Dessutom uppvisar de negativa biverkningar i vissa grupper av människor. Därför är upptäckten av nya therapeutics för kliniska toxoplasmos absolut nödvändigt. Det första steget i nya antibiotika utveckling är att identifiera kemiska föreningar som visar hög effekt i hämning av parasittillväxt med hjälp av en hög genomströmning screening strategi. Som en obligate intracellulär patogen, Toxoplasma kan endast replikera inom värdceller, vilket förbjuder användning av optisk absorbans mätningar som en snabb indikator på tillväxt. Presenteras här är ett detaljerat protokoll för en luciferas-baserad tillväxt analys. Som ett exempel används denna metod för att beräkna fördubblingstiden för toxoplasmaparasiter av vildtyp och mäta effekten av morpholinurea-leucyl-homofenyl-vinylsulfonfenyl (LHVS, en cysteinproteas-inriktningsförening) avseende hämning av parasitens intracellulära tillväxt. Beskrivs också, är en CRISPR-Cas9-baserade gen radering protokoll i Toxoplasma med 50 bp homologa regioner för homologi-beroende rekombination (HDR). Genom att kvantifiera hämningseffektiviteten hos LHVS i vilda och TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-liknande proteas)-bristfälliga parasiter, visas det att LHVS hämmar parasittillväxt av vild typ mer effektivt än Δcpl-tillväxt, vilket tyder på att TgCPL är ett mål som LHVS binder till i Toxoplasma. Den höga känsligheten och den enkla driften av denna luciferasbaserade tillväxtanalys gör den lämplig för övervakning av Toxoplasma-spridning och utvärdering av läkemedelseffekt på ett högt genomflödessätt.
Introduction
Toxoplasma gondii är en mycket framgångsrik obligate intracellulär parasit som infekterar ungefär en tredjedel av den mänskliga befolkningen. Dess höga överföringshastighet beror främst på dess olika överföringsvägar, inklusive konsumtion av underkokt kött, exponering för däggdjursreservoarer och medfödd överföring under födseln. T. gondii orsakar främst opportunistiska infektioner som kan leda till allvarlig sjuklighet och dödlighet hos immunkomprometterade individer1,,2,,3,,4,,5,6. De antibiotika som för närvarande används för behandling av akut toxoplasmos är särskilt ineffektiva vid behandling av medfödda och latenta infektioner och orsaka allvarliga reaktioner hos vissa individer3,,7,8. Således finns ett akut behov av att identifiera nya terapier. Förstå skillnaderna i subcellulära processer inom Toxoplasma och dess värd kommer att bidra till att identifiera potentiella läkemedelsmål. Därför krävs effektiva och bekväma genommanipulationstekniker för att studera rollerna hos enskilda gener inom Toxoplasma. Dessutom tillhör Toxoplasma fylum Apicomplexa, som innehåller flera andra signifikanta mänskliga patogener, såsom Plasmodium spp. och Cryptosporidium spp. Därför kan Toxoplasma användas som en modell organism för att studera grundläggande biologi i andra apicomplexan parasiter.
För att identifiera nya antibiotika mot mikrobiella patogener utförs initialt screening av ett bibliotek av kemiska föreningar för att bestämma deras effekt vid förtrycket av mikrobiell tillväxt. Hittills har flera mikroplatbaserade tillväxtanalyser utvecklats för att mäta intracellulär tillväxt av T. gondii (dvs. radioaktiva 3H-uracil inkorporering-baserad kvantifiering9, kvantitativ ELISA-baserad parasit upptäckt med T. gondii-specifikaantikroppar10,11, reporter proteinbaserad mätning med β-galactosidase eller YFP-uttryck Toxoplasma stammar12,,13, och en nyligen utvecklad hög-content imaging analys analys14).
Dessa individuella strategier har alla unika fördelar; Vissa begränsningar begränsar dock också deras ansökningar. Till exempel, eftersom Toxoplasma endast kan replikera inom nukleerade djurceller, autofluorescens och icke-specifik bindning av anti-T. gondii antikroppar mot värdceller orsaka störningar i fluorescens-baserade mätningar. Dessutom kräver användning av radioaktiva isotoper särskild säkerhetsöverensstämmelse och potentiella säkerhetsfrågor. Några av dessa analyser är mer lämpade för att bedöma tillväxt vid en enda tidpunkt snarare än kontinuerlig övervakning av tillväxten.
Presenteras här är en luciferase-baserade protokoll för kvantifiering av intracellulära Toxoplasma tillväxt. I en tidigare studie klonades NanoLuc luciferase genen under Toxoplasma tubulin promotorn, och denna luciferas uttryck konstruktion transfekterades i vildtyp (RHΔku80Δhxg stam) parasiter för att skapa en RHΔku80Δhxg::NLuc stam (kallad RHΔku80::NLuc nedan)15. Denna stam fungerade som föräldrarnas stam för intracellulär tillväxt bestämning och gen borttagning i denna studie. Med hjälp av RHΔku80::NLuc stam, parasit tillväxt i mänskliga förhud fibroblaster (HFFs) övervakades under en 96 h period efter infektion för att beräkna parasit fördubbling tid.
Dessutom kan hämningseffekten av LHVS mot parasittillväxt bestämmas genom att rita Toxoplasma tillväxthastigheter mot seriella LHVS-koncentrationer för att identifiera IC50-värdet. Tidigare litteratur har rapporterat att TgCPL är ett viktigt mål för LHVS i parasiter och att behandling med LHVS minskar utvecklingen av akuta och kroniska Toxoplasma infektioner16,17,18,19. Dessutom, RHΔku80::NLuc användes som föräldrastam för genom modifiering för att generera en TgCPL-briststam (RHΔku80Δcpl::NLuc), och hämningen av LHVS mättes mot denna mutant. Genom att observera en uppväxling av IC50 värden för LHVS i TgCPL-bristfälligaparasiter jämfört med WT stam, validerades det att TgCPL är måltavla för LHVS in vivo.
I detta protokoll, RHΔku80::NLuc används som föräldrastam, som saknar en effektiv icke-homolog end-joining pathway (NHEJ), vilket underlättar dubbel crossover homologi-beroende rekombination (HDR)20,21. Dessutom, 50 bp homologa regioner flankeras i båda ändar av en läkemedelsresistens kassett av PCR. PCR-produkten fungerar som en reparationsmall för att ta bort hela genen locus via HDR med CRISPR-Cas9-baserade genomredigeringsverktyg. Sådana korta homologa regioner kan lätt införlivas i primers, vilket ger en bekväm strategi för produktion av reparationsmallen. Detta protokoll kan ändras för att utföra universell genborttagning och endogen gentaggning.
Till exempel, i vår senaste publikation, tre proteas gener, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-liknande proteas), och TgSUB1 (Toxoplasma subtilisin-liknande proteas 1), var genetiskt ablated i TgCRT (Toxoplasma kloroquine-resistens transportör)-bristfälliga parasiter med denna metod15. Dessutom, TgAMN (en förmodad aminopeptidase N [TgAMN, TGGT1_221310]) var endogent taggade15. Den Lourido lab rapporterade också med hjälp av korta homologa regioner i intervallet 40-43 bp för införandet av plats-riktad genmutation och endogena genmärkning i Toxoplasma genomet med en liknande metod22. Dessa framgångsrika genom ändringar tyder på att en 40-50 bp homolog region är tillräcklig för effektiv DNA-rekombination i TgKU80-briststam, vilket kraftigt förenklar genom manipulation i Toxoplasma gondii.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toxoplasma gondii kategoriseras i riskgrupp 2 och måste hanteras på biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). Protokollet har granskats och godkänts av den institutionella biosäkerhetskommittén vid Clemson University.
1. Luciferase-baserade Toxoplasma tillväxtanalys
- Utsäde mänskliga framskinn fibroblaster (HFFs) 1 vecka före parasit inokulering för att säkerställa att värdceller är helt konfluenta. Utför en mock analys i en transparent platta för att säkerställa att parasiter förblir intracellulära under hela utvärderingsperioden.
OBS: Här utförs analysen i 96 brunnsmikroplattor. Enligt experimentella behov kan den skalas upp till 384 eller 1536 väl mikroplattor. - Passera Toxoplasma parasiter i konfluent HFFs 2 dagar före användning genom att överföra ~0,3-0,4 ml fullt lyst parasiter till en T25-kolv. Inkubera infekterade värdceller vid 37 °C med 5% CO2 i 2 dagar.
- Spruta 5 ml nylystade parasiter genom en 21 G säkerhetsnål 5x för att befria intracellulära parasiter och passera sedan genom ett 3 μm filter för att avlägsna värdcellskräp. Skölj kvarvarande parasiter ur kolven med 7 ml fenol rödfri D10 medium och passera sedan genom filtret igen.
- Centrifugparasiter vid 1000 x g i 10 min vid rumstemperatur (RT). Häll av supernatanten och resuspend pelleten i 10 ml fenol rödfri D10 media.
- Räkna parasiter med hjälp av en hemocytometer för att bestämma koncentrationen.
- Späd parasiter till 1 x 104 parasiter/ml för vildtypsstammen (WT). För tillväxt-brist parasit stammar, öka koncentrationen i enlighet därmed observera en betydande ökning av luciferas signaler.
- Aspirera media noggrant från 96 väl microplates försådda med HFFs och inokulera 150 μL parasit resuspension i brunnar i ett format av tre kolumner och fem rader, som representerar tre tekniska replikat och fem timepoints.
- Inkubera mikroplattan vid 37 °C och 5% CO2 för 4 h.
- Aspirera media noggrant från brunnarna för att ta bort icke-invaderade parasiter, fyll sedan brunnarna med RT fenol röd-fria medier i varje rad (med undantag för den första raden).
- Blanda lika stora volymer PBS och 2x luciferasanalysbuffert och späd klarferassubstratet till 12,5 μM.
- Tillsätt 100 μl utspädd luciferassubstrat i varje brunn i den översta raden. Inkubera mikroplattorna vid RT i 10 min så att cellerna kan lyse helt.
- Mät luciferasaktiviteten med hjälp av en mikroplåtsläsare. Plattläsarinställningarna visas i tabell 1. Varje läsning representerar det ursprungliga antalet invaderade parasiter vid 4 h efter infektion.
- Upprepa steg 1.9-1.12 för varje rad var 24:e timme i 4 dagar utan att byta medium. Dessa avläsningar återspeglar det totala antalet replikerade parasiter vid 24 h, 48 h, 72 h och 96 h efter infektion.
- Beräkna de genomsnittliga avläsningarna vid varje tidpunkt och dividera dem med de genomsnittliga avläsningarna vid 4 h för att bestämma vikförändringarna i parasittillväxt över tiden.
- Rita data med hjälp av grafprogramvara. En representativ tillväxtavläsningstabell och områden av RHΔku80::NLuc parasiter visas i figur 1A,B.
- Om du vill beräkna fördubblingstiden ritar du logg2-värdena för vikändringar vid de enskilda tidspunkterna under inkubationstiden. Använd en linjär regressionsfunktion för att beräkna lutningen, som representerar fördubblingstiden för varje stam (figur 1A,C).
2. Utvärdering av kemisk föreningshämningseffekt mot Toxoplasmatillväxt
OBS: Här presenteras utvärdering av hämning av LHVS i Toxoplasma tillväxt som ett exempel. Åtta olika koncentrationer av LHVS testas och tre tekniska replikat utförs för var och en av de tre biologiska replikaten för både RHΔku80::NLuc och RHΔku80Δcpl::NLuc-stammar.
- Före parasitinfektionen, utsäde HFFs till 96 väl mikroplattor i formatet av tre rader och nio kolumner för en biologisk replikera per förening per stam. Värdceller får växa i minst 7 dagar före användning.
- Pass RHΔku80::NLuc och RHΔku80Δcpl::NLuc parasiter i 2 dagar före användning. Följ steg 1.2-1.6 för parasitrening och kvantifiering. Resuspend parasiter i fenol röd-fria medier på 1 x 104 parasiter/ml.
- Aspirera media från en platta som innehåller konfluenta HFFs och vaccinera varje brunn med 150 μL parasitåtersuspension. Inkubera mikroplattan vid 37 °C och 5% CO2 för 4 h.
- Förbered LHVS vid åtta olika koncentrationer i en 12-brunnsbehållare genom seriell utspädning. I allmänhet minskas koncentrationerna med trefaldigt på ett seriellt utspädningssätt.
OBS: Den lägsta koncentrationen minskas med 6 561 gånger i förhållande till den högsta koncentrationen. Vikändringen av utspädningen kan justeras i enlighet med detta baserat på olika egenskaper hos enskilda föreningar. - Vid 4 h efter infektion, aspirera media för att ta bort icke-invaderade parasiter och fylla varje brunn från kolumnerna 2-9 med 150 μL media kompletteras med LHVS vid olika koncentrationer. Lämna den första kolumnen fylld med vanligt medium för att fungera som en icke-behandlad kontroll.
- Inkubera mikroplattan vid 37 °C och 5% CO2 för ytterligare 96 timmar.
- Utför steg 1.9-1.11 och mät luciferasaktiviteten hos enskilda brunnar.
- Genomsnitt luciferas verksamhet tre tekniska replikerar från brunnar i varje enskild LHVS koncentration.
- Dividera den genomsnittliga luciferasaktiviteten för varje LHVS-koncentration med den genomsnittliga luciferasaktiviteten som härrör från ickebehandlade parasiter för att beräkna den normaliserade luciferasaktiviteten i procent.
- Rita de normaliserade luciferasaktiviteterna mot de enskilda LHVS-koncentrationerna med hjälp av grafprogramvara (figur 2). Hämning av pyrimetamin mot parasittillväxt mäts också som en kontroll. Pyrimetamin är ett kliniskt antibiotikum som används för att behandla akut toxoplasmos genom att hämma folsyrametabolismen i Toxoplasma.
- Beräkna IC50-värdena för enskilda föreningar med hjälp av den inbäddade metoden i grafprogramvaran, normaliserat svar kontra [inhibitor], under regressionsprogrammet "dos-response-inhibition". IC50 beräknas med hjälp av följande formel:
Y = 100/(1 + X/IC50)
Var: Y representerar normaliserade luciferasaktiviteter hos infekterade celler under olika koncentrationer av inhibitor, och X representerar individuella koncentrationer av inhibitor.
3. CRISPR-Cas9-baserad genborttagning i Toxoplasmaparasiter
- Generering av en plasmidkonstruktion som uttrycker guideRNA (sgRNA) och Cas9 för att ta bort en gen av intresse
- Gå till www.ToxoDB.org och hämta hela genkodningssekvensen, inklusive introner och exoner, tillsammans med 1,5 kb 5'-UTRs och 3'-UTRs (oöversatta regioner).
HÄR är TgCPL (TGGT1_321530) måltavla som ett representativt exempel. - Kopiera den hämtade TgCPL-sekvensen till sekvensanalysprogramvaran (se Register över material för namn och version) och märk 5'- och 3'-UTR-regionerna.
- Välj ikonen Verktyg i den övre menyraden och välj sedan Kloning | Hitta CRISPR-webbplatser.
- Välj 3'(Cas9)' för PAM-platsens plats och välj mappen som innehåller Toxoplasma-genomsekvensen i specificitetsbedömningssektionen. Lämna resten av inställningarna som standard.
- Välj ett sgRNA med följande två kriterier: 1) som visar en hög specificitetspoäng, i allmänhet >98% och 2) som saknar ett G efter NGG, en protospacer intilliggande motiv (PAM) sekvens. Den valda sgRNA är vanligtvis ligger på platser nära början och stoppa kodon av genen av intresse.
- Kopiera sekvensen av den valda sgRNA och klistra in den i följande primer mall.
Delen i rött representerar den valda TgCPL sgRNA-sekvensen. Det kan ersättas med olika sgRNAs för olika gener av intresse.
OBS: Om det valda sgRNA inte börjar med G, lägg till G i början av sgRNA för att förbättra dess uttryck. - Utför en PCR-reaktion för att ändra den befintliga plasmid som uttrycker sgRNA(figur 3A)som riktar sig mot Toxoplasma uracil fosforibosyltransferas (TgUPRT) gen23 med hjälp av en PCR-förblandning med inställningarna i tabell 2.
- Kör PCR-produkten på en agarosgel för att bekräfta lyckad förstärkning. En 10 kb PCR-produkt förväntas förstärkas (figur 3B).
- Extrahera PCR-produkten med hjälp av en DNA gel extraktionssats och cirkulära den med hjälp av en plats-riktad mutagenesis kit. Se tabell 3 för receptet. Inkubera reaktionen i 10-20 min vid RT.
- Omvandla den cirkuläriserade PCR-produkten till E. coli och plocka 10 kloner för ytterligare kontroll av inkorporering av designad sgRNA.
- Odla två kloner och extrahera plasmider. Klipp de renade plasmiderna med BamHI och EcoRV. Kandidatplasmiderna kommer att ge två band på 2,4 kb och 7,2 kb (Figur 3C).
- Skicka plasmids för Sanger sekvensering med M13 omvänd primers för att bekräfta framgångsrik ersättning av TgUPRT sgRNA med den utformade sgRNA (Figur 3D).
- Gå till www.ToxoDB.org och hämta hela genkodningssekvensen, inklusive introner och exoner, tillsammans med 1,5 kb 5'-UTRs och 3'-UTRs (oöversatta regioner).
- Generering av reparationsmall för borttagning av gen via HDR-mekanism
- Enligt målplatserna för den valda sgRNA, lokalisera 50 bp av 5'-UTRs eller 3'-UTRs av målgenen för homologi-beroende rekombination (HDR, se diskussionsavsnitt). Urvalet av regioner följer de kriterier som anges nedan, beroende på var SgRNA-målen finns.
- Om klyvningsstället av Cas9 ligger uppströms från startkodon, välj följande: en 50 bp DNA-sekvens uppströms från klyvningsstället som den vänstra HDR-regionen och en 50 bp DNA-sekvens nedströms från stoppa kodon som rätt HDR-region.
- Om klyvningsstället av Cas9 är mellan start- och stoppkodon väljer du följande: en 50 bp DNA-sekvens uppströms från startkodonet som vänster HDR-region och en 50 bp DNA-sekvens nedströms från stoppa kodon som rätt HDR-region.
- Om klyvningsstället av Cas9 ligger nedströms från stoppa kodon, välj följande: en 50 bp DNA-sekvens uppströms från start kodon som vänster HDR-region, och en 50 bp DNA-sekvens nedströms från klyvningsstället som rätt HDR-region.
OBS: För TgCPL-genen ligger klyvningsstället mellan start- och stoppkodon. Således är följande primers utformade för att förstärka reparationsmallen med pMDC64 som mall, som kodar en pyrimetamin motståndskassett. Sekvenserna i svart glödglädd till pMDC64 plasmid för PCR förstärkning. De regioner som är märkta med rött är TgCPL-specifikasekvenser för homolog rekombination.
- Utför PCR med hjälp av en PCR-förmix under de PCR-förhållanden som beskrivs i tabell 4.
- Kör PCR-produkten på en agarosgel (figur 3E), följt av gelextraktion och standardvisytssyrakvantifieringsprocedurer.
Obs!
- Enligt målplatserna för den valda sgRNA, lokalisera 50 bp av 5'-UTRs eller 3'-UTRs av målgenen för homologi-beroende rekombination (HDR, se diskussionsavsnitt). Urvalet av regioner följer de kriterier som anges nedan, beroende på var SgRNA-målen finns.
- Toxoplasma transfection
- Passera RHΔku80::NLuc parasiter i 2 dagar i en T25 kolv som innehåller konfluent HFFs. En T25-kolv av helt lyst parasiter är tillräcklig för två till tre transfections.
- Spruta och filterrena parasiter enligt beskrivningen i steg 1.2. Resuspend parasiter i cytomix buffert och snurra ner på 1000 x g för 10 min på RT.
- Tvätta pelleterade parasiter med 10 ml cytomixbuffert och snurra ner parasiterna vid 1000 x g i 10 min vid RT.
- Häll försiktigt av supernatanten och återsuspend parasiterna i samma buffert vid en koncentration av 1 x 108 parasiter/ml.
- Blanda 2 μg reparationsmall DNA med 20 μg av sgRNA/Cas9 uttryck plasmider (massförhållande = 1:5, motsvarande en 1:3 molar förhållande). Om förstärkningsutbytet av reparationsmallen är låg, minska inmatningen av båda DNA-bitarna därefter. Minst 0,5 μg reparationsmall kan användas.
- Blanda 400 μL parasitåtersuspension, DNA och 5 μL 200 mM ATP/500 mM reducerad glutation (GSH) i ett 1,5 ml centrifugrör. Ta den totala volymen till 500 μL med cytomixbuffert, om det behövs.
- Överför blandningen av parasiter och DNA till en elektroporationscuvette (4 mm mellanrumsbredd) och utför elektroporation (2 kV spänning, 50 Ω motstånd) med hjälp av en elektroporationsapparat.
- Överför elektroporerade parasiter till en T25-kolv som innehåller konfluenta HFFs i färskt D10-medium. Applicera lämpligt antibiotikum för läkemedelsval efter 24 h.
- Håll läkemedelsselektivt tryck tills tillväxten av de transgena parasiterna är stabil.
- Rena genomiskt DNA från knockout-populationen och kontrollera om pyrimetaminresmotståndskassetten integreras i TgCPL locus av PCR. Efter verifierad, gå vidare till avsnitt 3.4. Om inte, utför en annan runda av parasittransfsektion och läkemedelsval. Oförmåga att upptäcka korrekt integration av läkemedelsresistens kassetten tyder oftast på att målet genen är viktigt eller att genen locus inte är tillgänglig.
- Kloning av knockout parasiter
- Utsäde två 96 väl mikroplattor med HFF celler och inkubera vid 37 °C och 5% CO2 för 1 vecka före kloning parasiter.
- Passera ~0,3-0,4 ml av populationen av transgena parasiter i en T25-kolv som innehåller konfluent HFFs och odla dem i 2 dagar. Överväg att passera fler parasiter om mutanten visar tillväxtdefekter.
OBS: För att uppnå bästa avkastning och livskraft är värdcellerna starkt infekterade av parasiterna, och de flesta av parasiterna hålls i det intracellulära stadiet. - Spruta infekterade värdceller och filtrera-rena nylyst parasiter som nämns i steg 1.3. Resuspend parasiterna i D10 medium och snurra ner dem på 1000 x g i 10 min på RT.
- Resuspend pelleted parasiter i 10 ml D10 medium.
- Räkna parasiter med hjälp av en hemocytometer för att bestämma parasitkoncentrationen.
- Utför en tvåstegsutspädning för att få koncentrationen till 10 parasiter/ml i D10 medium kompletterat med lämpligt antibiotikum. Vanligtvis späds den ursprungliga parasiten resuspension av 1000 gånger, följt av en andra utspädning till 10 parasiter/ml.
- Sug media från 96 väl mikroplattor som innehåller konfluenta HFFs och inokulera 150 μL utspädda parasiter i varje brunn.
- Inkubera plattor vid 37 °C med 5% CO2 i 7 dagar utan störningar för att tillåta plackbildning. Inkubationstiden kan vara längre om transgena parasiter uppvisar tillväxtdefekter.
- Screena plattorna med hjälp av ett faskontrastmikroskop och markera endast brunnarna som innehåller en enda plack.
- Utför koloni PCR för att identifiera korrekta kloner.
- Använd pipettspetsar för att skrapa botten av varje brunn för att lyfta infekterade HFF-monolager.
- Pipet 75 μL av cellåtersuspensionen från varje markerad väl in i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugrör i 10 min vid högsta hastighet vid RT. Sug försiktigt upp supernatanten och återsuspend pelleten i 10,25 μL lysbuffert som innehåller utspädningsbuffert och DNA-frigöringstillsats som finns i satsen (Tabell över material).
- Inkubera proverna i 4 min vid RT, sedan 2 min vid 98 °C. Därefter kan prover användas för PCR eller förvaras vid -20 °C tills de används. Tre uppsättningar PCR-reaktioner används för att testa för integrering av läkemedelsresistenskassetten och förlust av den gen av intresse (figur 4A). Se tabell 5 för PCR-reaktionsinställning och tabell 6 för termohjulsinställningar.
- Identifiera rätt kloner och överför fyra kloner till T25-flaskor som innehåller konfluent HFFs.
- Efter enskilda kloner lyse värdceller, rena genomiskt DNA för ytterligare PCR verifiering.
- Om en antikropp som känner igen det intresseprotein som finns tillgängligt, följ ett standardmetod för immunblottning för att verifiera förlusten av målproteinet i rätt Toxoplasma knockouts. Representativa bilder för screening av en TgCPL-borttagningsmutantvisas i figur 4B,C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 representerar ett exempel på en tillväxtkurva för RHΔku80::NLuc-stammen och den härledda beräkningen för dess fördubblingstid. I allmänhet utförs analysen i tre tekniska replikat för var och en av de tre biologiska replikaten för att ta hänsyn till variationer av luciferasaktivitetsavläsningar. För att beräkna den normaliserade vikförändringen av parasittillväxten dividerats varje läsning vid 24-96 h efter infektion med den första avläsningen vid 4 h efter infektion, vilket återspeglar utgångsbeloppet för levande parasiter i analysen (figur 1A,B). När det gäller att bestämma parasit fördubblingstid plottades log2-värdena för de normaliserade vikförändringarna av parasittillväxt mot varje tidpunkt. Därefter utsattes tomten för en linjär regressionsfunktion för att få lutningen, vilket motsvarar en fördubblingstid (figur 1C).
Hämningseffektiviteten hos LHVS i vilda och Δcpl-stammar bestämdes genom att luciferasaktiviteter plottades mot åtta inhibitorkoncentrationer i figur 2. Det är viktigt att inkludera infekterade celler utan inhibitor behandling för normalisering av rå luciferas aktiviteter i analysen. Dessutom krävs ett mock experiment som utförs i en tydlig mikroplåt för analysen för att säkerställa att parasiter fortfarande är i det intracellulära stadiet i slutet av analysperioden.
I figur 3visas generering och validering av ett sgRNA-uttryckskonstruktion som riktar sig till TgCPL och produktion av en reparationsmall för TgCPL-borttagning. 20 bp sgRNA matchning till TgUPRT genen kodade i den ursprungliga plasmid var muterade till DNA-sekvensen inriktning TgCPL genen via PCR-baserade plats-riktade mutagenesis. För att uppnå detta, DNA-sekvenser kodning för sgRNAs som känner igen olika gener var konstruerad för att framåt primer, medan den omvända primer hölls oförändrad för att förenkla primer design.
Figur 3A visar en inzoomad region av sgRNA DNA-sekvenser som riktar sig mot TgUPRT genen i den ursprungliga mallen plasmid samt primeruppsättningen som används för generering av den linjäriserade sgRNA-uttrycksvektorn. Figur 3B visar en representativ gel bild av den linjäriserade TgCPL-inriktningsgRNA uttryck plasmid. Figur 3C visar begränsningen endonuclease matsmältningen av den cirkuläriserade TgCPL-inriktningsgRNA uttryck plasmid. En M13 omvänd primer användes för att sekvensera den inbyggda guiden RNA inom sgRNA uttryck vektor genereras för den specifika genen. I figur 3Dvar sekvenserade DNA-regionen i linje med plasmid mallen för bekräftelse av framgångsrika mutagenesis. Figur 3E illustrerar start- och slutregionerna i den pyrimetaminressistenskassetten, som visar var grundfärgerna kan glöda för produktion av reparationsmallen för TgCPL-genborttagning. Reparationsmallen var PCR-förstärkt och laddad i en 1% agaros gel för storlekskontroll och gelextraktion.
Den övergripande strategin för TgCPL knockout generation och screening visas i figur 4. Tre uppsättningar av primers visas i figur 4A användes för att skärmen TgCPL-borttagningparasiter för korrekt integration av 5'- och 3'-ARMs och radering av TgCPL-kodningsekvens. Som visas i figur 4Bväljs i allmänhet sju till åtta kloner ut för screening inledningsvis. Screeningen börjar vanligtvis med att kontrollera att kodningssekvensen för genen av intresse raderas. Detta följs av identifiering av 5' och 3'-ARMs, vilket hjälper till att minimera det totala antalet kloner som ska kontrolleras. Ytterligare verifiering genom immunblottning som visas i figur 4C kan slutföras om en antikropp som känner igen målproteinet finns tillgänglig.
Figur 1: Intracellulär tillväxtkvantifiering för Toxoplasmaparasiter med hjälp av en luciferasbaserad metod. (A)Rå luciferas aktivitet avläsningar i ett kalkylprogram. Avläsningarna vid 24 h, 48 h, 72 h och 96 h post-infektion normaliserades mot de första avläsningarna vid 4 h post-infektion för beräkning av gånger förändringar i parasit tillväxt. (B)De normaliserade uppgifterna var i genomsnitt och ritades. (C)Stock2-värdena för vikförändringarna ritades också och utsattes för linjär regression för bestämning av parasitens fördubblingstid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bedömning av hämningseffekt av LHVS och pyrimetamin med hjälp av den luciferasbaserade tillväxtanalysen. Parasiter inokulerades i en 96 väl microplate för 4 h för att möjliggöra invasion av värdceller. Icke-invaderade parasiter tvättades bort, och plattan var fylld med media som innehåller olika koncentrationer av LHVS eller pyrimetamin och ruvade för ytterligare 96 h före bestämning av luciferas verksamhet. De uppmätta luciferasavläsningarna för parasiter som behandlats med individuella inhibitorkoncentrationer normaliserades mot den signal som detekterades från obehandlade parasiter. Data ritades i ett grafprogram och en regressionsanalys för IC50-bestämning utfördes. Analysen upprepades i tre biologiska replikat med tre tekniska replikat vardera. Data representerar medelvärdet ± SEM, n = 3 biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Generering av plasmidkonstruktionen som uttrycker sgRNA-inriktning på TgCPL och produktion av en reparationsmall för TgCPL-radering. (A)Den ursprungliga pSAG1-Cas9-sgRNA-UPRT plasmid23 ändrades via en plats-riktad mutagenesis kit för ersättning av sgRNA inriktning TgUPRT genen till TgCPL. SgRNA-kodningsområdet utvidgas för att visa områden som grundfärgerna glödar till. Efter PCR var den muterade plasmid linjäriserad och lastas i en 1% agaros gel för kontroll av framgångsrika förstärkning, följt av gel utvinning. (B) Gelbilden av den PCR-förstärkta linjära sgRNA-uttryckskonstruktionen. (C)Efter gelextraktion cirkulärades PCR-produkten och omvandlades därefter till E. coli. Klonerna som innehåller de förväntade plasmiderna kontrollerades av begränsning endonuclease matsmältningen och DNA sekvensering. Bandet storlekar efter DNA matsmältningen var 7,2 bp och 2,4 kb. Bandet som genereras av ospecifik klyvning från endonucleases är märkt med asterisk. (D)Den bakåtriktade M13-primern som anges i figuren användes för att sekvensera det muterade styr-RNA-området inom den genererade TgCPL-inriktningensgRNA-uttrycksvektorn. Sekvenserade DNA-regionen var i linje med plasmid mallen för att bekräfta framgångsrika mutagenesis. E)I denna studie konstruerades 50 bp homologa regioner som matchade till TgCPL:s 5'- och 3'-UTR-enheter till primtal för förstärkning av reparationsmallen och flankerades vid 5- respektive 3-ändarna av aimethaminmotståndskassetten av PCR. Agarose gel elektrofores användes för att kontrollera rätt storlek på PCR-produkten före gel utvinning. Den förväntade storleken på reparationsmallen är ~2,7 kb. Vanligtvis kan 5-6 μg reparationsmall erhållas från 200 μl PCR-reaktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: PCR och immunoblotting bekräftelse av TgCPL-bristaparasiter. (A)Ett schematiskt diagram som visar de allmänna strategierna för TgCPL-borttagningi Toxoplasma och PCR-baserad screening av rätt TgCPL knockout kloner. De grundfärger som används för screening är märkta. (B) PCR och agarose gel electrophoresis användes för att välja kloner som innehåller korrekt integration av pyrimetamin motstånd kassett i TgCPL locus och förlust av TgCPL genen. Den genomiska DNA av Δcpl befolkningen fungerade som en positiv kontroll för 5'- och 3'-ARM detektion, medan WT genomiska DNA användes för att upptäcka TgCPL genen som en positiv kontroll. Vatten användes i stället för DNA-mall i PCR-reaktionerna för att fungera som en negativ kontroll. De förväntade banden betecknas med pilar, medan ospecificerade PCR-förstärkningar är märkta med asterisker. (C)Klon 1 identifieras genom PCR screening odlades i vävnad kultur för cell lysate förberedelse och ytterligare immunblotting analys för att bekräfta förlusten av TgCPL uttryck i knockout. TgActin användes som lastningskontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Luciferas: | Slutpunkt |
| Integrationstid: | 1 s |
| Filteruppsättning - Utsläpp: | Fullt ljus |
| Optik: | Topp |
| Få: | 135 |
| Läs hastighet: | Normal |
| Försening: | 100 ms |
| Läs höjd: | 4,5 mm |
Tabell 1: Mikroplåtsläsningsinställningar för luciferasaktivitetsmätning under luciferasbaserad Toxoplasmatillväxtanalys.
| Inledande denaturering: | 98 °C i 5 min |
| 25 cykler av | |
| Denatureringen: | 98 °C för 5 s |
| Glödgning: | 60 °C för 15 s |
| Förlängning: | 72 °C i 1 min |
| Slutlig förlängning: | 72 °C i 10 min |
Tabell 2: Thermocycler-inställningar för generering av sgRNA-uttrycksvektor.
| Prov | Volym (μl) |
| PCR-produkt (10-50 ng) | 1 |
| 2X KLD (kinas, ligase, dpnI) reaktionsbuffert | 5 |
| 10X KLD Enzym Mix | 1 |
| Nukleasfritt vatten | 3 |
| Totala | 10 |
Tabell 3: Reaktionsrecept för cirkulärisering av sgRNA-uttrycksvektor.
| Inledande denaturering: | 98 °C i 5 min |
| 35 cykler av | |
| Denatureringen: | 98 °C för 15 s |
| Glödgning: | 58 °C för 15 s |
| Förlängning: | 72 °C för 30 s per kb |
| Slutlig förlängning: | 72 °C i 10 min |
Tabell 4: Termocykelinställning för generering av reparationsmall.
| Prov | Volym (μl) |
| totalt Toxoplasma genomiskt DNA | 1 |
| Framåt primer (25 μM) | 0.2 |
| Omvänd primer (25 μM) | 0.2 |
| 2x PCR-master premix | 5 |
| Nukleasfritt vatten | 3.6 |
| Totala | 10 |
Tabell 5: Colony PCR reaktion recept för screening enda Toxoplasma kloner.
| Inledande denaturering: | 98 °C i 5 min |
| 35 cykler av | |
| Denatureringen: | 98 °C för 5 s |
| Glödgning: | 55 - 62 °C för 5 s |
| Förlängning: | 72 °C för 20 s per kb |
| Slutlig förlängning: | 72 °C i 1 min |
Tabell 6: Termocykarinställning för screening av enstaka Toxoplasmakloner.
| Cytomix-buffert | 25 mM HEPES, pH 7.6, 120 mM KCl, 10 mM K2HPO4/KH2PO4, 5 mM MgCl2, 0.015 mM CaCl2och 2 mM EGTA. |
| D10 medium | DMEM 1X (Corning, Katt #: 10-013-CV), 10 mM HEPES, 10% (v/v) Cosmic Calf Serum (Hyclone, Cat #: SH30087.03), 1 mM natriumpyruvat, 4 mM L-glutamin, 100 enheter/ml penicillin och 100 μg/mL streptomycin. |
| Fenol rödfritt medium | DMEM/ Mycket modifierad (Hyclone, Katt #: SH30284.02), 10 mM HEPES, 10% (v/v) Cosmic Calf Serum (Hyclone, Cat #: SH30087.03), 1 mM natriumpyruvat, 4 mM L-glutamin, 100 enheter/ml penicillin och 100 μg/mL streptomycin. |
| 2X NLuc-buffert | 100 mM MES, pH 6.0, 1mM CDTA, 0.5% Tergitol, 0.05% Mazu DF 204, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 35 mM Thiourea. |
Tilläggstabell 1: Recept på buffertar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
++Detta protokoll beskriver ett luciferasbaserat protokoll för att bedöma intracellulär Toxoplasmatillväxt och utvärdera hämningseffekten av kemiska föreningar mot parasittillväxt. Jämfört med de befintliga strategier som finns tillgängliga för att mäta intracellulär Toxoplasma tillväxt, uppvisar denna metod hög känslighet och specificitet. Vid övervakning av parasitens tillväxt rekommenderas en mock-analys i en tydlig 96-brunnsmikroplate för att bekräfta att den testade stammen inte i förtid lyser värdceller före utvärderingsperiodens. Annars kommer luminescensavläsningarna inte exakt att återspegla parasittillväxt, eftersom Toxoplasma endast replikerar i värdceller.
Det har observerats att fenol rött färgämne snabbt släcker luciferas aktivitet, vilket kan resultera i betydande skillnader i luciferas avläsningar bland tekniska replikerar på grund av en fördröjning i enskilda väl mätningar av plattan läsaren. Därför är det optimalt att förbereda HFFs i fenol rödfrit medium före sådd i 96-brunnsmikroplattorna. Också, när det gäller hög luciferas aktivitet, cross-well störningar kan leda till betydande variation bland angränsande brunnar uppvisar stark luciferas aktivitet. Därför rekommenderas att placera en tom kolumn mellan varje stam.
Närmare bestämt, för RHΔku80::NLuc stam, 1500 parasiter inokuleras i varje brunn för tillväxtanalys. Eftersom fördubblingstiden för WT Toxoplasma parasiter är ~6-8 h24, förväntas det se en ökning av luciferasaktiviteten med 8- till 16 gånger vid 24 h efter infektion. Emellertid, vissa stammar med betydande tillväxt defekter kommer bara att ge en liten ökning av luciferas aktivitet. Därför, om den ursprungliga parasiten inokulat är låg, kommer den inneboende variationen i luciferasaktivitet att maskera observationen av en ökning av luminescensen under tillväxtperioden. Därför rekommenderas att vaccinera ett högre antal parasiter för att uppnå en korrekt vikförändring för stammar med tillväxtbrister.
I protokollet följer guiden RNA-designen de allmänna regler som används för CRISPR-Cas9-baserad genommodifiering i däggdjursceller25. För närvarande, många typer av programvara och online-plattformar tillhandahåller tjänster för guide RNA design i olika organismer, såsom CHOPCHOP26, E-CRISP27, och EuPaGDT28. Här används kommersiell programvara (Tabell över material) för att designa sgRNA. Jämfört med de tidigare nämnda online-program, ger denna programvara en lokal miljö för SgRNA design. Den beräknar aktivitets- och specificitetspoäng för varje kandidat sgRNA med hjälp av en tidigare publiceradalgoritm 25,29.
Tekniskt sett kan alla sgRNA som finns inom en gen av intresse som innehåller en hög specificitetspoäng effektivt medla klyvningen av genomiskt DNA för nedströms homologiberoende rekombination. I praktiken är sgRNA som riktar sig mot en region nära början eller stoppa kodon att föredra. Gener av intresse kan endogent epitop-märkta med hjälp av sgRNA, som genererar en dubbelsträngad lucka i slutet av genen. Endogenously märkning en gen innan dess borttagning kommer att bidra till att bekräfta genförlust via immunblotting upptäckt i det fall att en antikropp mot protein av intresse inte är tillgänglig. Epitop-märkning av en gen kan också hjälpa till att bestämma den subcellulära platsen för det protein som är av intresse via immunofluorescensmikroskopi. Dessutom, om målgenen är nödvändig, kan sgRNA som erkänner genens startregion användas för att ersätta dess konjaksantagare till en tetracyklin-lyhörd promotor för att generera en villkorlig knockout.
Dessutom beskriver protokollet en teknik för gen borttagning i Toxoplasma genom att ersätta TgCPL genen med en pyrimetamin motstånd kassett. Genom att använda olika plasmid mallar kodning andra läkemedelsresistens kassetter, utredare kan ändra primer sekvenser att införliva andra antibiotikaresistens gener i reparation mallen via PCR. Dessutom kan detta protokoll ändras för att utföra andra genommodifieringar, såsom endogen genmärkning, promotorersättning och platsstyrd mutagenesis. Det är anmärkningsvärt att de homologa regioner som används i detta protokoll är endast 50 bp i längd. En separat studie använde framgångsrikt 40-43 bp homologa DNA-sekvenser för att införa en-nukleotid mutationer och gen epitop märkning i Toxoplasma parasiter22. Homologa DNA-sekvenser på så kort längd kan lätt införlivas i grundfärger. Även om vi inte kvantitativt utvärdera HDR effektivitet för denna längd av homologa regionen, verkar det som en 40-50 bp region är tillräcklig för effektiv DNA-rekombination i TgKu80-brist Toxoplasma stam, vilket framgår av den framgångsrika genetiska manipulation av flera gener som nyligenuppnåtts 15,22.
Under effektbestämning av kemiska föreningar, om den prospektiva läkemedelsmålet genen är nödvändig, är en jämförelse av förändringar i IC50 värden mellan vildtyp och knockout stammar inte praktiskt. I detta scenario, en analys som direkt mäter förmågan hos kemiska föreningar att hämma rekombinanta proteinaktivitet krävs för att utvärdera effekt och specificitet av läkemedlen. Nyligen genomförd litteratur rapporterade fitness betyg av enskilda gener i Toxoplasma genom att utföra ett genom bred CRISPR skärm30, som kan fungera som en guide för att bedöma svårigheten att generera en rak knockout mutant för genen av intresse.
Sammantaget beskriver protokollet ett framgångsrikt slutförande av en luciferasbaserad intracellulär Toxoplasma-tillväxtanalys och en utvärderingsstrategi för kemiska hämmare mot Toxoplasmatillväxt. Också detaljerad är en CRISPR-Cas9-baserade genomredigeringsprotokoll för gen borttagning i Toxoplasma parasiter, som har använts i stor utsträckning inom området. Enskilda laboratorier kan ändra det beskrivna protokollet enligt experimentella behov, såsom endogen genmärkning, byta läkemedelsvalsmarkörer och ändra utvärderingsperioden för intracellulär parasittillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Drs. Sibley och Carruthers för att dela pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid och anti-TgCPL och TgActin antikroppar. Detta arbete stöddes av Clemson Startup fond (till Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Oftalmologi Career-Starter Research Grant (till Z.D.), ett pilotbidrag av en NIH COBRE bidrag P20GM109094 (till Z.D.), och NIH R01AI143707 (till Z.D.). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
- Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
- Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
- Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
- Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
- Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
- Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
- Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
- Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
- Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
- McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
- Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
- Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
- Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
- Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
- Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
- Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
- Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
- Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
