Summary
ここで提示されるプロトコルは、ルシファーゼベースの増殖アッセイを用いたトキソプラズマゴンディの細胞内成長に対する化学化合物の阻害効果を評価するプロトコルである。この技術は、対応する標的遺伝子の遺伝的欠失による阻害特異性を確認するために用いられる。TgCPLプロテアーゼに対するLHVSの阻害を例として評価する。
Abstract
トキソプラズマゴンディは、ヒト集団に広く影響を与える原虫病原体である。臨床トキソプラズマ症の治療に使用される現在の抗生物質は限られています。さらに, 彼らは人々の特定のグループに悪影響を示します。.したがって、臨床的トキソプラズマ症に対する新規治療薬の発見が不可欠である。新しい抗生物質の開発の最初のステップは、高スループットスクリーニング戦略を用いて寄生虫増殖の阻害において高い有効性を示す化合物を同定することです。細胞内病原体として、トキソプラズマは宿主細胞内でのみ複製することができ、成長の迅速な指標として光学吸光度測定の使用を禁止しています。ここで提示されるルシファーゼベースの成長アッセイのための詳細なプロトコルです。一例として、野生型トキソプラズマ寄生虫の倍増時間を計算し、細胞内増殖の阻害に関するモルホリン尿素-ロイシル-ホモフェニルビニル・スルホンフェニル(LHVS、システインプロテアーゼ標的化合物)の有効性を測定するために使用されます。また、ホモロジー依存組換え(HDR)に50bp相同領域を用いたトキソプラズマにおけるCRISPR-Cas9ベースの遺伝子欠失プロトコルである。野生型およびTgCPL(トキソプラズマカテプシンL様プロテアーゼ)欠損性寄生虫におけるLHVSの阻害効果を定量化することにより、LHVSがΔcpl増殖よりも効率的に野生型寄生虫の増殖を阻害することが示され、TgCPLがThVSがトホソプラズマ中に結合する標的であることを示唆している。このルシファーゼベースの増殖アッセイの高感度かつ容易な操作により、トキソプラズマの増殖をモニタリングし、高スループットでの薬剤有効性の評価に適しています。
Introduction
トキソプラズマ・ゴンディは、ヒト集団の約3分の1に感染する、非常に成功した細胞内寄生虫です。その高い伝染率は、主に、調理されていない肉の消費、哺乳類の貯水池への暴露、出生時の先天性伝染を含む多様な伝染経路によるものである。T. gondiiは主に、免疫不全個体,,11、2、3、4、5、62,3において重度の罹患率および死亡率を引き起こす可能性のある日和見感染5を6引き起こす。4急性トキソプラズマ症の治療に現在使用されている抗生物質は、特に先天性および潜在感染の治療において非効率的であり、一部の個体33、7、87,8において重篤な反応を引き起こす。したがって、新しい治療法を同定する緊急の必要性が存在する。トキソプラズマとその宿主における細胞内プロセスの違いを理解することは、潜在的な薬物標的を特定するのに役立ちます。したがって、トキソプラズマ内の個々の遺伝子の役割を研究するために、効率的で便利なゲノム操作技術が必要である。さらに、トキソプラズマは、プラスモジウム属やクリプトスポリジウム属などの他のいくつかの重要なヒト病原体を含むフィラム・アピコンプレックスに属しています。したがって、トキソプラズマは、他のアピコンプレックス寄生虫の基礎生物学を研究するのに役立つモデル生物として使用することができます。
微生物病原体に対する新規の抗生物質を同定するために、化学化合物のライブラリーのハイスループットスクリーニングは、微生物増殖の抑制におけるその有効性を決定するために最初に行われる。これまでに、Tの細胞内成長を測定するために、マイクロプレートベースの成長アッセイがいくつか開発されてきました。 gondii(すなわち、放射性3H-ウラシル系組み込み定量9、T.ゴンディ特異的抗体10、11を用いた定量ELISAベースの寄生虫検出、β-ガラクトシダーゼまたはYFP発現トキソプラズマ株12、13、および最近開発された高画像化性の高画像化性株12、13、および最近開発された高画像化性の高画像化物を用いたT.ゴンディ特異的抗体12,10、11、レポータータンパク質ベースの測定を行う。13
これらの個々の戦略はすべてユニークな利点を持っています。ただし、一部の制限によってアプリケーションが制限されます。例えば、トキソプラズマは有核動物細胞内でのみ複製できるため、宿主細胞に対する抗T.ゴンディ抗体の自己蛍光および非特異的結合は、蛍光ベースの測定において干渉を引き起こす。また、放射性同位体の使用には、特別な安全コンプライアンスと潜在的な安全上の問題が必要です。これらのアッセイの中には、成長の継続的なモニタリングではなく、単一の時点で成長を評価するのに適したものもある。
ここで提示される細胞内トキソプラズマの増殖の定量化のためのルシメラーゼベースのプロトコルです。以前の研究では、NanoLucルシファーゼ遺伝子をトキソプラズマチューブリンプロモーターの下でクローニングし、このルシファーゼ発現構築物を野生型(RHΔhxg株)hxg寄生虫にトランスフェクトku80してRHΔhxgをku80作成しました::NLuc株(RHΔku80::NLuc以降)15。hxgNLucこの株は、この研究で細胞内増殖決定および遺伝子欠失のための親株として役立った。RHΔku80を用いて::NLuc株は、ヒト包皮線維芽細胞(HPF)の寄生虫増殖を96時間にわたってモニタリングし、寄生虫の倍増時間を算出した。
さらに、寄生虫増殖に対するLHVSの阻害効果は、IC50値を同定するために、シリアルLHVS濃度に対するトキソプラズマ増殖率をプロットすることによって決定することができる。以前の文献は、TgCPLが寄生虫におけるLHVSの主要な標的であり、LHVSによる治療が急性および慢性トキソプラズマ感染の発症を減少させることが報告されている16、17、18、19。16,17,18,19さらに、RHΔku80 ::NLucは、TgCPL欠損株(RHΔcpl::NLuc)を生成するゲノム改変のための親株cplとして使用され、NLucこの変異体に対するLHVSの阻害を測定した。ku80ku80WT株と比較してTgCPL-欠損性寄生虫におけるLHVSのIC50値のアップシフトを観察することにより、TgCPLがインビボのLHVSによって標的とされることを検証した。
このプロトコルにおいて、RHΔku80::NLucは、効率的な非相同的な末端結合経路(NHEJ)を欠く親株として使用され、それによって二重交差相同性依存組換え(HDR)20,21を促進する。20,21さらに、50 bpの相同領域は、PCRにより薬剤耐性カセットの両端に横たわっています。PCR製品は、CRISPR-Cas9ベースのゲノム編集ツールを使用してHDRを介して遺伝子遺伝子軌跡全体を除去するための修復テンプレートとして機能します。このような短い相同領域は、簡単にプライマーに組み込むことができるので、修復テンプレートの製造に便利な戦略を提供します。このプロトコルは、普遍的な遺伝子欠失および内因性遺伝子タグ付けを行うために変更することができる。
例えば、最新の出版物では、TgCPL、TgCPB(トキソプラズマカテプシンBTgCPB様プロテアーゼ)、TgSUB1(トキソプラズマサブチライシン様プロテアーゼ1)の3つのプロテアーゼ遺伝子が、TgCRT(トキソプラズマクロロキン耐性輸送体)で遺伝的に可軟化した。 TgSUB1また、TgAMN(推定アミノペプチダーゼN[TgAMN,TGGT1_221310])を内因的に15にタグ付けした。Louridoラボはまた、トキソプラズマゲノムにおける部位指向遺伝子変異および内因性遺伝子タグの導入に40〜43bpの範囲で短い相同領域を用いて、同様の方法22を用いて報告した。これらの成功したゲノム改変は、40-50bp相同領域がTgKU80欠損株における効率的なDNA組換えに十分であり、トキソプラズマ・ゴンディにおけるゲノム操作を大幅に簡素化することを示唆している。
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Protocol
トキソプラズマゴンディはリスクグループ2に分類され、バイオセーフティレベル2(BSL-2)で取り扱う必要があります。このプロトコルは、クレムソン大学の機関バイオセーフティ委員会によって審査され、承認されています。
1. ルシファーゼベースのトキソプラズマ成長アッセイ
- ヒト前皮線維芽細胞(HFF)を寄生虫接種の1週間前にシードし、宿主細胞が完全にコンフルエントなものであることを確認する。透明プレートで模擬アッセイを行い、評価期間を通して、寄生虫が細胞内に残ることを確認します。
注:ここでは、アッセイは96ウェルマイクロプレートで行われます。実験ニーズに応じて、384または1536ウェルマイクロプレートまでスケールアップすることができます。 - 完全に融和された寄生虫の約0.3-0.4 mLをT25フラスコに移すことによって、使用の2日前にトキソプラズマ寄生虫をコンフルエントHFFに渡す。37°Cで感染した宿主細胞を2日間5%CO2でインキュベートする。
- 21G安全針5xを介して5mLのしり出しが行われた新しい寄生虫を細胞内寄生虫を解放し、3μmのフィルターを通過して宿主細胞の破片を除去する。7 mLのフェノール赤色フリーD10培地を用いてフラスコから残留寄生虫をリンスし、再度フィルターを通過する。
- 遠心分離機寄生虫は室温(RT)で10分間1000xgで行う。 g上清を注ぎ、フェノールレッドフリーD10培地の10mLでペレットを再懸濁します。
- 濃度を決定するために、ヘモサイトメーターを使用して寄生虫を数えます。
- 野生型(WT)株に対して1 x104寄生虫/mLに寄生虫を希釈する。増殖欠乏性寄生虫株については、それに応じて濃度を上げ、ルシファーゼシグナルの有意な増加を観察する。
- HPFを事前に播種した96のウェルマイクロプレートから慎重に吸引メディアを吸引し、3つの技術的複製と5つのタイムポイントを表す3つの列と5行の形式で150 μLの寄生虫再懸濁液を井戸に接種します。
- マイクロプレートを37°C、5%CO2で4時間2インキュベートします。
- 吸気培地は、未侵入寄生虫を除去するために井戸から慎重に吸引し、その後、各行(最初の行を除く)のRTフェノール赤自由培地で井戸を埋める。
- PBSと2xルシファーゼアッセイバッファーの等量を混合し、ルシファーゼ基板を12.5 μMに希釈します。
- 上段の各ウェルに100μLの希釈ルシファーゼ基材を加えます。細胞が完全にlyseできるようにRTでマイクロプレートを10分間インキュベートします。
- マイクロプレートリーダーを使用してルシファーゼ活性を測定します。プレート リーダーの設定を表 1に示します。各読み取り値は、感染後4時間で侵入した寄生虫の初期数を表す。
- 24 時間ごとに、メディアを変更せずに、各行に対して手順 1.9 ~ 1.12 を繰り返します。これらの測定値は、感染後24時間、48時間、72時間、および96時間の複製寄生虫の総数を反映している。
- 各時点での平均測定値を計算し、4時間の平均測定値で割って、時間の経過に伴う寄生虫の成長の折り目の変化を決定します。
- グラフ作成ソフトウェアを使用してデータをプロットします。RHΔku80の代表的な成長読み取り表とプロット::NLuc寄生虫を図1A,Bに示します。
- 倍倍時間を計算するには、インキュベーション時間の個々のタイムポイントでの折り畳み変化の log2 値をプロットします。線形回帰関数を使用して、各歪みの倍加時間を表す傾きを計算します (図 1A,C)。
トキソプラズマ増殖に対する化学化合物阻害効果の評価
注:ここでは、トキソプラズマ成長におけるLHVSの阻害の評価を例に示す。LHVSの8つの異なる濃度がテストされ、3つの技術的複製がRHΔku80の両方に対して行われる::NLucおよびRHΔku80Δcpl::NLuc株NLuc。
- 寄生虫感染の前に、3行の形式で96ウェルマイクロプレートにHPFを播種し、株当たり1つの生物学的複製のための9つのカラムを得る。宿主細胞は、使用前に少なくとも7日間増殖することが許される。
- 合格 RHΔku80::NLucおよび RHΔku80Δcpl::NLuc寄生虫を使用前の 2 日間行う。寄生虫の精製と定量化の手順1.2~1.6に従ってください。フェノール赤不要培地中の寄生虫を1 x 104寄生虫/mLで再懸濁する。
- コンフルエントHFFを含むプレートから培地を吸引し、150 μLの寄生虫再懸濁液を用いて各ウェルを接種します。マイクロプレートを37°C、5%CO2で4時間2インキュベートします。
- シリアル希釈により、12ウェル貯留槽内の8つの異なる濃度でLHVSを調製します。一般的に、濃度は連続希釈方式で3倍に減少する。
注:最も低い濃度は最高濃度に対して6,561倍減少する。希釈のフォールド変化は、個々の化合物の異なる特性に基づいてそれに応じて調整することができる。 - 4時間の感染後に、吸引媒体は、非侵入寄生虫を除去し、異なる濃度でLHVSを補充した150μLの培地でカラム2-9から各井戸を充填する。最初の列は、非処理コントロールとして機能する通常のメディアで埋めておいてください。
- マイクロプレートを37°Cで、5%CO2でさらに96時間インキュベートします。2
- ステップ1.9-1.11を実行し、個々のウェルのルシファーゼ活性を測定する。
- 個々のLHVS濃度のウェルから3つの技術的複製のルシファーゼ活動を平均する。
- 各LHVS濃度の平均ルシファーゼ活性を非処置寄生虫由来の平均ルシファーゼ活性で割り、正規化されたルシファーゼ活性をパーセンテージで算出する。
- グラフ化ソフトウェアを用いて、個々のLHVS濃度に対して正規化されたルシファーゼの活動をプロットする(図2)。寄生虫の増殖に対するピリメタミンの阻害も対照として測定される。ピリメタミンは、トキソプラズマの葉酸代謝を阻害することによって急性トキソプラズマ症を治療するために使用される臨床抗生物質です。
- グラフ化ソフトウェアにおける組み込み方法を用いて個々の化合物に対するIC50値を計算し、正規化応答対[阻害剤]、回帰プログラム「用量応答阻害」の下で。IC50は、次の式を使用して計算されます。
Y = 100/(1 + X/IC50)
ここで:Yは異なる濃度の阻害剤の下での感染細胞の正常化されたルシファーゼ活性を表し、Xは阻害剤の個々の濃度を表す。
3.トキソプラズマ寄生虫におけるCRISPR-Cas9ベースの遺伝子欠失
- 目的の遺伝子を削除するためのガイドRNA(sgRNA)およびCas9を発現するプラスミド構築物の生成
- www.ToxoDB.orgに移動し、イントロンやエキソンを含む遺伝子コーディングシーケンス全体を1.5 kb 5'-UTRおよび3'-UTR(未翻訳領域)と一緒に取り出します。
注: ここでは、代表的な例としてTgCPL (TGGT1_321530) を対象とします。 - 取得したTgCPLシーケンスをシーケンス解析ソフトウェアにコピーし (名前とバージョンについては「材料表」を参照)、5'--UTR 領域と 3'-UTR 領域にラベルを付けます。
- 上部のメニューバーでツールアイコンを選択し、クローン作成を選択します。CRISPRサイトを検索します。
- PAMサイトの場所に3'(Cas9)'を選択し、特異性スコアリングセクションでトキソプラズマゲノム配列を含むフォルダを選択します。残りの設定はデフォルトのままにします。
- 次の2つの基準を持つsgRNAを選択してください:1)高い特異性スコアを示し、一般的に>98%、および2)NGGに続くGを欠いている、プロトスペースス隣接モチーフ(PAM)配列。選択されたsgRNAは、通常、対象遺伝子の開始および停止コドンに近い部位に位置する。
- 選択したsgRNAの配列をコピーし、次のプライマーテンプレートに貼り付けます。
赤色の部分は、選択されたTgCPL sgRNA配列を表す。これは、関心のある様々な遺伝子に対して異なるsgRNAに置き換えることができます。
注: 選択した sgRNA が G で始まらない場合は、G を sgRNA の先頭に追加して、その発現を強化します。 - 表2に示す設定でPCRプレミックスを用いて、トキソプラズマウラシルリン酸化転移酵素(TgUPRT)遺伝子23を標的とする既存のプラスミド発現sgRNA(図3A)を改変してPCR反応を行う。
- PCR産物をアガロースゲルで実行し、増幅が成功したことを確認します。10 kb PCR産物が増幅されると予想される(図3B)。
- DNAゲル抽出キットを使用してPCR産物を抽出し、部位特異的変異生成キットを使用してそれを円形化します。レシピについては、表 3を参照してください。RTで10〜20分間反応をインキュベートします。
- 循環PCR産物を大腸菌に変換し、10クローンを選んで設計されたsgRNAの組み込みをさらに検証します。
- 2つのクローンを成長させ、プラスミドを抽出します。精製プラスミドをBamHIとEcoRVで切ります。候補のプラスミドは、2.4 kb と 7.2 kb の 2 つのバンドを生成します (図 3C)。
- M13リバースプライマーを使用してサンガーシーケンシング用のプラスミドを送り、TgUPRT sgRNAを設計されたsgRNAと正常に交換したことを確認する(図3D)。
- www.ToxoDB.orgに移動し、イントロンやエキソンを含む遺伝子コーディングシーケンス全体を1.5 kb 5'-UTRおよび3'-UTR(未翻訳領域)と一緒に取り出します。
- HDR機構による遺伝子欠失の修復テンプレートの生成
- 選択されたsgRNAの標的部位に従って、5'-UTRの50bpまたは相同性依存組換えのための標的遺伝子の3'-UtDrを見つける(HDR、議論のセクションを参照)。領域の選択は、sgRNA標的の位置に応じて、以下に示す基準に従う。
- Cas9による切断部位が開始コドンから上流にある場合は、左HDR領域として切断部位から上流に50bpのDNA配列を、右HDR領域として停止コドンから下流に50bpのDNA配列を選択する。
- Cas9による切断部位が開始コドンとストップコドンの間にある場合は、開始コドンから上流の50bpのDNA配列を左HDR領域として、ストップコドンから下流の50bpのDNA配列を右HDR領域として選択します。
- Cas9による切断部位が停止コドンから下流に位置する場合は、開始コドンから上流の50bpのDNA配列を左HDR領域として、そして右HDR領域として切断部位から下流の50bpのDNA配列を選択する。
注:TgCPL遺伝子の場合、切断部位は開始コドンとストップコドンの間にあります。したがって、以下のプライマーは、pMDC64をテンプレートとして用い、ピリメタミン耐性カセットをコードする修復テンプレートを増幅するように設計されている。PCR増幅のためのpMDC64プラスミドに対する黒色アニールの配列。赤で標識された領域は、相同組換えのためのTgCPL特異的配列である。
- 表4に記載されているPCR条件下でPCRプレミックスを使用してPCRを実行します。
- PCR産物をアガロースゲル(図3E)で実行し、続いてゲル抽出および標準的な核酸定量手順を実行します。
注: 期待される帯域が正常に増幅できない場合は、PCR 条件やスイッチプライマーペアを最適化してください。
- 選択されたsgRNAの標的部位に従って、5'-UTRの50bpまたは相同性依存組換えのための標的遺伝子の3'-UtDrを見つける(HDR、議論のセクションを参照)。領域の選択は、sgRNA標的の位置に応じて、以下に示す基準に従う。
- トキソプラズマトランスフェクション
- RHΔku80を渡す :: コンフルエントHFFを含むT25フラスコで2日間NLuc寄生虫を通過する。完全に溶出した寄生虫のT25フラスコは、2〜3回のトランスフェクションで十分です。
- シリンジおよびフィルター精製寄生虫は、ステップ1.2に記載されている。サイトミックスバッファー内の寄生虫を再中断し、RT で 10 分間 1,000 x gでスピン ダウンします。
- ペレット化された寄生虫を10 mLのサイトミックスバッファーで洗浄し、1,000 x gで RT で 10 分間、寄生虫をスピンダウンします。
- 上清を慎重に注ぎ、1 x 108個の寄生虫/mLの濃度で同じバッファー内の寄生虫を再中断します。
- 2 μgの修復テンプレートDNAをsgRNA/Cas9発現プラスミドの20 μgと混合します(質量比= 1:5、1:3モル比に相当)。修復テンプレートの増幅収率が低い場合は、それに応じて両方のDNA片の入力を減らします。最低0.5μgの修復テンプレートを使用できます。
- 400 μL の寄生虫リサスペンション、DNA、および 200 mM ATP/500 mM の 5 μL を 1.5 mL 遠心分離管に混合してグルタチオン (GSH) を減らします。必要に応じて、総体積をサイトミックスバッファで500 μLにします。
- 寄生虫とDNAの混合物をエレクトロポレーションキュベット(4mmギャップ幅)に移し、エレクトロポレーション装置を用いてエレクトロポレーション(2kV電圧、50Ω抵抗)を行います。
- 電気ポレートされた寄生虫を新鮮なD10培地中のコンフルエントHFFを含むT25フラスコに移す。24時間後に薬物選択に適切な抗生物質を適用する。
- トランスジェニック寄生虫の増殖が安定するまで、薬物選択的圧力を保つ。
- ノックアウト集団からゲノムDNAを精製し、PCRによりピリメタミン耐性カセットをTgCPL遺伝子座に統合することを確認します。確認後、セクション 3.4 に進みます。そうでなければ、寄生虫トランスフェクションと薬物選択の別のラウンドを行います。薬剤耐性カセットの正しい統合を検出できないことは、通常、標的遺伝子が不可欠であるか、または遺伝子座がアクセスできないことを示唆している。
- ノックアウト寄生虫のクローニング
- HFF細胞を含む2つの96ウェルマイクロプレートをシードし、寄生虫をクローニングする前に21週間、37°Cと5%CO2でインキュベートします。
- コンフルエントHFFを含むT25フラスコ中のトランスジェニック寄生虫の集団の〜0.3〜0.4mLを通過し、2日間増殖させる。突然変異体が成長欠陥を示す場合は、より多くの寄生虫を通過することを検討してください。
注:最高の収量と生存率を達成するために、宿主細胞は寄生虫によって強く感染し、寄生虫のほとんどは細胞内段階に保たれています。 - シリンジは、宿主細胞に感染し、ステップ1.3で述べたように、新たに精製された新たな寄生虫を精製する。D10培地で寄生虫を再中断し、RTで10分間1,000 x gで回転させます。
- ペレット化された寄生虫をD10培地の10 mLに再懸濁する。
- 寄生虫濃度を決定するために、ヘモサイトメーターを使用して寄生虫を数えます。
- 適切な抗生物質を添加したD10培地中の10の寄生虫/mLに濃度をもたらすために2段階希釈を行う。通常、初期の寄生虫再懸濁液は1,000倍希釈され、その後に10個の寄生虫/mLに2回目の希釈が続きます。
- コンフルエントHFFを含む96ウェルマイクロプレートからの吸気培地を吸引し、希釈された寄生虫の150 μLを各ウェルに接種します。
- 37°Cでプレートをインキュベートし、5%CO2で7日間、プラーク形成を可能にする乱れなく。2トランスジェニック寄生虫が増殖欠陥を示す場合、潜伏期間は長くなる可能性があります。
- 位相コントラストの顕微鏡を使用してプレートをスクリーニングし、単一のプラークを含むウェルのみをマークします。
- コロニーPCRを実行して、正しいクローンを同定します。
- ピペットチップを使用して、感染したHFFモノレイヤーを持ち上げるために各井戸の底部を削ります。
- 各細胞の再懸濁液のピペット75 μLは、1.5 mLマイクロ遠心チューブによくマークされています。
- 遠心管はRTで最高速度で10分間慎重に吸引し、キットに用意された希釈バッファーとDNA放出添加剤を含む溶解バッファーの10.25 μLでペレットを再懸濁する(材料表)。
- RTで4分間サンプルをインキュベートし、98°Cで2分間インキュベートします。その後、PCR用にサンプルを使用するか、使用するまで-20°Cで保存することができます。3セットのPCR反応を用いて、薬剤耐性カセットの統合と目的遺伝子の損失を試験する(図4A)。PCR 反応の設定については表 5、サーモサイクラーの設定については表 6を参照してください。
- 正しいクローンを特定し、コンフルエントHFFを含むT25フラスコに4つのクローンを移す。
- 個々のクローンが宿主細胞をライスした後、ゲノムDNAをさらにPCR検証のために精製する。
- 目的のタンパク質を認識する抗体が利用可能な場合は、標準的な免疫ブロット法に従って、正しいトキソプラズマノックアウトで標的タンパク質の損失を確認します。TgCPL-欠失変異体をスクリーニングするための代表的な画像を図4B,Cに示す。
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Representative Results
図1は、RHΔku80の成長曲線の例::NLuc歪みとその倍率の計算を示す。NLuc一般に、アッセイは、ルシファーゼ活性測定値の変動を考慮して、3つの生物学的複製のそれぞれについて3つの技術的複製で行われる。寄生虫の増殖の正常化された折り目変化を計算するために、感染後24〜96時間の各読み取り値を、アッセイ中の生きた寄生虫の開始量を反映した感染後4時間の初期読み取り値で割った(図1A,B)。寄生虫の倍増時間を決定する観点から、パラサイト成長の正規化された折り目変化のlog2値を各時点に対してプロットした。次に、プロットを線形回帰関数に施し、倍倍時間を表す傾きを求めた(図1C)。
野生型およびΔcpl株におけるLHVSの阻害効果は、図2における8つの阻害剤濃度に対するルシファーゼ活性をプロットすることによって決定した。原生ルシファーゼ活性の正常化に対して阻害剤を用いない感染細胞をアッセイに含める必要がある。さらに、透明なマイクロプレートで行われる模擬実験は、アッセイ期間の終わりに寄生虫がまだ細胞内段階にあることを保証するために、アッセイに必要です。
図3では、TgCPLを標的とするsgRNA発現構築物の生成および検証とTgCPL削除のための修復テンプレートの生成を示す。元のプラスミドにコードされたTgUPRT遺伝子に一致する20bp sgRNAを、PCRベースの部位特異的変異誘発を介してTgCPL遺伝子を標的とするDNA配列に変異させた。これを達成するために、異なる遺伝子を認識するsgRNA用のDNA配列を前方プライマーに設計し、逆プライマーを変更せずにプライマー設計を容易にした。
図3Aは、元の鋳型プラスミドにおけるTgUPRT遺伝子を標的とするsgRNA DNA配列の拡大領域と、線形化sgRNA発現ベクターの生成に用いられるプライマーセットを示す。図3BBは、線形化TgCPL-標的化sgRNA発現プラスミドの代表的なゲル像を示す。図3CCは、環化TgCPL-ターゲティングsgRNA発現プラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化を示す。M13リバースプライマーを使用して、特定の遺伝子に対して生成されたsgRNA発現ベクター内に組み込まれたガイドRNAを配列した。図3DDにおいて、配列DNA領域を、突然変異誘発の成功の確認のためにプラスミド鋳型に整列させた。図3EEは、ピリメタミン耐性カセットの開始領域および終了領域を示し、プライマーがTgCPL遺伝子欠失のための修復テンプレートの製造のためにアニールできる場所を示す。修復テンプレートをPCR増幅し、サイズ検証およびゲル抽出のために1%アガロースゲルにロードしました。
TgCPLノックアウトの生成とスクリーニングの全体的な戦略を図4に示します。図4Aに示す3組のプライマーを使用して、5'--ARMと3'-ARMの正しい統合とTgCPL-コーディング配列の削除のためにTgCPL-欠失寄生虫をスクリーニングした。図4Bに示すように、一般的に、7~8個のクローンが最初にスクリーニングのために選択される。スクリーニングは通常、対象遺伝子のコード配列の欠失をチェックするから始まる。その後に5'と3'-ARMが検出され、スクリーニングされるクローンの総数を最小限に抑えることができます。図4CCに表示される免疫ブロット法によるさらなる検証は、標的タンパク質を認識する抗体が利用可能であれば完了することができる。
図1:ルシメラーゼ系法を用いたトキソプラズマ寄生虫の細胞内増殖定量(A) スプレッドシートソフトウェアにおけるロールシファーゼ活性測定値感染後24時間、48時間、72時間、96時間の測定値を、寄生虫の成長の折り目変化を計算するための感染後4時間の初期測定値に対して正規化した。(B) 正規化されたデータは平均化され、プロットされた。(C)フォールド変化のlog2値もプロットされ、寄生虫の倍加時間の決定のために線形回帰を行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ルシファーゼベースの増殖アッセイを用いたLHVSおよびピリメタミンの阻害有効性評価寄生虫を96ウェルマイクロプレートに4時間接種し、宿主細胞の浸潤を可能にした。非侵入性寄生虫を洗い流し、プレートに異なる濃度のLHVSまたはピリメタミンを含む培地を充填し、ルシファーゼ活性を決定する前にさらに96時間インキュベートした。個々の阻害剤濃度で処理された寄生虫の測定されたルシファーゼ測定値を、未処理の寄生虫から検出されたシグナルに対して正規化した。データをグラフプログラムにプロットし、IC50判定のための回帰分析を行った。アッセイは、それぞれ3つの技術的複製を用いて3つの生物学的複製で繰り返された。データは、平均±SEM、n=3生物学的複製を表す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TgCPLを標的とするsgRNAを発現するプラスミド構築物の生成およびTgCPL削除のための修復テンプレートの製造。(A)元のpSAG1-Cas9-sgRNA-UPRTプラスミド23をTgCPLにTgUPRT遺伝子を標的とするsgRNAの置換用サイト指向変異生成キットを介して改変した。sgRNAコード領域は、プライマーがアニールする領域を示すように拡大される。PCR後、変異したプラスミドを線形化し、1%アガロースゲルにロードして増幅に成功し、続いてゲル抽出を行った。(B)PCR増幅された線形化sgRNA発現構築物のゲル画像。(C)ゲル抽出後、PCR産物を円形化し、その後大腸菌に変換した。予想されるプラスミドを含むクローンを、制限エンドヌクレアーゼ消化およびDNAシーケンシングによってスクリーニングした。DNA消化後のバンドサイズは7.2 bpおよび2.4kbであった。エンドヌクレアーゼから非特異的切断によって生成されたバンドは、アスタリスクによって標識される。(D)図中に標識されたM13逆プライマーを用い、生成されたTgCPL標的sgRNA発現ベクター内の変異ガイドRNA領域を配列した。配列配列されたDNA領域をプラスミド鋳型に整列し、突然変異誘発の成功を確認した。(E)本研究では、TgCPLの5'--および3'-UtRに一致する50bp相同領域を、修復テンプレートの増幅のためのプライマーにそれぞれ設計し、PCRによってピリメサミン耐性カセットの5'-および3'-末端に横たわった。アガロースゲル電気泳動は、ゲル抽出前にPCR産物の正しいサイズを確認するために使用した。修復テンプレートの予想サイズは約 2.7 KB です。通常、5~6 μgの修復テンプレートは、200 μLのPCR反応から得られます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:TgCPL欠損寄生虫のPCRおよび免疫ブロットニングの確認。(A)トキソプラズマにおけるTgCPL-欠失の一般的な戦略と、正しいTgCPLノックアウトクローンのPCRベースのスクリーニングを示す概略図。スクリーニングに使用するプライマーにはラベルが付いています。(B)PCRおよびアガロースゲル電気泳動を使用して、ピリメタミン耐性カセットをTgCPL遺伝子に正しく統合し、TgCPL遺伝子の損失を含むクローンTgCPLを選択した。Δcpl集団のゲノムDNAは5'-および3'-ARM検出のための陽性対照として役立ち、一方、WTゲノムDNAは、TgCPL遺伝子を陽性対照として検出するために使用された。水は、陰性対照として機能するPCR反応においてDNAテンプレートの代わりに使用された。期待されるバンドは矢印で示され、非特異的なPCR増幅はアスタリスクで標識されます。(C)PCRスクリーニングにより同定されたクローン1は、細胞ライセート調製のための組織培養およびさらに免疫ブロット分析において成長させ、ノックアウトにおけるTgCPL発現の喪失を確認した。TgActinは、負荷制御として使用されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ルシフェラーゼ： | エンドポイント |
| 統合時間: | 1 s |
| フィルタセット - 放出: | フルライト |
| 光学： | ページのトップへ |
| 得る： | 135 |
| 読み取り速度: | 通常 |
| 遅延： | 100ミリ秒 |
| 読み取り高さ: | 4.5 mm |
表1:ルシメラーゼベーストキソプラズマ増殖アッセイ中のルシファーゼ活性測定用マイクロプレートリーダー設定 growth assay.
| 初期変性: | 98°C 5分間 |
| 25 サイクルの | |
| 変化： | 98°C 5s |
| 焼鈍： | 60°C 15s |
| 拡張子： | 72 °C 1分間 |
| 最終的な拡張: | 72°C 10分間 |
表2:sgRNA発現ベクターの生成に関するサーモサイクラーの設定
| サンプル | ボリューム(μl) |
| PCR産物(10-50 ng) | 1 |
| 2X KLD (キナーゼ、リガーゼ、DpnI) 反応バッファー | 5 |
| 10X KLD酵素ミックス | 1 |
| ヌクレアーゼフリー水 | 3 |
| 合計 | 10 |
表3:sgRNA発現ベクターの円形化のための反応レシピ。
| 初期変性: | 98°C 5分間 |
| 35 サイクルの | |
| 変化： | 98°C 15s |
| 焼鈍： | 58°C 15s |
| 拡張子： | 72 °C(1 kb あたり 30 秒) |
| 最終的な拡張: | 72°C 10分間 |
表4:修復テンプレートの生成のためのサーモサイクラー設定。
| サンプル | ボリューム(μl) |
| トキソプラズマゲノムDNA全 | 1 |
| フォワードプライマー(25 μM) | 0.2 |
| リバースプライマー(25 μM) | 0.2 |
| 2x PCR マスタープレミックス | 5 |
| ヌクレアーゼフリー水 | 3.6 |
| 合計 | 10 |
表5:単一トキソプラズマクローンをスクリーニングするためのコロニーPCR反応レシピ。
| 初期変性: | 98°C 5分間 |
| 35 サイクルの | |
| 変化： | 98°C 5s |
| 焼鈍： | 55 - 62 °C 5 s |
| 拡張子： | 72 °C(20秒/kb) |
| 最終的な拡張: | 72 °C 1分間 |
表6:単一トキソプラズマクローンをスクリーニングするためのサーモサイクラー設定。
| サイトミックスバッファー | 25 mM HEPES、 pH 7.6、 120 mM KCl, 10 mM K2HPO4/KH2PO4, 5 mM MgCl2, 0.015 mM CaCl2, および 2 mM EGTA. |
| D10培地 | DMEM 1X(コーニング、キャット#:10-013-CV)、10 mM HEPES、10%(v/v)宇宙子牛血清(ハイクロン、キャット#:SH30087.03)、1mMナトリウムピルビン酸、4 mM L-グルタミン、100単位/mLペニシリン、100μM/mMmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm10m |
| フェノールレッドフリー培地 | DMEM/高修飾(ハイクロン、キャット#:SH30284.02)、10 mM HEPES、10%(v/v)宇宙子牛血清(ハイクロン、キャット#:SH30087.03)、1mMナトリウムピルビン酸、4 mM Lグルタミン、100単位/mLペニシリン、100μML/mMM |
| 2X NLuc バッファー | 100 mM MES, pH 6.0, 1mM CDTA, 0.5% テルギトール, 0.05% マズDF 204, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 35 mM チオ尿素. |
補足表 1: バッファーのレシピ。
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Discussion
++このプロトコルは、細胞内トキソプラズマの成長を評価し、寄生虫の成長に対する化学化合物の阻害効果を評価するルシファーゼベースのプロトコルを記述します。細胞内トキソプラズマの成長を測定するために利用可能な既存の戦略と比較して、この方法は高感度および特異性を示す。寄生虫の成長を監視している間、明確な96ウェルマイクロプレートの模擬アッセイは、試験された株が評価期間の終了前に宿主細胞を早期にライゼしないことを確認することを推奨する。それ以外の場合、トキソプラズマは宿主細胞内でのみ複製されるため、発光測定値は寄生虫の増殖を正確に反映しません。
フェノールレッド染料はルシファーゼ活性を素早くクエンチすることが確認されており、プレートリーダーによる個々の井戸測定の遅れにより、技術的複製の間でルシファーゼの読み取り値に有意な差が生じる可能性があります。従って、96ウェルマイクロプレートに播種する前にフェノールレッドフリー培地でHPFを調製するのが最適である。また、高いルシファーゼ活性の場合、交差性干渉は、強いルシファーゼ活性を示す近隣のウェル間で有意な変動を招く可能性がある。したがって、各ひずみの間に空の列を配置することをお勧めします。
具体的には、RHΔ区80::NLuc株については、1,500個の寄生虫が増殖アッセイのために各ウェルに接種される。NLucWTトキソプラズマ寄生虫の倍時間は〜6-8時間24であるため、感染後24時間でルシファーゼ活性が8~16倍に増加すると予想される。しかし、著しい成長欠陥を有する特定の株は、ルシファーゼ活性のわずかな増加をもたらすだけである。したがって、初期の寄生虫接種が低い場合、ルシファーゼ活性の固有の変動は、成長期間にわたって発光の増加の観察をマスクする。したがって、成長不足の株の正確な折り目の変化を達成するために、寄生虫の数を多く接種することをお勧めします。
プロトコルにおいて、ガイドRNA設計は、哺乳動物細胞25におけるCRISPR-Cas9ベースのゲノム改変に用いられる一般的な規則に従う。現在、多くの種類のソフトウェアやオンラインプラットフォームは、CHOPCHOP 26、E-CRISP27、ユーパグDT28など様々な生物のガイド28RNA設計のためのサービスを提供しています。ここでは、sgRNAを設計するために市販のソフトウェア(材料表)を使用します。前述のオンラインプログラムと比較して、このソフトウェアはsgRNA設計のためのローカル環境を提供する。これは、以前に公開されたアルゴリズム25、29,29を使用して、各候補sgRNAの活性と特異性スコアを計算します。
技術的には、高い特異性スコアを含む目的の遺伝子内に位置するsgRNAは、下流の相同性依存的組換えのためのゲノムDNAの切断を効率的に仲介することができます。実際には、開始または停止コドンに近い領域を標的とするsgRNAが好ましい。目的の遺伝子は、遺伝子の末端に二本鎖ギャップを生成するsgRNAを使用して内因的にエピトープタグを付けることができます。遺伝子を欠失する前に内因的にタグ付けすることは、目的のタンパク質に対する抗体が利用できない場合に免疫ブロット法検出を介して遺伝子損失を確認するのに役立ちます。遺伝子のエピトープタグ付けは、免疫蛍光顕微鏡を介して目的のタンパク質の細胞内位置を決定するのにも役立ちます。さらに、標的遺伝子が必須である場合、遺伝子の開始領域を認識するsgRNAは、その同系プロモーターをテトラサイクリン応答性プロモーターに置換して条件付きノックアウトを生成するために使用することができる。
さらに、このプロトコルは、TgCPL遺伝子をピリメタミン耐性カセットに置き換えることによってトキソプラズマにおける遺伝子欠失の技術を記述する。他の薬剤耐性カセットをコードする異なるプラスミドテンプレートを使用することで、研究者はプライマー配列を変更して、PCRを介して他の抗生物質耐性遺伝子を修復テンプレートに組み込むことができます。さらに、このプロトコルは、内因性遺伝子のタグ付け、プロモーター置換、および部位特異的変異誘発のような他のゲノム修飾を行うように修飾することができる。このプロトコルで使用される相同領域の長さは50 bpに過ぎないことに注目に値する。別の研究は、トキソプラズマ寄生虫22における一塩基変異および遺伝子エピトープタギングを導入するために40-43 bp相同DNA配列を使用することに成功した。このような短い長さの相同DNA配列は、プライマーに容易に組み込むことができる。この特定の相同領域の長さに対するHDR効率を定量的に評価したわけではないが15,、TgKu80-欠損トキソプラズマ株における効率的なDNA組換えには40~50bp領域で十分であると思われる。
化学化合物の有効性判定の間、将来の薬剤標的遺伝子が必須である場合、野生型株とノックアウト株の間のIC50値のシフトの比較は実用的ではない。このシナリオでは、組換えタンパク質活性を阻害する化学化合物の能力を直接測定するアッセイは、薬物の効力および特異性を評価するために必要である。最近の文献は、トキソプラズマにおける個々の遺伝子の適性スコアを、ゲノムワイドCRISPRスクリーン30を行うことによって報告した。
このプロトコルは、ルシファーゼベースの細胞内トキソプラズマ成長アッセイの成功とトキソプラズマ成長に対する化学阻害剤の評価戦略を説明しています。また、トキソプラズマ寄生虫における遺伝子欠失のためのCRISPR-Cas9ベースのゲノム編集プロトコルも詳細に説明されており、この分野で広く使用されています。個々のラボは、内因性遺伝子のタグ付け、薬物選択マーカーの切り替え、細胞内寄生虫増殖の評価期間の変更などの実験ニーズに従って、説明されたプロトコルを変更することができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、pSAG1-Cas9-SgRNA-TgUPRTプラスミドおよび抗TgCPLおよびTgActin抗体を共有してくれたシブリー博士とカルーサーズ博士に感謝したいと考えています。この研究は、クレムソンスタートアップファンド(Z.D.へ)、ナイツテンプラー眼科財団小児眼科キャリアスターター研究助成金(Z.D.)、NIH COBRE助成金P20GM109094(Z.D.)、NIH R01AI143707(Z.D.へ)によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
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