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Immunology and Infection

एक लूसिफ़ेरेज़ आधारित विकास परख का उपयोग कर इंट्रासेलर टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी विकास के खिलाफ रासायनिक अवरोधक दक्षता का निर्धारण

Published: April 29, 2020 doi: 10.3791/60985
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biological Sciences, Clemson University, 2Eukaryotic Pathogens Innovation Center, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत एक कालोसिफेरेज़ आधारित विकास परख का उपयोग करटोक्सोप्लाज्मा गोंडी के इन विट्रो इंट्रासेलर विकास के खिलाफ रासायनिक यौगिकों के अवरोध प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। तकनीक का उपयोग संबंधित लक्ष्य जीन के आनुवंशिक विलोपन द्वारा अवरोध विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए किया जाता है। टीजीसीपीएल प्रोटीज़ के खिलाफ एलएचवीएस के अवरोध का मूल्यांकन एक उदाहरण के रूप में किया जाता है।

Abstract

टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी एक प्रोटोज़ोन रोगजनक है जो व्यापक रूप से मानव आबादी को प्रभावित करता है। नैदानिक टॉक्सोप्लास्मोसिस के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली वर्तमान एंटीबायोटिक्स सीमित हैं। इसके अलावा, वे लोगों के कुछ समूहों में प्रतिकूल दुष्प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। इसलिए, नैदानिक टॉक्सोप्लास्मोसिस के लिए उपन्यास चिकित्सा की खोज जरूरी है। उपन्यास एंटीबायोटिक विकास का पहला कदम उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग रणनीति का उपयोग करपरजीवी विकास के अवरोध में उच्च प्रभावकारिता दिखाने वाले रासायनिक यौगिकों की पहचान करना है। एक अनिवार्य इंट्रासेलुलर रोगजनक के रूप में, टॉक्सोप्लाज्मा केवल मेजबान कोशिकाओं के भीतर दोहराने कर सकता है, जो विकास के त्वरित संकेतक के रूप में ऑप्टिकल अवशोषण माप के उपयोग को प्रतिबंधित करता है। यहां प्रस्तुत एक लूसिफ़ेरेज़ आधारित विकास परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है । एक उदाहरण के रूप में, इस विधि का उपयोग परजीवी इंट्रासेलर विकास के अवरोध के बारे में जंगली प्रकार के टॉक्सोप्लाज्मा परजीवी के दोहरीकरण समय की गणना करने और मॉर्फोलिनुरिया-ल्यूसिल-होमोफिनाइल-विनाइल सल्फोन फिनाइल (एलएचवीएस, एक साइस्टीन प्रोटीज-लक्ष्यीकरण यौगिक) की प्रभावकारिता को मापने के लिए किया जाता है। यह भी वर्णित है, एक CRISPR-Cas9 आधारित जीन हटाने प्रोटोकॉल है Toxoplasma में ५० बीपी के मुताबिक़ क्षेत्रों का उपयोग कर homology पर निर्भर पुनर्संयोजन (HDR) के लिए । जंगली प्रकार और टीजीसीपीएल (टॉक्सोप्लास्मा कैथेप्सिन एल-लाइक प्रोटीज़) में एलएचवीएस के अवरोध की मात्रा निर्धारित करके, यह दिखाया गया है कि एलएचवीएस Δcpl जंगली प्रकार के परजीवी विकास को अधिक कुशलता से रोकता है, यह सुझाव देता है कि टीजीपीएल एक लक्ष्य है जिसे एलएचवीएस टॉक्सोप्लास्मामें बांधता है। इस लूसिफ़ेरेज़ आधारित विकास परख की उच्च संवेदनशीलता और आसान संचालन इसे टॉक्सोप्लाज्म्स्मा प्रसार की निगरानी और उच्च थ्रूपुट तरीके से दवा प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त बनाता है।

Introduction

टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी एक बेहद सफल अनिवार्य इंट्रासेलर परजीवी है जो मानव आबादी के लगभग एक तिहाई को संक्रमित करता है। इसकी उच्च पारेषण दर मुख्य रूप से संचरण के अपने विविध मार्गों के कारण है, जिसमें अधपका मांस की खपत, स्तनधारी जलाशयों के संपर्क में आना और जन्म के दौरान जन्मजात संचरण शामिल है । टी गोंदी मुख्य रूप से अवसरवादी संक्रमण का कारण बनता है जो,इम्यूनोसमझौताव्यक्तियों1, 2,23,,4,,5,,6में गंभीर रुग्णता और मृत्यु दर का कारण बन सकता है । वर्तमान में तीव्र टॉक्सोप्लास्मोसिस के इलाज के लिए उपयोग की जाने वाली एंटीबायोटिकदवाएं विशेष रूप से जन्मजात और अव्यक्त संक्रमणों के इलाज में अक्षम होती हैं और कुछव्यक्तियों3,7,8में गंभीर प्रतिक्रियाएं पैदा करती हैं । इस प्रकार, उपन्यास चिकित्सा विज्ञान की पहचान करने की तत्काल आवश्यकता मौजूद है। टॉक्सोप्लाज्मा और इसके मेजबान के भीतर उपकोशिकीय प्रक्रियाओं में अंतर को समझना संभावित दवा लक्ष्यों की पहचान करने में मदद करेगा। इसलिए, टॉक्सोप्लाज्माके भीतर व्यक्तिगत जीन की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए कुशल और सुविधाजनक जीनोम हेरफेर तकनीकों की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, टॉक्सोप्लाज्मा फिलम एपिकॉम्प्लेक्सा से संबंधित है, जिसमें प्लाज्मोडियम एसपीपी और क्रिप्टोस्पोरिडियम एसपीपी जैसे कई अन्य महत्वपूर्ण मानव रोगजनक शामिल हैं। इसलिए, टॉक्सोप्लाज्मा का उपयोग अन्य एपीकॉम्प्लेक्सन परजीवी में बुनियादी जीव विज्ञान का अध्ययन करने में मदद करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में किया जा सकता है।

माइक्रोबियल रोगजनकों के खिलाफ उपन्यास एंटीबायोटिक दवाओं की पहचान करने के लिए, रासायनिक यौगिकों की एक पुस्तकालय की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग शुरू में माइक्रोबियल विकास के दमन में उनकी प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए की जाती है। अब तक टी के इंट्रासेलर ग्रोथ को मापने के लिए माइक्रोप्लेट बेस्ड ग्रोथ परख ें तैयार की गई Toxoplasma हैं । गोंदी (यानी, रेडियोधर्मी 3एच-उरसिल इनकॉरपोरेशन-आधारित क्वांटिफिकेशन9,मात्रात्मक एलिसा आधारित परजीवी टी गोंडी-विशिष्टएंटीबॉडी10,,11,रिपोर्टर प्रोटीन-आधारित माप का उपयोग करके12,,13,और हाल ही में विकसित उच्च सामग्री इमेजिंग assay14)।

इन व्यक्तिगत रणनीतियों सभी अद्वितीय लाभ है; हालांकि, कुछ सीमाएं उनके अनुप्रयोगों को भी प्रतिबंधित करती हैं। उदाहरण के लिए, चूंकि टॉक्सोप्लाज्मा केवल न्यूक्लेट पशु कोशिकाओं, ऑटोफ्लोरेसेंस औरएंटी-टी गोंदीई एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के भीतर दोहराने के लिए कोशिकाओं की मेजबानी कर सकता है। इसके अलावा, रेडियोधर्मी आइसोटोप के उपयोग के लिए विशेष सुरक्षा अनुपालन और संभावित सुरक्षा मुद्दों की आवश्यकता होती है। इनमें से कुछ परख विकास की सतत निगरानी के बजाय एक ही समय बिंदु पर विकास का आकलन करने के लिए अधिक उपयुक्त हैं ।

यहां प्रस्तुत इंट्रासेलर टॉक्सोप्लाज्मा विकास की मात्रा के लिए एक ल्यूसिफ़ेरेबेस आधारित प्रोटोकॉल है। पिछले अध्ययन में, नैनोल्यूक ल्यूसिफ़ेरेज जीन को टॉक्सोप्लाज्मा ट्यूबलिन प्रमोटर के तहत क्लोन किया गया था, और इस लूसिफ़ेरेज़ अभिव्यक्ति निर्माण को जंगली प्रकार (RHΤku80hxg तनाव) परजीवी में स्थानांतरित किया गया था ताकि एक RH1kuku80hxgबनाया जा सके::NLuc तनाव (RHΤku80के रूप में संदर्भित:NLuc इसके बाद)15.ku80 इस तनाव ने इस अध्ययन में इंट्रासेलुलर विकास निर्धारण और जीन विलोपन के लिए माता-पिता के तनाव के रूप में कार्य किया । RHΤku80का उपयोग करना::NLuc तनाव, मानव चमड़ी फाइब्रोब्लास्ट (एचएफएफ) में परजीवी वृद्धि परजीवी दोहरीकरण समय की गणना करने के लिए संक्रमण के बाद 96 घंटे की अवधि में निगरानी की गई थी।

इसके अलावा, परजीवी विकास के खिलाफ एलएचवीएस की अवरोध प्रभावकारिता आईसी50 मूल्य की पहचान करने के लिए धारावाहिक एलएचवीएस सांद्रता के खिलाफ टॉक्सोप्लाज्मा विकास दर की साजिश रचकर निर्धारित की जा सकती है। पिछले साहित्य ने बताया है कि टीजीसीपीएल परजीवी में एलएचवीएस का एक प्रमुख लक्ष्य है और एलएचवीएस के साथ उपचार तीव्र और पुरानी टॉक्सोप्लाज्मा संक्रमण16, 17,1818,19के विकास को कम करता है ।, इसके अतिरिक्त, RHΤku80::NLuc जीनोम संशोधन के लिए माता पिता के तनाव के रूप में इस्तेमाल किया गया था एक TgCPL-कमीतनाव (RHΤku80Cpl::NLuc),और LHVS के अवरोध इस उत्परिवर्ती के खिलाफ मापा गया था । टीजीपीएलमें एलएचवीएस के लिए आईसी50 मूल्यों के एक अपशिफ्ट को देखकर डब्ल्यूटी तनाव की तुलना में कमी परजीवी, यह मान्य किया गया था कि टीजीपीएल को वीवो में एलएचवीएस द्वारा लक्षित किया गया है।

इस प्रोटोकॉल में, RHΤku80::NLuc माता पिता के तनाव के रूप में प्रयोग किया जाता है, जो एक कुशल गैर-समरूप अंत में शामिल होने के मार्ग (NHEJ) का अभाव है, जिससे डबल क्रॉसओवर होमोलॉजी-निर्भर पुनर्संयोजन (एचडीआर)20,,21की सुविधा होती है। इसके अतिरिक्त, पीसीआर द्वारा दवा प्रतिरोध कैसेट के दोनों सिरों पर 50 बीपी के मुताबिक़ क्षेत्र ों को फ्लैंक किया जाता है। पीसीआर उत्पाद CRISPR-Cas9 आधारित जीनोम संपादन उपकरणों का उपयोग करके एचडीआर के माध्यम से पूरे जीन लोकस को हटाने के लिए एक मरम्मत टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। इस तरह के छोटे मुताबिक़ क्षेत्रों को आसानी से प्राइमर में शामिल किया जा सकता है, जो मरम्मत टेम्पलेट के उत्पादन के लिए एक सुविधाजनक रणनीति प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल को सार्वभौमिक जीन विलोपन और एंडोजेनस जीन टैगिंग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

उदाहरण के लिए, हमारे सबसे हालिया प्रकाशन में, तीन प्रोटीज़ जीन, टीजीसीपीएल, टीजीसीपीबी (टॉक्सोप्लाज्मा कैथेप्सिन बी-जैसे प्रोटीज), और TgSUB1 (टॉक्सोप्लाज्मा सबटिलाइजिन की तरह प्रोटीज 1), इस विधिकाउपयोग करके टीजीसीआरटी (टॉक्सोप्लाज्मा क्लोरोक्वीन-रेजिस्टेंस ट्रांसपोर्टर) - कमी परजीवी में आनुवंशिक रूप से पकड़े गए थे। इसके अतिरिक्त, TgAMN (एक ख्यात aminopeptidase एन [TgAMN, TGGT1_221310]) एंडोजेन्सियस15टैग किया गया था । लोरीडो लैब ने साइट-निर्देशित जीन उत्परिवर्तन और टॉक्सोप्लाज्मा जीनोम में एंडोजेनस जीन टैगिंग की शुरुआत के लिए 40-4322बीपी की सीमा में छोटे मुताबिक़ क्षेत्रों का उपयोग करने की भी सूचना दी। इन सफल जीनोम संशोधनों से पता चलता है कि टीजीकेयू80-कमीवाले तनाव में कुशल डीएनए पुनर्संयोजन के लिए 40-50 बीपी के रूप में सभी क्षेत्र पर्याप्त हैं, जो टॉक्सोप्लाज्मा गोंडीमें जीनोम हेरफेर को बहुत सरल बनाता है।

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Protocol

टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी को रिस्क ग्रुप 2 में वर्गीकृत किया गया है और इसे बायोसेफ्टी लेवल 2 (बीएसएल-2) में संभाला जाना चाहिए। क्लीमसन विश्वविद्यालय में संस्थागत जैव सुरक्षा समिति द्वारा प्रोटोकॉल की समीक्षा और अनुमोदन किया गया है ।

1. लूसिफ़ेरेज़ आधारित टॉक्सोप्लाज्मा विकास परख

  1. बीज मानव चमड़ी फाइब्रोब्लास्ट (एचएफएफ) परजीवी टीका से 1 सप्ताह पहले यह सुनिश्चित करने के लिए कि मेजबान कोशिकाएं पूरी तरह से अनुकूल हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए एक पारदर्शी प्लेट में एक नकली परख करें कि परजीवी मूल्यांकन अवधि के दौरान इंट्रासेलर बने रहें।
    नोट: यहां, परख ९६ अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में आयोजित किया जाता है । प्रायोगिक जरूरतों के मुताबिक इसे 384 या 1536 वेल माइक्रोप्लेट तक पहुंचाया जा सकता है।
  2. एक T25 फ्लास्क में पूरी तरह से lysed परजीवी के ~ 0.3-0.4 mL स्थानांतरित करके उपयोग करने के लिए 2 दिन पहले Confluent HFFs में टॉक्सोप्लाज्मा परजीवी पास करें। 2 दिनों के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित मेजबान कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. इंट्रासेलर परजीवी को मुक्त करने के लिए 21 जी सुरक्षा सुई 5x के माध्यम से हौसले से लाइके वाले परजीवी की 5 मिलीग्राम सिरिंज, फिर मेजबान सेल मलबे को हटाने के लिए 3 माइक्रोन फिल्टर से गुजरती हैं। फानोल लाल मुक्त D10 मध्यम के 7 mL का उपयोग करके फ्लास्क से अवशिष्ट परजीवी कुल्ला करें, फिर फ़िल्टर से फिर से गुजरें।
  4. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 00 मीटर के लिए 1000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र परजीवी। सुपरनेट बंद डालो और फिनॉल लाल मुक्त D10 मीडिया के 10 mL में गोली फिर से निलंबित ।
  5. एकाग्रता निर्धारित करने के लिए हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करपरजीवी गिनें।
  6. जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) तनाव के लिए 1 x 104 परजीवी/mL के लिए परजीवी पतला करें। विकास की कमी परजीवी उपभेदों के लिए, लूसिफ़ेरेसंकेत संकेतों में महत्वपूर्ण वृद्धि का निरीक्षण करने के लिए तदनुसार एकाग्रता बढ़ाएं।
  7. एस्पिरेट मीडिया ध्यान से 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट्स से एचएफएफ के साथ पूर्व-वरीयता प्राप्त है और तीन स्तंभों और पांच पंक्तियों के प्रारूप में कुओं में परजीवी पुनर्निलंबन के 150 माइक्रोन का टीका लगाते हैं, जो तीन तकनीकी प्रतिकृतियों और पांच टाइमपॉइंट का प्रतिनिधित्व करता है।
  8. माइक्रोप्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 4 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेट करते हैं।
  9. गैर-आक्रमण परजीवी को हटाने के लिए कुओं से सावधानी पूर्वक एस्पिरेट मीडिया, फिर प्रत्येक पंक्ति में आरटी फेनोल लाल-मुक्त मीडिया (पहली पंक्ति को छोड़कर) के साथ कुओं को भरें।
  10. पीबीएस और 2x लूसिफ़ेरेज़ परख बफर की बराबर मात्रा मिलाएं और लूसिफ़ेरेज़ सब्सट्रेट को 12.5 माइक्रोन तक पतला करें।
  11. शीर्ष पंक्ति के प्रत्येक कुएं में पतला लूसिफ़ेरेज़ सब्सट्रेट के 100 माइक्रोन जोड़ें। 10 मिन के लिए आरटी पर माइक्रोप्लेट इनक्यूबेट ताकि कोशिकाओं को पूरी तरह से लायसे की अनुमति दी जा ।
  12. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके लूसिफ़ेरेगतिविधि को मापें। प्लेट रीडर सेटिंग्स तालिका 1में सूचीबद्ध हैं। प्रत्येक पढ़ने 4 घंटे के बाद संक्रमण पर हमला परजीवी की प्रारंभिक संख्या का प्रतिनिधित्व करता है।
  13. माध्यम को बदले बिना 4 दिनों के लिए हर 24 घंटे के लिए प्रत्येक पंक्ति के लिए चरण 1.9-1.12 दोहराएं। ये रीडिंग 24 घंटे, 48 एच, 72 एच और 96 एच पोस्ट-इंफेक्शन पर प्रतिकृति परजीवी की कुल संख्या को दर्शाती है।
  14. प्रत्येक समय बिंदु पर औसत रीडिंग की गणना करें और समय के साथ परजीवी विकास में गुना परिवर्तन निर्धारित करने के लिए उन्हें 4 घंटे में औसत रीडिंग द्वारा विभाजित करें।
  15. ग्राफिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा को प्लॉट करें। एक प्रतिनिधि विकास पढ़ने की मेज और RHΤku80के भूखंड::NLuc परजीवी चित्रा 1ए, बीमें दिखाए जाते हैं।
  16. दोहरीकरण समय की गणना करने के लिए, इनक्यूबेशन समय में व्यक्तिगत टाइमपॉइंट पर गुना परिवर्तन के लॉग2 मूल्यों को प्लॉट करें। ढलान की गणना करने के लिए एक रैखिक प्रतिगमन फ़ंक्शन का उपयोग करें, जो प्रत्येक तनाव के दोहरीकरण समय का प्रतिनिधित्व करता है(चित्रा 1ए, सी)।

2. टॉक्सोप्लाज्मा विकास के खिलाफ रासायनिक यौगिक अवरोध प्रभावकारिता का मूल्यांकन

नोट: यहां, टॉक्सोप्लाज्मा विकास में एलएचवीएस के अवरोध का मूल्यांकन एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया गया है। एलएचवीएस की आठ अलग-अलग सांद्रता का परीक्षण किया जाता है, और तीन तकनीकी प्रतिकृतिदोनों RHΤku80के लिए तीन जैविक प्रतिकृतियों में से प्रत्येक के लिए किया जाता है::NLuc और RHΤku8018::NLuc उपभेदों।

  1. परजीवी संक्रमण से पहले, बीज एचएफएफ को तीन पंक्तियों के प्रारूप में 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट और प्रति यौगिक प्रति यौगिक एक जैविक दोहराने के लिए नौ कॉलम प्रति स्ट्रेन के लिए। मेजबान कोशिकाओं को उपयोग से कम से कम 7 दिनों तक बढ़ने की अनुमति दी जाएगी।
  2. पासRH0ku80::NLuc और RH0ku8018::NLuc परजीवी उपयोग करने से पहले 2 दिनों के लिए।ku80 परजीवी शुद्धिकरण और मात्राकरण के लिए चरण 1.2-1.6 का पालन करें। 1 x 104 परजीवी/mL पर फिनॉल लाल मुक्त मीडिया में परजीवी को फिर से निलंबित करें।
  3. एक प्लेट से एस्पिरेट मीडिया जिसमें कन्फ्लोरेंट एचएफएफ होते हैं और परजीवी पुनर्सस्पेंशन के 150 माइक्रोन के साथ प्रत्येक कुएं को टीका लगाते हैं। माइक्रोप्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 4 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेट करते हैं।
  4. धारावाहिक कमजोर पड़ने से एक 12 अच्छी तरह से जलाशय में आठ अलग सांद्रता पर LHVS तैयार करें । आम तौर पर, सांद्रता एक धारावाहिक कमजोर पड़ने तरीके से तीन गुना की कमी कर रहे हैं ।
    नोट: सबसे कम एकाग्रता उच्चतम एकाग्रता के सापेक्ष 6,561 गुना कम हो जाती है। कमजोर पड़ने के गुना परिवर्तन को व्यक्तिगत यौगिकों के विभिन्न गुणों के आधार पर तदनुसार समायोजित किया जा सकता है।
  5. 4 एच के बाद संक्रमण में, गैर-आक्रमण परजीवी को हटाने और विभिन्न सांद्रता पर LHVS के साथ पूरक मीडिया के 150 μL के साथ कॉलम 2-9 से प्रत्येक अच्छी तरह से भरने के लिए एस्पिरेट मीडिया। एक गैर-इलाज नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए नियमित माध्यम से भरा पहला कॉलम छोड़ दें।
  6. माइक्रोप्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को अतिरिक्त 96 घंटे में इनक्यूबेट करलें।
  7. चरण 1.9-1.11 करें और व्यक्तिगत कुओं की लूसिफ़ेरेज गतिविधि को मापें।
  8. प्रत्येक व्यक्ति LHVS एकाग्रता के कुओं से तीन तकनीकी प्रतिकृति की लूसिफ़ेरास गतिविधियों का औसत।
  9. प्रत्येक एलएचवीएस एकाग्रता के लिए औसत लूसिफ़ेरेस गतिविधि को गैर-उपचारित परजीवी से प्राप्त औसत लूसिफ़ेरेस गतिविधि द्वारा विभाजित करें ताकि सामान्यीकृत लूसिफ़ेरेज़ गतिविधि को प्रतिशत के रूप में गणना किया जा सके।
  10. ग्राफिंग सॉफ्टवेयर(चित्रा 2)का उपयोग करके व्यक्तिगत एलएचवीएस सांद्रता के खिलाफ सामान्यीकृत लूसिफ़ेरास गतिविधियों को प्लॉट करें। परजीवी विकास के खिलाफ पाइरिमेथामाइन के अवरोध को भी नियंत्रण के रूप में मापा जाता है। पाइरिमेथमिन एक नैदानिक एंटीबायोटिक है जिसका उपयोग टॉक्सोप्लाज्मामें फोलिक एसिड मेटाबोलिज्म को बाधित करके तीव्र टॉक्सोप्लास्मोसिस का इलाज करने के लिए किया जाता है।
  11. "खुराक-प्रतिक्रिया-अवरोध" प्रतिगमन कार्यक्रम के तहत ग्राफिंग सॉफ्टवेयर में एम्बेडेड विधि का उपयोग करके व्यक्तिगत यौगिकों के लिए आईसी50 मूल्यों की गणना करें, सामान्यीकृत प्रतिक्रिया बनाम [अवरोधक]। आईसी50 की गणना निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके की जाती है:
    Y = 100/(1 + X/IC50)
    कहां: वाई अवरोधक की विभिन्न सांद्रता के तहत संक्रमित कोशिकाओं की सामान्यीकृत लूसिफ़ेरेज़ गतिविधियों का प्रतिनिधित्व करता है, और एक्स अवरोधक की व्यक्तिगत सांद्रता का प्रतिनिधित्व करता है।

3. टॉक्सोप्लाज्मा परजीवी में CRISPR-Cas9 आधारित जीन विलोपन

  1. एक प्लाज्मिड निर्माण की पीढ़ी ब्याज के एक जीन को हटाने के लिए गाइड आरएनए (sgRNA) और Cas9 व्यक्त
    1. www.ToxoDB.org पर जाएं और 1.5 केबी 5'-यूटीआर और 3'-यूटीआर (अअनुवादित क्षेत्र) के साथ-साथ इंट्रॉन और एक्सोन सहित पूरे जीन कोडिंग अनुक्रम को पुनः प्राप्त करें।
      नोट: यहां, टीजीसीपीएल (TGGT1_321530) को एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में लक्षित किया गया है।
    2. अनुक्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर में पुनः प्राप्त टीजीसीपीएल अनुक्रम की प्रतिलिपि (नाम और संस्करण के लिए सामग्री की तालिका को देखें) और 5'- और 3'-यूटीआर क्षेत्रों को लेबल करें।
    3. शीर्ष मेनू बार में टूल आइकन का चयन करें, फिर क्लोनिंग का चयन करें। CRISPR साइटों का पता लगाएं।
    4. पाम साइट स्थान के लिए 3'(Cas9) चुनें और विशिष्टता स्कोरिंग अनुभाग में टॉक्सोप्लाज्मा जीनोम अनुक्रम वाले फ़ोल्डर का चयन करें। बाकी सेटिंग्स को चूक के रूप में छोड़ दें।
    5. निम्नलिखित दो मानदंडों के साथ एक एसजीआरएनए चुनें: 1) एक उच्च विशिष्टता स्कोर दिखारहा है, आम तौर पर >98%, और 2) एनजीजी के बाद जी की कमी, एक प्रोटोस्पेसर आसन्न आदर्श (पाम) अनुक्रम। चयनित sgRNA आमतौर पर शुरू करने के करीब साइटों पर स्थित है और ब्याज के जीन के कोडन बंद करो ।
    6. चयनित एसजीआरएनए के अनुक्रम को कॉपी करें और इसे निम्नलिखित प्राइमर टेम्पलेट में चिपका दें।

      लाल रंग में भाग चयनित टीजीसीपीएल एसजीआरएनए अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है। इसे ब्याज के विभिन्न जीन के लिए अलग-अलग एसजीआरएनए से बदला जा सकता है।
      नोट: यदि चयनित sgRNA जी के साथ शुरू नहीं करता है, अपनी अभिव्यक्ति को बढ़ाने में मदद करने के लिए sgRNA की शुरुआत में जी जोड़ें ।
    7. पहले से मौजूद प्लाज्मिड व्यक्त करने के लिए एक पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन करें एसजीआरएनए(चित्रा 3ए)जो टेबल 2में प्रदान की गई सेटिंग्स के साथ पीसीआर प्रीमिक्स का उपयोग करके टॉक्सोप्लाज्मा उरसिल फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफरेज़(TgUPRT)जीन23 को लक्षित करता है।
    8. सफल प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए पीसीआर उत्पाद को अगारोज जेल पर चलाएं। 10 केबी पीसीआर उत्पाद को परिलक्षित किए जाने की उम्मीद है(चित्रा 3बी)।
    9. डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद निकालें और साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस किट का उपयोग करके इसे परिपत्रित करें। नुस्खा के लिए तालिका 3 को देखें। आरटी में 10-20 मिन के लिए प्रतिक्रिया इनक्यूबेट ।
    10. परिपत्रित पीसीआर उत्पाद को ई कोलाई में बदलें और डिजाइन किए गए एसजीआरएनए के समावेश के आगे सत्यापन के लिए 10 क्लोन चुनें।
    11. दो क्लोन उगाएं और प्लाज्मिड निकालें। बाम्बी और इकोआरवी के साथ शुद्ध प्लाज्मिड काटें। उम्मीदवार प्लाज्मिड ्स 2.4 केबी और 7.2 केबी(चित्रा 3सी)पर दो बैंड निकलेगा।
    12. डिजाइन किए गए एसजीआरएनए(चित्रा 3डी)के साथ TgUPRT sgRNA के सफल प्रतिस्थापन की पुष्टि करने के लिए M13 रिवर्स प्राइमर का उपयोग करसेंगर अनुक्रमण के लिए प्लाज्मिड भेजें।
  2. एचडीआर तंत्र के माध्यम से जीन विलोपन के लिए मरम्मत टेम्पलेट का उत्पादन
    1. चयनित एसजीआरएनए की लक्षित साइटों के अनुसार, होमोलॉजी-निर्भर पुनर्संयोजन (एचडीआर, देखें चर्चा अनुभाग) के लिए लक्ष्य जीन के 50 बीपी का पता लगाएं। क्षेत्रों का चयन नीचे सूचीबद्ध मानदंडों का पालन करता है, जो एसजीआरएनए लक्ष्यों के स्थान के आधार पर है।
      1. यदि Cas9 द्वारा दरार साइट शुरू कोडन से ऊपर स्थित है, निम्नलिखित का चयन करें: एक ५० बीपी डीएनए अनुक्रम बाएं एचडीआर क्षेत्र के रूप में दरार साइट से ऊपर की ओर, और एक ५० बीपी डीएनए अनुक्रम सही HDR क्षेत्र के रूप में बंद कोडन से बहाव ।
      2. यदि Cas9 द्वारा दरार साइट शुरू और बंद कोडन के बीच है, निम्नलिखित का चयन करें: एक ५० बीपी डीएनए अनुक्रम बाएं एचडीआर क्षेत्र के रूप में शुरू कोडन से ऊपर है, और एक ५० बीपी डीएनए अनुक्रम सही HDR क्षेत्र के रूप में बंद कोडन से बहाव ।
      3. यदि Cas9 द्वारा दरार साइट स्टॉप कोडन से डाउनस्ट्रीम स्थित है, तो निम्नलिखित का चयन करें: बाएं एचडीआर क्षेत्र के रूप में स्टार्ट कोडन से एक 50 बीपी डीएनए अनुक्रम ऊपर की ओर, और सही एचडीआर क्षेत्र के रूप में दरार साइट से 50 बीपी डीएनए अनुक्रम डाउनस्ट्रीम।
        नोट: टीजीसीपीएल जीन के लिए, दरार साइट शुरू और स्टॉप कोडन के बीच स्थित है। इस प्रकार, निम्नलिखित प्राइमर को पीएमडीसी64 का उपयोग करके मरम्मत टेम्पलेट को टेम्पलेट के रूप में बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो एक पाइरिमेथामाइन प्रतिरोध कैसेट को एन्कोड करता है। पीसीआर प्रवर्धन के लिए पीएमडीडीसी64 प्लाज्मिड को ब्लैक एनील में दृश्य। लाल रंग में लेबल किए गए क्षेत्र टीजीसीपीएल-अाेक्तिपुनर्संयोजन के लिए विशिष्ट दृश्य हैं।
    2. टेबल 4में वर्णित पीसीआर शर्तों के तहत पीसीआर प्रीमिक्स का उपयोग करपीसीआर प्रदर्शन करें ।
    3. एक अगारोज जेल(चित्रा 3ई)पर पीसीआर उत्पाद चलाएं, जिसके बाद जेल निष्कर्षण और मानक न्यूक्लिक एसिड क्वांटिफिकेशन प्रक्रियाएं हैं।
      नोट: यदि अपेक्षित बैंड को सफलतापूर्वक परिलक्षित नहीं किया जा सकता है, तो पीसीआर शर्तों का अनुकूलन करें और/या स्विच प्राइमर जोड़े।
  3. टॉक्सोप्लाज्मा ट्रांसफेक्शन
    1. पासRH180::एक T25 फ्लास्क में 2 दिनों के लिएNLuc परजीवी जिसमें कन्फ्लोरेंट एचएफएफ शामिल हैं। पूरी तरह से लिड परजीवी का एक टी-25 फ्लास्क दो से तीन ट्रांसफेक्शन के लिए पर्याप्त है।
    2. सिरिंज और फिल्टर-शुद्ध परजीवी के रूप में चरण 1.2 में वर्णित है। साइटोमिक्स बफर में परजीवी को फिर से निलंबित करें और आरटी में 10 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर स्पिन करें।
    3. साइटोमिक्स बफर के 10 मिलीग्राम के साथ पैलेट परजीवी धोएं और आरटी में 10 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर परजीवी को स्पिन करें।
    4. ध्यान से सुपरनेटेंट डालें और परजीवी को 1 x 108 परजीवी/mL की एकाग्रता पर एक ही बफर में फिर से निलंबित करें।
    5. SgRNA/Cas9 अभिव्यक्ति प्लाज्मिड्स (जन अनुपात = 1:5, एक 1:3 मोलर अनुपात के बराबर) के 20 μg के साथ मरम्मत टेम्पलेट डीएनए के मिश्रण । यदि मरम्मत टेम्पलेट की प्रवर्धन उपज कम है, तो तदनुसार दोनों डीएनए टुकड़ों के इनपुट को कम करें। मरम्मत टेम्पलेट के न्यूनतम 0.5 μg का उपयोग किया जा सकता है।
    6. परजीवी पुनर्सस्पेंशन, डीएनए, और 200 mM एटीपी/500 mM कम ग्लूटाथिएक (जीएसएच) के 5 μL के मिश्रण एक 1.5 mcent अपकेंद्रित्र ट्यूब में. यदि आवश्यक हो तो साइटोमिक्स बफर के साथ कुल मात्रा को 500 माइक्रोन तक लाएं।
    7. परजीवी और डीएनए के मिश्रण को इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट (4 एमएम गैप चौड़ाई) में स्थानांतरित करें और इलेक्ट्रोपोराशन उपकरण का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोराशन (2 केवी वोल्टेज, 50ω प्रतिरोध) करें।
    8. इलेक्ट्रोपोरेटेड परजीवी को टी-25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें ताजा डी10 माध्यम में कन्फ्लोरेंट एचएफएफ शामिल हैं। 24 घंटे के बाद दवा चयन के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक लागू करें।
    9. जब तक ट्रांसजेनिक परजीवी का विकास स्थिर न हो जाए तब तक दवा चयनात्मक दबाव रखें।
    10. नॉकआउट आबादी से जीनोमिक डीएनए को शुद्ध करें और पीसीआर द्वारा टीजीसीपीएल लोकस में पाइरिमेथामाइन प्रतिरोध कैसेट के एकीकरण की जांच करें। सत्यापित होने के बाद धारा 3.4 पर आगे बढ़ें। यदि नहीं, तो परजीवी ट्रांसफेक्शन और दवा चयन का एक और दौर करें। दवा प्रतिरोध कैसेट के सही एकीकरण का पता लगाने में असमर्थता आमतौर पर पता चलता है कि लक्ष्य जीन आवश्यक है या कि जीन लोकस सुलभ नहीं है ।
  4. नॉकआउट परजीवी की क्लोनिंग
    1. एचएफएफ कोशिकाओं के साथ दो 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट बीज और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और परजीवी क्लोनिंग से पहले 1 सप्ताह के लिए 5% सीओ2।
    2. एक टी-25 फ्लास्क में ट्रांसजेनिक परजीवी की आबादी के ~ 0.3-0.4 mL पास करें जिसमें कन्फ्लोरेंट एचएफएफ युक्त है और उन्हें 2 दिनों के लिए विकसित करें। यदि उत्परिवर्ती विकास दोषों को दर्शाता है तो अधिक परजीवी पारित करने पर विचार करें।
      नोट: सबसे अच्छी उपज और व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए, मेजबान कोशिकाएं परजीवी से भारी संक्रमित होती हैं, और अधिकांश परजीवी इंट्रासेलुलर चरण में रखे जाते हैं।
    3. सिरिंज संक्रमित मेजबान कोशिकाओं और फिल्टर-ताजा lysed परजीवी शुद्ध के रूप में चरण 1.3 में उल्लेख किया है। D10 मध्यम में परजीवी को फिर से निलंबित करें और उन्हें आरटी में 10 मीटर के लिए 1,000 x ग्राम पर स्पिन करें।
    4. D10 मध्यम के 10 mL में पैलेट परजीवी को फिर से निलंबित करें।
    5. परजीवी एकाग्रता निर्धारित करने के लिए हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके परजीवी गिनें।
    6. उचित एंटीबायोटिक के साथ पूरक D10 मध्यम में 10 परजीवी/mL के लिए एकाग्रता लाने के लिए एक दो कदम कमजोर पड़ने का संचालन करें । आमतौर पर, प्रारंभिक परजीवी पुनर्सस्पेंशन को 1,000 गुना पतला किया जाता है, जिसके बाद 10 परजीवी/एमएल के लिए दूसरा कमजोर पड़ना होता है।
    7. 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट से एस्पिरेट मीडिया जिसमें सूक्ष्म एचएफएफ होते हैं और प्रत्येक कुएं में पतला परजीवी के 150 माइक्रोन को टीका लगाते हैं।
    8. पट्टिका गठन की अनुमति देने के लिए बिना किसी गड़बड़ी के 7 दिनों के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें। यदि ट्रांसजेनिक परजीवी विकास दोषों को प्रदर्शित करते हैं तो इनक्यूबेशन अवधि लंबी हो सकती है।
    9. चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्लेटों को स्क्रीन करें और केवल एक पट्टिका वाले कुओं को चिह्नित करें।
    10. सही क्लोन की पहचान करने के लिए कॉलोनी पीसीआर को अंजाम देती हैं।
      1. संक्रमित एचएफएफ मोनोलेयर को उठाने के लिए प्रत्येक कुएं के नीचे को कुरेदने के लिए पिपेट युक्तियों का उपयोग करें।
      2. प्रत्येक चिह्नित से सेल के 75 माइक्रोन सस्पेंशन को 1.5 मिलीएम माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में अच्छी तरह से चिह्नित किया गया है।
      3. आरटी में अधिकतम गति से 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज ट्यूब। ध्यान से सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें और किट(टेबल ऑफ मैटेरियल)में प्रदान किए गए कमजोर पड़ने वाले बफर और डीएनए रिलीज एडिटिव युक्त लिसिस बफर के 10.25 माइक्रोन में पैलेट को फिर से निलंबित करें ।
      4. आरटी में 4 मिन के लिए सैंपल इनक्यूबेट, फिर 98 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिन। इसके बाद, नमूनों का उपयोग पीसीआर के लिए किया जा सकता है या उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। पीसीआर प्रतिक्रियाओं के तीन सेट दवा प्रतिरोध कैसेट के एकीकरण और ब्याज के जीन के नुकसान(चित्र4ए)के नुकसान के लिए परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जाता है । थर्मोसाइकिलर सेटिंग्स के लिए पीसीआर रिएक्शन सेटअप और टेबल 6 के लिए टेबल 5 देखें।
    11. सही क्लोन की पहचान करें और चार क्लोन को टी-25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें कन्फ्लोरेंट एचएफएफ हो।
    12. अलग-अलग क्लोन लायसे होस्ट कोशिकाओं के बाद, आगे पीसीआर सत्यापन के लिए जीनोमिक डीएनए को शुद्ध करें।
    13. यदि ब्याज के प्रोटीन को पहचानने वाला एंटीबॉडी उपलब्ध है, तो सही टॉक्सोप्लाज्मा नॉकआउट में लक्ष्य प्रोटीन के नुकसान को सत्यापित करने के लिए एक मानक इम्यूनोलॉटिंग प्रक्रिया का पालन करें। टीजीपीएल-विलोपनउत्परिवर्ती की स्क्रीनिंग के लिए प्रतिनिधि छवियां चित्र 4बी, सीमें दिखाई जाती हैं।

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Representative Results

चित्रा 1 RHΤku80के लिए एक विकास वक्र का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है::NLuc तनाव और अपने दोहरीकरण समय के लिए व्युत्पन्न गणना । आम तौर पर, परख तीन जैविक प्रतिकृतियों में से प्रत्येक के लिए तीन तकनीकी प्रतिकृति में किया जाता है ताकि लूसिफ़ेरे गतिविधि रीडिंग की विविधताओं के लिए खाते में रखा जा सके। परजीवी विकास के सामान्यीकृत गुना परिवर्तन की गणना करने के लिए, संक्रमण के बाद 24-96 एच पर प्रत्येक पढ़ने को संक्रमण के बाद 4 घंटे में प्रारंभिक रीडिंग द्वारा विभाजित किया गया था, जो परख में जीवित परजीवी की शुरुआती मात्रा को दर्शाता है(चित्रा 1ए, बी)। परजीवी दोहरीकरण समय निर्धारित करने के संदर्भ में, परजीवी विकास के सामान्यीकृत गुना परिवर्तनों के लॉग2 मूल्यों को प्रत्येक समय बिंदु के खिलाफ प्लॉट किया गया था। इसके बाद, भूखंड को ढलान प्राप्त करने के लिए एक रैखिक प्रतिगमन समारोह के अधीन किया गया था, जो दोहरीकरण समय(चित्रा 1सी)का प्रतिनिधित्व करता है।

जंगली प्रकार औरसीपीएल उपभेदों में एलएचवीएस के अवरोध का निर्धारण चित्रा 2में आठ अवरोधक सांद्रता के खिलाफ लूसिफ़ेरास गतिविधियों की साजिश रचकर किया गया था। परख में कच्चे लूसिफ़ेरे गतिविधियों को सामान्य बनाने के लिए अवरोधक उपचार के बिना संक्रमित कोशिकाओं को शामिल करना आवश्यक है। इसके अलावा, परख के लिए एक स्पष्ट माइक्रोप्लेट में किए गए एक नकली प्रयोग की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि परजीवी अभी भी परख अवधि के अंत में इंट्रासेलुलर चरण में हैं।

चित्रा 3में, टीजीसीपीएल को लक्षित करते हुए एसजीआरएनए अभिव्यक्ति निर्माण की पीढ़ी और सत्यापन और टीजीसीपीएल विलोपन के लिए मरम्मत टेम्पलेट का उत्पादन दिखाया गया है। मूल प्लाज्मिड में एन्कोड टीजीयूपीआरटी जीन से मिलान करने वाले 20 बीपी एसजीआरएनए को पीसीआर आधारित साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस के माध्यम से टीजीसीपीएल जीन को लक्षित करने वाले डीएनए अनुक्रम में परिवर्तित कर दिया गया था । इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, विभिन्न जीनों को पहचानने वाले एसजीआरएनए के लिए डीएनए दृश्यों को फॉरवर्ड प्राइमर में इंजीनियर किया गया था, जबकि रिवर्स प्राइमर को प्राइमर डिजाइन को सरल बनाने के लिए अपरिवर्तित रखा गया था ।

चित्रा 3ए मूल टेम्पलेट प्लाज्मिड में TgUPRT जीन को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए डीएनए दृश्यों के क्षेत्र में एक ज़ूम-इन क्षेत्र के साथ-साथ रैखिकीकृत sgRNA अभिव्यक्ति वेक्टर की पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर सेट को दिखाता है। चित्रा 3बी रैखिक टीजीसीपीएल-लक्ष्यीकरण sgRNA अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के एक प्रतिनिधि जेल तस्वीर से पता चलता है। चित्रा 3सी परिपत्र टीजीसीपीएलके प्रतिबंध एंनोटुकलीज पाचन को दर्शाता है - एसजीआरएनए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड को लक्षित करता है। विशिष्ट जीन के लिए उत्पन्न एसजीआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर के भीतर शामिल गाइड आरएनए को अनुक्रम करने के लिए एक M13 रिवर्स प्राइमर का उपयोग किया गया था। चित्रा 3डीमें, अनुक्रमित डीएनए क्षेत्र सफल म्यूटाजेनेसिस की पुष्टि के लिए प्लाज्मिड टेम्पलेट के अनुरूप था। चित्रा 3ई पाइरिमेथामाइन प्रतिरोध कैसेट की शुरुआत और अंत क्षेत्रों को दिखाता है, जिसमें दिखाया गया है कि जेजीसीपीएल जीन विलोपन के लिए मरम्मत टेम्पलेट के उत्पादन के लिए प्राइमर कहां एनील कर सकते हैं। मरम्मत टेम्पलेट पीसीआर-प्रवर्धित था और आकार सत्यापन और जेल निष्कर्षण के लिए 1% अगारोज जेल में लोड किया गया था।

टीजीसीपीएल नॉकआउट जनरेशन और स्क्रीनिंग के लिए समग्र रणनीति चित्रा 4में दिखाई गई है । चित्रा 4ए में दिखाए गए प्राइमर के तीन सेट ों का उपयोग टीजीसीपीएल-हटानेपरजीवी को 5'- और 3'-एआरएमएस के सही एकीकरण और टीजीसीपीएल-कोडिंगअनुक्रम को हटाने के लिए स्क्रीन करने के लिए किया गया था। जैसा कि चित्र 4बीमें दिखाया गया है, आम तौर पर, सात से आठ क्लोन शुरू में स्क्रीनिंग के लिए चुने जाते हैं । स्क्रीनिंग आमतौर पर ब्याज के जीन के लिए कोडिंग अनुक्रम को हटाने के लिए जांच के साथ शुरू होता है । इसके बाद 5 और 3'-एआरएमएस का पता लगाया जाता है, जो जांच किए जाने वाले क्लोन की कुल संख्या को कम करने में मदद करता है। यदि लक्ष्य प्रोटीन को पहचानने वाला एंटीबॉडी उपलब्ध है तो चित्रा 4सी में प्रदर्शित इम्यूनोलॉटिंग द्वारा आगे सत्यापन पूरा किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: ल्यूसिफ़ेरेज़-आधारित विधि का उपयोग करके टॉक्सोप्लाज्मा परजीवी के लिए इंट्रासेलर विकास मात्रा। (A)स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में रॉ लूसिफ़ेरेस गतिविधि रीडिंग। परजीवी विकास में गुना परिवर्तन की गणना के लिए 4 एच पोस्ट-संक्रमण में प्रारंभिक रीडिंग के खिलाफ 24 एच, 48 एच, 72 एच और 96 एच के बाद संक्रमण पर रीडिंग सामान्यीकृत की गई थी। (ख)सामान्यीकृत आंकड़ों को औसत और साजिश रची गई । (ग)गुना परिवर्तनों के लॉग2 मूल्यों को भी साजिश रची गई थी और परजीवी के दोहरीकरण समय के निर्धारण के लिए रैखिक प्रतिगमन के अधीन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ल्यूसिफ़ेरेज़ आधारित विकास परख का उपयोग करके एलएचवीएस और पाइरिमेथमाइन का अवरोध प्रभावकारिता आकलन। परजीवी मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण के लिए अनुमति देने के लिए 4 घंटे के लिए 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में टीका लगाया गया था। गैर-आक्रमण परजीवी बह गए थे, और प्लेट को मीडिया से भरा गया था जिसमें एलएचवीएस या पाइरिमेथामाइन की विभिन्न सांद्रता थी और लूसिफ़ेरे गतिविधि के निर्धारण से पहले एक अतिरिक्त 96 एच के लिए इनक्यूबेट किया गया था। व्यक्तिगत अवरोधक सांद्रता के साथ इलाज परजीवी के लिए मापा लूसिफ़ेरेरीडिंग अनुपचारित परजीवी से पता लगाए गए संकेत के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था। डेटा एक ग्राफिंग कार्यक्रम में साजिश रची गई थी, और आईसी५० दृढ़ संकल्प के लिए एक प्रतिगमन विश्लेषण किया गया था । परख तीन जैविक प्रतिकृति में दोहराया गया था तीन तकनीकी प्रतिकृति प्रत्येक के साथ । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± एसईएम, एन = 3 जैविक प्रतिकृति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्लाज्मिड निर्माण की पीढ़ी टीजीसीपीएल को लक्षित करने और टीजीसीपीएल हटाने के लिए मरम्मत टेम्पलेट के उत्पादन को व्यक्त करती है। (A)मूल pSAG1-Cas9-sgRNA-UPRT प्लाज्मिड23 को एक साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस किट के माध्यम से संशोधित किया गया था ताकि टीजीपीसीपीएलको टीजीयूपीआरटी जीन को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए के प्रतिस्थापन के लिए निर्देशित म्यूटाजेनेसिस किट हो । SgRNA कोडिंग क्षेत्र उन क्षेत्रों को दिखाने के लिए बढ़ाया गया है जिनके लिए प्राइमर एनील हैं। पीसीआर के बाद, उत्परिवर्तित प्लाज्मिड को रैखिक बनाया गया था और सफल प्रवर्धन के सत्यापन के लिए 1% अगारोज जेल में लोड किया गया था, जिसके बाद जेल निष्कर्षण था। (ख)पीसीआर-परिलक्षित रैखिकीकृत एसजीआरएनए अभिव्यक्ति का निर्माण की जेल छवि। (ग)जेल निकालने के बाद पीसीआर उत्पाद को परिपत्र बनाया गया और बाद में ई कोलाई में तब्दील कर दिया गया। अपेक्षित प्लाज्मिड वाले क्लोन की जांच प्रतिबंध एंटोन्यूलीज पाचन और डीएनए अनुक्रमण द्वारा की गई थी। डीएनए पाचन के बाद बैंड आकार 7.2 बीपी और 2.4 केबी थे। एंनोन्यूकपट्टों से गैर-विशिष्ट दरार द्वारा उत्पन्न बैंड को तारक द्वारा लेबल किया जाता है। (घ)इस आंकड़े में लेबल किए गए M13 रिवर्स प्राइमर का उपयोग उत्पन्न टीजीसीपीएल-लक्ष्यीकरणएसजीआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर के भीतर उत्परिवर्तित गाइड आरएनए क्षेत्र को अनुक्रम करने के लिए किया गया था। अनुक्रमित डीएनए क्षेत्र सफल मुतजेनेसिस की पुष्टि करने के लिए प्लाज्मिड टेम्पलेट के अनुरूप था। (ई)इस अध्ययन में, टीजीपीएल के 5'- और 3'-यूटीआर से मेल खाने वाले 50 बीपी के मुताबिक़ क्षेत्रों को मरम्मत टेम्पलेट के प्रवर्धन के लिए प्राइमर में इंजीनियर किया गया था और पीसीआर द्वारा पाइरिमेथाइन प्रतिरोध कैसेट के 5'- और 3'-सिरों पर क्रमशः, पीसीआर द्वारा किया गया था। जेल निकालने से पहले पीसीआर उत्पाद के सही आकार को सत्यापित करने के लिए अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग किया गया था। मरम्मत टेम्पलेट का अपेक्षित आकार ~ 2.7 केबी है। आमतौर पर, पीसीआर प्रतिक्रिया के 200 माइक्रोन से मरम्मत टेम्पलेट का 5-6 माइक्रोन प्राप्त किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पीसीआर और टीजीसीपीएलकी प्रतिरक्षण पुष्टि -कमी परजीवी। (A) टॉक्सोप्लाज्मा में टीजीपीएल-विलोपनकी सामान्य रणनीतियों और सही टीजीपीएल नॉकआउट क्लोन की पीसीआर आधारित स्क्रीनिंग को दर्शाती एक योजनाबद्ध आरेख। स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल होने वाले प्राइमर लेबल हैं । (ख)पीसीआर और अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग टीजीपीएल लोकस में पाइरिमेथामाइन प्रतिरोध कैसेट के सही एकीकरण और टीजीसीपीएल जीन के नुकसान वाले क्लोन का चयन करने के लिए किया गया था । सीपीएल की आबादी का जीनोमिक डीएनए 5'-और 3'-एआरएम डिटेक्शन के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता था, जबकि टीजीपीएल जीन का पता लगाने के लिए डब्ल्यूटी जीनोमिक डीएनए का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता था। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाओं में डीएनए टेम्पलेट के बजाय पानी का इस्तेमाल किया गया था। अपेक्षित बैंड तीर ों द्वारा दर्शाए जाते हैं, जबकि गैर-विशिष्ट पीसीआर प्रवर्धन तारकों द्वारा लेबल किए जाते हैं। (ग)पीसीआर स्क्रीनिंग द्वारा पहचाने गए क्लोन 1 को नॉकआउट में टीजीसीपीएल अभिव्यक्ति के नुकसान की पुष्टि करने के लिए सेल लाइसेट तैयारी और आगे इम्यूनोलॉटिंग विश्लेषण के लिए ऊतक संस्कृति में उगाया गया था । टीजीएक्टिन का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

लूसिफ़ेरेज़: समापन बिंदु
एकीकरण का समय: 1 एस
फ़िल्टर सेट - उत्सर्जन: पूर्ण प्रकाश
प्रकाशिकी: शीर्ष
लाभ: 135
गति पढ़ें: सामान्य
देरी: 100 एमएस
ऊंचाई पढ़ें: 4.5 मिमी

तालिका 1: लूसिफ़ेरेज़-आधारित टॉक्सोप्लाज्मा विकास परख के दौरान लूसिफ़ेरेज़ गतिविधि माप के लिए माइक्रोप्लेट रीडर सेटिंग्स।

प्रारंभिक निंदा: 5 मिन के लिए 98 डिग्री सेल्सियस
25 चक्र
Denaturing: 5 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस
एनियलिंग: 15 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस
एक्सटेंशन: 1 मिन के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
अंतिम विस्तार: 10 मिन के लिए 72 डिग्री सेल्सियस

तालिका 2: एसजीआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर की पीढ़ी के लिए थर्मोसाइकिलर सेटिंग्स।

नमूना वॉल्यूम (μl)
पीसीआर उत्पाद (10-50 एनजी) 1
2X केएलडी (kinase, लिगासे, DpnI) प्रतिक्रिया बफर 5
10X केएलडी एंजाइम मिक्स 1
न्यूक्लीज-मुक्त पानी 3
कुल 10

तालिका 3: एसजीआरएनए अभिव्यक्ति वेक्टर के परिपत्रीकरण के लिए प्रतिक्रिया नुस्खा।

प्रारंभिक निंदा: 5 मिन के लिए 98 डिग्री सेल्सियस
35 चक्र
Denaturing: 15 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस
एनियलिंग: 15 एस के लिए 58 डिग्री सेल्सियस
एक्सटेंशन: 30 एस प्रति केबी के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
अंतिम विस्तार: 10 मिन के लिए 72 डिग्री सेल्सियस

तालिका 4: मरम्मत टेम्पलेट के उत्पादन के लिए थर्मोसाइकिलर सेटिंग।

नमूना वॉल्यूम (μl)
कुल टॉक्सोप्लाज्मा जीनोमिक डीएनए 1
फॉरवर्ड प्राइमर (25 माइक्रोन) 0.2
रिवर्स प्राइमर (25 माइक्रोन) 0.2
2x पीसीआर मास्टर प्रीमिक्स 5
न्यूक्लीज-मुक्त पानी 3.6
कुल 10

तालिका 5: एकल टॉक्सोप्लाज्मा क्लोन की स्क्रीनिंग के लिए कॉलोनी पीसीआर रिएक्शन नुस्खा।

प्रारंभिक निंदा: 5 मिन के लिए 98 डिग्री सेल्सियस
35 चक्र
Denaturing: 5 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस
एनियलिंग: 55 - 5 एस के लिए 62 डिग्री सेल्सियस
एक्सटेंशन: 20 एस प्रति केबी के लिए 72 डिग्री सेल्सियस
अंतिम विस्तार: 1 मिन के लिए 72 डिग्री सेल्सियस

तालिका 6: एकल टॉक्सोप्लाज्मा क्लोन स्क्रीनिंग के लिए थर्मोसाइकिलर सेटिंग।

साइटोमिक्स बफर 25 एमएम एचईपी, पीएच 7.6, 120 एमएम केसीएल, 10 एमएम के2एचपीओ4/केएच2पीओ4,5 एमएम एमजीसीएल2,0.015 एमएम सीएसीएल2और 2 एमएम ईटीए।
D10 मध्यम DMEM 1X (कॉर्निंग, बिल्ली #: 10-013-CV), 10 mM HEPES, 10% (v/v) कॉस्मिक बछड़ा सीरम (Hyclone, बिल्ली #: SH30087.03), 1 mM सोडियम पायरुवेट, 4 mM एल-ग्लूटामाइन, १०० इकाइयों/पेनिसिलिन के mL, और १०० μg/ml
फेनोल लाल मुक्त माध्यम डीएमईएम/अत्यधिक संशोधित (हाइक्लोन, बिल्ली #: SH30284.02), 10 mM HEPES, 10% (v/v) कॉस्मिक बछड़ा सीरम (Hyclone, बिल्ली #: SH30087.03), 1 mM सोडियम पायरुवेट, 4 mM L-glutamine, १०० इकाइयों/पेनिसिलिन के mL, और १०० μg/mL streptomyinin ।
2X NLuc बफर 100 एमएम एमईएस, पीएच 6.0, 1एमएम सीडीटीए, 0.5% टर्गिट, 0.05% माजू डीएफ 204, 150 एमएम केसीएल, 1 एमएम डीटीटी, 35 एमएम थिओरिया।

अनुपूरक तालिका 1: बफ़र्स के लिए व्यंजनों।

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Discussion

++यह प्रोटोकॉल इंट्रासेलर टॉक्सोप्लाज्मा विकास का आकलन करने और परजीवी विकास के खिलाफ रासायनिक यौगिकों की अवरोध प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक लूसिफ़ेरेज़-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इंट्रासेलर टॉक्सोप्लाज्मा विकास को मापने के लिए उपलब्ध मौजूदा रणनीतियों की तुलना में, यह विधि उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदर्शित करती है। परजीवी विकास की निगरानी करते समय, एक स्पष्ट 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में एक नकली परख की पुष्टि करने की सिफारिश की जाती है कि परीक्षण किया गया तनाव मूल्यांकन अवधि के अंत से पहले मेजबान कोशिकाओं को समय से पहले नहीं करता है। अन्यथा, ल्यूमिनेसेंस रीडिंग परजीवी विकास को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करेगी, क्योंकि टॉक्सोप्लाज्मा केवल मेजबान कोशिकाओं के भीतर प्रतिकृति है।

यह देखा गया है कि फिनॉल लाल रंग जल्दी से ल्यूसिफ़ेरेगतिविधि को क्वेनचेस करता है, जिसके परिणामस्वरूप प्लेट रीडर द्वारा व्यक्तिगत अच्छी तरह से मापमें देरी के कारण तकनीकी प्रतिकृतियों के बीच लूसिफ़ेरेरीड में महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है। इसलिए, 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट्स में सीडिंग से पहले फिनॉल रेड-फ्री मीडियम में एचएफएफ तैयार करना इष्टतम है। इसके अलावा, उच्च लूसिफ़ेरेगतिविधि के मामले में, क्रॉस-वेल हस्तक्षेप से पड़ोसी कुओं के बीच महत्वपूर्ण भिन्नता हो सकती है जो मजबूत लूसिफ़ेरेगतिविधि का प्रदर्शन करते हैं। इसलिए, प्रत्येक तनाव के बीच एक खाली कॉलम रखने की सिफारिश की जाती है।

विशेष रूप से, RHΤku80के लिए::NLuc तनाव, 1,500 परजीवी विकास परख के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से टीका लगारहे हैं। चूंकि डब्ल्यूटी टॉक्सोप्लाज्मा परजीवी के लिए दोहरीकरण समय ~ 6-8 एच24है, इसलिए संक्रमण के बाद 8-से 16 गुना तक लूसिफ़ेरेज़ गतिविधि में वृद्धि देखने की उम्मीद है। हालांकि, महत्वपूर्ण विकास दोषों के साथ कुछ उपभेदों केवल लूसिफ़ेरेगतिविधि में थोड़ी वृद्धि होगी । इसलिए, यदि प्रारंभिक परजीवी इनोक्यूलम कम है, तो ल्यूसिफ़ेरेज़ गतिविधि में अंतर्निहित भिन्नता विकास अवधि में ल्यूमिनेसेंस में वृद्धि के अवलोकन को मुखौटा करेगी। इसलिए, विकास की कमी के साथ उपभेदों के लिए सटीक गुना परिवर्तन प्राप्त करने के लिए परजीवी की अधिक संख्या को टीका लगाने की सिफारिश की जाती है।

प्रोटोकॉल में, गाइड आरएनए डिजाइन स्तनधारी कोशिकाओं25में CRISPR-Cas9 आधारित जीनोम संशोधन के लिए उपयोग किए जाने वाले सामान्य नियमों का पालन करता है। वर्तमान में, कई प्रकार के सॉफ्टवेयर और ऑनलाइन प्लेटफॉर्म विभिन्न जीवों में गाइड आरएनए डिजाइन के लिए सेवाएं प्रदान करते हैं, जैसे चॉपचॉप26,ई-क्रिस्प27और यूपागडीटी28। यहां, एसआरएनए डिजाइन करने के लिए वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर(टेबल ऑफ मैटेरियल) काउपयोग किया जाता है। पहले उल्लिखित ऑनलाइन कार्यक्रमों की तुलना में, यह सॉफ्टवेयर एसजीआरएनए डिजाइन के लिए एक स्थानीय वातावरण प्रदान करता है। यह पहले से प्रकाशित एल्गोरिदम25,29का उपयोग करके प्रत्येक उम्मीदवार के लिए गतिविधि और विशिष्टता स्कोर की गणना करता है ।

तकनीकी रूप से, ब्याज के जीन के भीतर स्थित कोई भी एसजीआरएनए जिसमें उच्च विशिष्टता स्कोर होता है, डाउनस्ट्रीम होमोलॉजी-निर्भर पुनर्संयोजन के लिए जीनोमिक डीएनए के दरार को कुशलतापूर्वक मध्यस्थता कर सकता है। व्यवहार में, शुरू या स्टॉप कोडन के करीब किसी क्षेत्र को लक्षित करने वाले SgRNA को पसंद किया जाता है। ब्याज के जीन को एसजीआरएनए का उपयोग करके एंडोजेन्सियस एपिटोप-टैग किया जा सकता है, जो जीन के अंत में दो बार फंसे अंतर उत्पन्न करता है। एंडोजेनोजन से अपने विलोपन से पहले एक जीन टैगिंग इस मामले में इम्यूनोलॉटिंग पता लगाने के माध्यम से जीन हानि की पुष्टि करने में मदद मिलेगी कि ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं है । एक जीन के एपिटोप-टैगिंग से इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ब्याज के प्रोटीन के उप-कोशिकीय स्थान को निर्धारित करने में भी मदद मिल सकती है। इसके अलावा, यदि लक्ष्य जीन आवश्यक है, तो जीन के प्रारंभिक क्षेत्र को पहचानने वाले एसजीआरएनए का उपयोग सशर्त नॉकआउट उत्पन्न करने के लिए एक टेट्रासाइक्लिन-उत्तरदायी प्रमोटर के लिए अपने कॉग्नेट प्रमोटर के प्रतिस्थापन के लिए किया जा सकता है।

इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल एक पाइरिमेथामाइन प्रतिरोध कैसेट के साथ TgCPL जीन की जगह द्वारा टॉक्सोप्लाज्मा में जीन हटाने के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है । अन्य दवा प्रतिरोध कैसेट एन्कोडिंग विभिन्न प्लाज्मिड टेम्पलेट्स का उपयोग करके, जांचकर्ता पीसीआर के माध्यम से मरम्मत टेम्पलेट में अन्य एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को शामिल करने के लिए प्राइमर दृश्यों को संशोधित कर सकते हैं। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को अन्य जीनोम संशोधनों को करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जैसे अंतर्जात जीन टैगिंग, प्रमोटर प्रतिस्थापन, और साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस। गौरतलब है कि इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाले मुताबिक़ क्षेत्रों की लंबाई में सिर्फ 50 बीपी होते हैं। टॉक्सोप्लाज्मा परजीवी22में एकल-न्यूक्लियोटाइड म्यूटेशन और जीन एपिटोप टैगिंग शुरू करने के लिए एक अलग अध्ययन ने 40-43 बीपी के अनुसार डीएनए दृश्यों का सफलतापूर्वक उपयोग किया । इतनी कम लंबाई में मुताबिक़ डीएनए दृश्यों को आसानी से प्राइमर में शामिल किया जा सकता है। यद्यपि हमने समरूप क्षेत्र की इस विशेष लंबाई के लिए एचडीआर दक्षता का मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन नहीं किया था, ऐसा लगता है कि टीजीकु80-कमी वाले टॉक्सोप्लाज्मा तनाव में कुशल डीएनए पुनर्संयोजन के लिए 40-50 बीपी क्षेत्र पर्याप्त है, जैसा कि हाल ही में15,,22प्राप्त किए गए कई जीनों के सफल आनुवंशिक हेरफेर का सबूत है।

रासायनिक यौगिकों के प्रभावकारिता निर्धारण के दौरान, यदि संभावित दवा लक्ष्य जीन आवश्यक है, तो जंगली प्रकार और नॉकआउट उपभेदों के बीच आईसी५० मूल्यों में बदलाव की तुलना व्यावहारिक नहीं है । इस परिदृश्य में, दवाओं की प्रभावकारिता और विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए पुनः संयोजन प्रोटीन गतिविधि को बाधित करने के लिए रासायनिक यौगिकों की क्षमता को सीधे मापने वाली परख की आवश्यकता होती है। हाल ही में साहित्य एक जीनोम वाइड CRISPR स्क्रीन30,जो एक गाइड के रूप में मदद करने के लिए ब्याज के जीन के लिए एक सीधे नॉकआउट उत्परिवर्ती पैदा करने की कठिनाई का आकलन करने के द्वारा Toxoplasma में व्यक्तिगत जीन के फिटनेस स्कोर की सूचना दी ।

एक साथ लिया, प्रोटोकॉल एक लूसिफ़ेरे आधारित इंट्रासेलुलर टॉक्सोप्लाज्मा विकास परख और टॉक्सोप्लाज्मा विकास के खिलाफ रासायनिक अवरोधकों के लिए एक मूल्यांकन रणनीति के सफल पूरा होने का वर्णन करता है । इसके अलावा विस्तृत टॉक्सोप्लाज्मा परजीवी में जीन विलोपन के लिए एक CRISPR-Cas9 आधारित जीनोम संपादन प्रोटोकॉल है, जिसका क्षेत्र में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। व्यक्तिगत प्रयोगशालाएं प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार वर्णित प्रोटोकॉल को संशोधित कर सकती हैं, जैसे कि एंडोजेनस जीन टैगिंग, ड्रग चयन मार्कर स्विच करना, और इंट्रासेलर परजीवी विकास के लिए मूल्यांकन अवधि में फेरबदल करना।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT प्लाज्मिड और एंटी-टीजीसीपीएल और टीजीएक्टिवन एंटीबॉडी साझा करने के लिए डीआरएस सिबली और कैरूथर्स का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को क्लेमसन स्टार्टअप फंड (जेडडी) द्वारा समर्थित किया गया था, शूरवीर टमप्लर आई फाउंडेशन पीडियाट्रिक नेत्र विज्ञान कैरियर-स्टार्टर रिसर्च ग्रांट (जेड डी को), एक एनआईएच COBRE अनुदान P20GM109094 (जेड डी के लिए) का प्रायोगिक अनुदान, और NIH R01AI143707 (जेड डी के लिए)। फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose gel extraction kit New England BioLabs T1020L
BamHI New England BioLabs R0316S
Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader BioTek Instuments
BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System Harvard Apparatus
Chemically competent E. coli cells New England BioLabs C29871
CloneAmp HiFi PCR premix Takara Bio 639298
Coelenterazine h Prolume 301-10 hCTZ
EcoRV New England BioLabs R3195S
Phire Tissue Direct PCR Master Mix Thermo Scientific F170L
Plasmid miniprep kit Zymo Research D4054
Q5 Site-Directed Mutagenesis kit New England BioLabs E0554S
Software
Geneious software for sgRNA design (version: R11)
GraphPad Prism software (8th version)
SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11)

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References

  1. Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
  2. Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
  3. Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
  4. Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
  5. Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
  6. Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
  7. Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
  8. Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
  9. Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
  10. Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
  11. Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
  12. McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
  13. Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
  14. Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
  15. Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
  16. Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
  17. Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
  18. Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
  19. Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
  20. Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
  21. Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
  22. Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
  23. Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
  24. Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
  25. Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  26. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  27. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
  28. Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
  29. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  30. Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).

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एक लूसिफ़ेरेज़ आधारित विकास परख का उपयोग कर इंट्रासेलर <em>टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी</em> विकास के खिलाफ रासायनिक अवरोधक दक्षता का निर्धारण
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Key, M., Bergmann, A., Micchelli, C., Thornton, L. B., Millard, S., Dou, Z. Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay. J. Vis. Exp. (158), e60985, doi:10.3791/60985 (2020).

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