Summary
여기서 제시된 프로토콜은 루시퍼라제 기반 성장 분석을 사용하여 톡소플라즈마 곤디의 시험관내 세포내 성장에 대한 화학화합물의 억제 효능을 평가하는 프로토콜이다. 이 기술은 해당 표적 유전자의 유전적 결실에 의한 억제 특이성을 확인하는 데 사용된다. TgCPL 프로테아제에 대한 LHVS의 억제는 예로 평가된다.
Abstract
톡소플라즈마 곤디는 인간 인구에 널리 영향을 미치는 원생동물 병원체입니다. 임상 톡소플라즈마증 치료에 사용되는 현재 항생제는 제한적입니다. 또한, 그들은 사람들의 특정 그룹에 불리 한 부작용을 전시. 따라서 임상 톡소 플라즈마 증에 대한 새로운 치료법의 발견이 필수적입니다. 새로운 항생제 개발의 첫 번째 단계는 높은 처리량 선별 전략을 사용하여 기생충 성장억제에 높은 효능을 보이는 화학 화합물을 식별하는 것입니다. 의무적인 세포내 병원균으로서 Toxoplasma는 숙주 세포 내에서만 복제할 수 있으며, 이는 성장의 빠른 지표로서 광학 흡광도 측정의 사용을 금지합니다. 여기서 제시된 루시퍼라제 기반 성장 분석에 대한 상세한 프로토콜이다. 일례로, 이 방법은 야생형 톡소플라즈마 기생충의 두 배 시간을 계산하고 기생충 세포내 성장억제에 관한 모르폴리누레아-류필-호모페닐-비닐 설폰 페닐(LHVS, 시스테인 프로테아제 표적화합물)의 효능을 측정하는데 사용된다. 또한, 상동성 의존적 재조합(HDR)을 위한 50 bp 상동 영역을 사용하는 톡소플라즈마에서 CRISPR-Cas9 기반 유전자 결실 프로토콜이 기술된다. 야생형 및 TgCPL(톡소플라즈마 카테신 L-like protease)-결핍 기생충에서 LHVS의 억제 효능을 정량화함으로써, LHVS가 Δcpl 성장보다 야생형 기생충 성장을 보다 효율적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 TgCPL이 LHVS가 톡소플라즈마에결합하는 표적임을 시사한다.Toxoplasma 이 루시퍼라제 기반 성장 분석법의 높은 감도와 쉬운 작동은 톡소플라즈마 증식을 모니터링하고 높은 처리량 방식으로 약물 효능을 평가하는 데 적합합니다.
Introduction
톡소 플라즈마 곤디는 인간 인구의 약 1/3을 감염시키는 매우 성공적인 세포 내 기생충입니다. 그것의 높은 전송 속도는 주로 전염의 그것의 다양 한 경로 에 기인, undercooked 된 고기의 소비를 포함 하 여, 포유류 저수지에 노출, 그리고 출생 시 선천성 전송. T. gondii는 주로 면역 손상된개별에있는 가혹한 이환율 그리고 사망으로 이끌어 낼 수 있는 기회 감염을 일으키는 원인이 됩니다1,2,,3,,4,5,6.,6 현재 급성 톡소플라즈마증 치료에 사용되는 항생제는 선천성 및 잠복성 감염 치료에 특히 비효율적이며 일부3개인3,7,,8에서심각한 반응을 일으킨다. 따라서 새로운 치료법을 식별할 긴급한 필요성이 존재합니다. Toxoplasma 및 그 숙주 내의 세포내 과정의 차이를 이해하면 잠재적인 약물 표적을 식별하는 데 도움이 됩니다. 따라서, 효율적이고 편리한 게놈 조작 기술은 Toxoplasma내의 개별 적인 유전자의 역할을 공부하는 것을 요구됩니다. 또한, 톡소플라즈마는 플라스모듐 종과 크립토스포리듐 종과 같은 다른 중요한 인간 병원균을 포함하는 물리 균 Apicomplexa에 속한다. 따라서, Toxoplasma는 다른 양봉체 기생충에 있는 기본적인 생물학을 공부하는 것을 돕기 위하여 모형 유기체로 이용될 수 있습니다.
미생물 병원체에 대하여 새로운 항생제를 확인하기 위하여는, 화학 화합물의 도서관의 높은 처리량 검열은 미생물 성장의 억압에 있는 그들의 효험을 결정하기 위하여 처음에 수행됩니다. 지금까지, 몇몇 마이크로플레이트 기지를 둔 성장 측정은 T의 세포내 성장을 측정하기 위해 개발되었습니다. 곤디(즉, 방사성 3H-우라실 혼입 기반 정량화9, T. gondii-specific항체10,,11,β-갈락토시다아제 또는 YFP 발현 독소플라즈마 균주12,,13,및 최근 개발된 고함량을 이용한 단백질 기반 측정을 이용한 정량적 ELISA 기반 기생충 검출).14
이러한 개별 전략은 모두 고유한 장점을 가지고 있습니다. 그러나 특정 제한 사항도 응용 프로그램을 제한합니다. 예를 들어, Toxoplasma는 핵화 된 동물 세포 내에서만 복제 할 수 있기 때문에,항-T. gondii 항체의 자가 형광 및 비특이적 결합은 형광 기반 측정에서 간섭을 유발합니다. 또한 방사성 동위원소의 사용에는 특별한 안전 준수 및 잠재적안전 문제가 필요합니다. 이러한 검소 중 일부는 성장을 지속적으로 모니터링하기보다는 단일 시점에서 성장을 평가하는 데 더 적합합니다.
여기서 제시된 것은 세포내 톡소플라즈마 성장의 정량화를 위한 루시퍼라제 기반 프로토콜이다. 이전 연구에서, 나노루크 루시퍼라제 유전자는 톡소플라즈마 튜불린 프로모터하에 복제되었고, 이러한 루시퍼라제 발현 구조는 RHΔku80Δhxg를생성하기 위해 야생형(RHΔku80Δhxg 균주)으로 형질전환되었다::NLuc 균주(이하 RHΔku80::NLuc)는 15. 이 균주는 이 연구 결과에 있는 세포내 성장 결정 및 유전자 삭제를 위한 부모 긴장으로 봉사했습니다. RHΔku80을사용하여 ::NLuc 균주, 인간 포피 섬유아세포에서의 기생충 성장(HFFs)은 기생충 을 두 배로 계산하기 위해 감염 후 96시간 동안 모니터링하였다.
또한, 기생충 성장에 대한 LHVS의 억제 효능은 IC50 값을 식별하기 위해 직렬 LHVS 농도에 대하여 톡소플라즈마 성장 속도를 플로팅함으로써 결정될 수 있다. 이전 문헌은 TgCPL이 기생충에서 LHVS의 주요 표적이며 LHVS로 치료하는 것이 급성 및 만성 톡소플라즈마 감염의 발병을 감소시키고 있다고 보고했으며,16,,17,,18,,19. 추가적으로, RHΔku80::NLuc는 TgCPL-결핍균주를 생성하기 위한 게놈 변형을 위한 부모 균주로서 사용하였다(RHΔku80Δcpl::NLuc),및 LHVS의 억제는 이 돌연변이체에 대하여 측정되었다. TgCPL균주에 비해 TgCPL-결핍 기생충에서 LHVS에 대한 IC50 값의 상승 변화를 관찰함으로써, TgCPL이 생체 내 LHVS에 의해 표적화된다는 것이 입증되었다.
이 프로토콜에서, RHΔku80::NLuc는 효율적인 비 상동성 최종 결합 경로 (NHEJ)가 결여된 부모 변형으로 사용되어 이중 크로스 오버 상동성 의존 재결합 (HDR)20,,21을촉진합니다. 추가적으로, 50 bp 상동 영역은 PCR에 의한 약물 내성 카세트의 양단에 측면화된다. PCR 제품은 CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집 도구를 사용하여 HDR을 통해 전체 유전자 궤적을 제거하는 수리 템플릿역할을 합니다. 이러한 짧은 상동 영역은 쉽게 수리 템플릿의 생산을위한 편리한 전략을 제공 프라이머에 통합 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 보편적인 유전자 결실 및 내인성 유전자 태깅을 수행하도록 변형될 수 있다.
예를 들어, 가장 최근의 간행물에서, 3개의 프로테아제 유전자, TgCPL, TgCPB (톡소플라즈마 카테신 B-like 프로테아제), 및 TgSUB1 (톡소플라즈마 서브틸리신 유사 프로테아제 1), 이 방법을 사용하여 TgCRT(톡소플라즈마 클로로퀸-내성 수송기)-결핍 파라소에 유전적으로 절제되었다15.Toxoplasma 또한, TgAMN TgAMN(아미노펩티다아제 N[TgAMN, TGGT1_221310])은내인성 태그(15)를태그하였다. Lourido lab은 또한 유사한 방법22를사용하여 톡소플라즈마 게놈에서 사이트 지향 유전자 돌연변이 및 내인성 유전자 태깅의 도입을 위해 40-43 bp의 범위에서 짧은 상동 영역을 사용하여 보고하였다. 이러한 성공적인 게놈 변형은 40-50 bp 상동 영역이 Toxoplasma 곤디에서게놈 조작을 크게 단순화하는 TgKU80-결핍균주에서 효율적인 DNA 재조합을 위해 충분하다는 것을 시사한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
톡소플라즈마 곤디는 위험 군 2로 분류되며 생물안전성 수준 2(BSL-2)에서 처리해야 합니다. 이 프로토콜은 클렘슨 대학의 기관 생물 안전위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 루시퍼라제 기반 톡소플라즈마 성장 분석
- 종자 인간 포피 섬유아세포 (HFFs) 기생충 접종 1 주일 전에 숙주 세포가 완전히 결합되도록합니다. 시험 기간 내내 기생충이 세포 내상태로 남아 있도록 투명 플레이트에서 모의 분석기를 수행합니다.
참고 : 여기서, 분석은 96 웰 마이크로 플레이트에서 수행됩니다. 실험적 필요에 따라, 384 또는 1536 웰 마이크로 플레이트까지 확장 될 수있다. - 완전히 용해된 기생충의 ~0.3-0.4 mL를 T25 플라스크로 이송하여 사용 2일 전에 톡소플라즈마 기생충을 동류 HF에 넣습니다. 37°C에서 감염된 숙주 세포를 2일 동안 5%CO2로 배양한다.
- 주사기 5 mL의 갓 용해된 기생충을 21 G 안전 바늘 5x를 통해 세포 내 기생충을 해방한 다음 3 μm 필터를 통과하여 숙주 세포 파편을 제거합니다. 페놀 무첨가 D10 배지 7 mL를 사용하여 플라스크에서 잔류 기생충을 헹구고 다시 필터를 통과시다.
- 실온 (RT)에서 10 분 동안 1000 x g의 원심 분리기 기생충. 상급체를 붓고 페놀 이물질이 없는 D10 용지 10 mL에 펠릿을 다시 놓습니다.
- 혈독계를 사용하여 기생충을 세어 농도를 결정합니다.
- 야생 형 (WT) 변형에 대한 1 x 104 기생충 / mL에 기생충을 희석. 성장 결핍 기생충 긴장에 대 한, 그에 따라 농도 증가 luciferase 신호에 상당한 증가 관찰.
- HfFs를 미리 시드한 96개의 웰 마이크로플레이트에서 조심스럽게 흡인 매체를 접종하고 3개의 기둥과 5개의 행의 형태로 우물에 기생충 재서스펜션150 μL을 접종하여 3개의 기술적 복제와 5개의 타임포인트를 나타냅니다.
- 마이크로플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 4시간 동안 배양한다.
- 비 침략 기생충을 제거하기 위해 우물에서 조심스럽게 미디어를 흡인 한 다음 각 행의 RT 페놀 적색 매개 로 우물을 채웁니다 (첫 번째 행 제외).
- 동일한 부량의 PBS 및 2x 루시퍼라제 분석 버퍼를 혼합하고 루시퍼라아제 기판을 12.5 μM으로 희석합니다.
- 100 μL의 희석 루시퍼라아제 기판을 상단 행의 각 웰에 넣습니다. 세포가 완전히 용해 될 수 있도록 10 분 동안 RT에서 마이크로 플레이트를 배양.
- 마이크로플레이트 리더를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 플레이트 판독기 설정은 표 1에나열되어 있습니다. 각 독서는 감염 후 4 시간에서 침략 된 기생충의 초기 수를 나타냅니다.
- 매번 24시간마다 매 번 매 24시간마다 매번 1.9-1.12단계를 반복하여 매체를 변경하지 않고 4일 동안 반복합니다. 이 수치는 24 h, 48 h, 72 h 및 96 h 사후 감염에서 복제된 기생충의 총 수를 반영합니다.
- 각 시점에서 평균 수치를 계산하고 시간 지남에 따라 기생충 성장의 배 변화를 결정하기 위해 4 h의 평균 판독값으로 나눕니다.
- 그래프 소프트웨어를 사용하여 데이터를 플로팅합니다. RHΔku80의대표적인 성장 독서표 및 플롯 ::NLuc 기생충은 그림 1A, B에도시되어 있습니다.
- 두 배의 시간을 계산하려면 인큐베이션 시간 동안 개별 타임포인트에서 배변화의 log2 값을 플로팅합니다. 선형 회귀 함수를 사용하여 각 변형의 두 배 시간을 나타내는 경사를 계산합니다(그림1A, C).
2. 톡소플라즈마 성장에 대한 화학적 화합물 억제 효능 평가
참고: 여기서, 톡소플라즈마 성장에서의 LHVS의 억제에 대한 평가가 예로 제시된다. 8개의 상이한 농도의 LHVS가 시험되고, RHΔku80모두에 대한 3개의 생물학적 복제에 대해 3개의 기술적 복제가 수행된다::NLuc 및 RHΔku80Δcpl::NLuc 균주.
- 기생충 감염 에 앞서, 종자 HFs 96 잘 마이크로 플레이트의 형식으로 3 행과 균주 당 화합물 당 하나의 생물학적 복제에 대한 아홉 열. 숙주 세포는 사용하기 전에 적어도 7 일 동안 성장할 수 있습니다.
- RHΔku80통과 ::NLuc 및 RHΔku80Δcpl::NLuc 기생충을 사용하기 전 2 일 동안. 기생충 정화 및 정량화를 위한 1.2-1.6 단계를 따르십시오. 1 x 104 기생충 / mL에서 페놀 적색이없는 미디어에서 기생충을 다시 중단하십시오.
- 동시 HHFFs를 포함하는 플레이트로부터 매질 을 흡기하고 각각의 우물을 150 μL의 기생충 재서스펜션으로 접종한다. 마이크로플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 4시간 동안 배양한다.
- 직렬 희석에 의해 12웰 저수지에서 8개의 다른 농도로 LHVS를 준비한다. 일반적으로, 농도는 직렬 희석 방식으로 3배 씩 감소된다.
참고: 가장 낮은 농도는 가장 높은 농도에 비해 6,561배 감소합니다. 희석의 접이식 변화는 개별 화합물의 상이한 특성에 기초하여 그에 따라 조절될 수 있다. - 감염 후 4시간에서, 흡인 매체는 침입되지 않은 기생충을 제거하고 다른 농도에서 LHVS로 보충된 150 μL의 열 2-9에서 각각 잘 채웁니다. 첫 번째 열을 일반 매체로 채워진 상태로 두어 처리되지 않은 컨트롤로 역할을 합니다.
- 마이크로플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 추가로 96시간 동안 배양한다.
- 1.9-1.11 단계를 수행하고 개별 우물의 루시퍼라아제 활성을 측정합니다.
- 각 개별 LHVS 농도의 우물에서 3개의 기술적 복제물의 루시퍼라아제 활동을 평균화한다.
- 각 LHVS 농도에 대한 평균 루시퍼라아제 활성을 비처리 된 기생충으로부터 유래 된 평균 루시퍼라아활성으로 나누어 정규화된 루시퍼라아제 활성을 백분율로 계산한다.
- 그래프 소프트웨어를 사용하여 개별 LHVS 농도에 대해 정규화된 루시퍼라아제 활동을 플로팅합니다(그림2). 기생충 성장에 대 한 피리메타민의 억제는 또한 대조군으로 측정. 피리메타민은 톡소플라즈마에서엽산 대사를 억제하여 급성 톡소플라즈마증을 치료하는 데 사용되는 임상 항생제이다.
- "투여량-반응 억제" 회귀 프로그램 하에서 그래프 소프트웨어, 정규화된 반응 대 [억제제]에 포함된 방법을 사용하여 개별 화합물에 대한 IC50 값을 계산합니다. IC50은 다음 수식을 사용하여 계산됩니다.
Y = 100/(1 + X/IC50)
어디에: Y는 억제제의 다른 농도의 밑에 감염된 세포의 정규화된 luciferase 활동을 나타내고, X는 억제제의 개별적인 사격량을 나타냅니다.
3. 톡소플라즈마 기생충의 CRISPR-Cas9 기반 유전자 삭제
- 관심 있는 유전자를 삭제하기 위한 가이드 RNA(sgRNA) 및 Cas9를 발현하는 플라스미드 구조의 생성
- www.ToxoDB.org 가서 1.5 kb 5'-UTRs 및 3'-UTR (번역되지 않은 지역)와 함께 인트론 및 엑손을 포함한 전체 유전자 코딩 서열을 검색합니다.
참고: 여기서 TgCPL(TGGT1_321530)은 대표적인 예로 타겟팅됩니다. - 검색된 TgCPL 시퀀스를 시퀀스 분석 소프트웨어에 복사하고(이름 및 버전에 대한 재료 표 참조) 5'- 및 3'-UTR 영역에 레이블을 지정합니다.
- 상단 메뉴 모음에서 도구 아이콘을 선택한 다음 복제 | CRISPR 사이트 찾기.
- PAM 부위 위치에 대해 3'(Cas9)'을 선택하고 특이성 채점 섹션에서 톡소플라즈마 게놈 서열을 포함하는 폴더를 선택한다. 나머지 설정을 기본값으로 둡니다.
- 다음 두 가지 기준을 가진 sgRNA를 선택한다: 1) 높은 특이성 점수를 나타내고, 일반적으로 >98%, 및 2) NGG, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 따른 G가 결여된다. 선택된 sgRNA는 일반적으로 관심 있는 유전자의 시작 및 정지 코돈에 가까운 사이트에 위치한다.
- 선택한 sgRNA의 시퀀스를 복사하여 다음 프라이머 템플릿에 붙여넣습니다.
빨간색의 부분은 선택된 TgCPL sgRNA 서열을 나타낸다. 그것은 관심의 다양한 유전자에 대한 다른 sgRNAs로 대체 될 수있다.
참고: 선택한 sgRNA가 G로 시작하지 않는 경우, sgRNA의 시작 부분에 G를 추가하여 발현을 향상시킵니다. - PCR 반응을 수행하여 독소플라즈마 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제(TgUPRT)유전자(23)를 표적화하는TgUPRT기존의 플라스미드 발현 sgRNA(도3A)를수정하여 PCR 프리믹스를 이용하여 표 2에제공된 설정을 사용한다.
- 아가로즈 젤에 PCR 제품을 실행하여 성공적인 증폭을 확인합니다. 10kb PCR 제품이 증폭될 것으로 예상됩니다(그림3B).
- DNA 겔 추출 키트를 사용하여 PCR 생성물을 추출하고 사이트 지시 돌연변이 키트를 사용하여 원형화합니다. 레시피는 표 3을 참조하십시오. RT에서 10-20 분 동안 반응을 배양하십시오.
- 원형화된 PCR 제품을 대장균으로 변환하고 10개의 클론을 선택하여 설계된 sgRNA의 통합을 추가로 검증합니다.
- 두 개의 클론을 성장하고 플라스미드를 추출합니다. BamHI 및 EcoRV로 정제 된 플라스미드를 잘라냅니다. 후보 플라스미드는 2.4 kb및 7.2 kb(그림 3C)에서두 개의 밴드를 산출합니다.
- M13 역프라이머를 사용하여 Sanger 시퀀싱용 플라스미드를 보내 TgUPRT sgRNA를 설계된 sgRNA로 성공적으로 교체하는 것을 확인합니다(도3D).
- www.ToxoDB.org 가서 1.5 kb 5'-UTRs 및 3'-UTR (번역되지 않은 지역)와 함께 인트론 및 엑손을 포함한 전체 유전자 코딩 서열을 검색합니다.
- HDR 메커니즘을 통한 유전자 삭제를 위한 수리 템플릿 생성
- 선택된 sgRNA의 표적부위에 따르면, 5'-UTR 또는 3'-UTR의 50 bp를 찾아 상동성 의존재결합을 위한 표적 유전자(HDR, 토론 섹션 참조). 영역의 선택은 sgRNA 가 표적으로 하는 위치에 따라 아래에 나열된 기준을 따릅니다.
- Cas9에 의한 절단 부위가 시작 코돈으로부터 상류에 위치하는 경우, 다음을 선택한다: 좌측 HDR 영역으로서 골짜기 부위로부터 50 bp DNA 서열 상류, 및 오른쪽 HDR 영역으로서 정지 코돈으로부터 50 bp DNA 서열 하류.
- Cas9에 의한 절단 부위가 코돈 시작과 정지 사이에 있는 경우, 다음을 선택한다: 50 bp DNA 서열은 왼쪽 HDR 영역으로서 시작 코돈으로부터 상류로, 및 50 bp DNA 서열은 오른쪽 HDR 영역으로서 정지 코돈으로부터 다운스트림.
- Cas9에 의한 절단 부위가 스톱 코돈으로부터 하류에 위치하는 경우, 다음을 선택한다: 좌측 HDR 영역으로서 시작 코돈으로부터 50 bp DNA 서열 상류, 및 50 bp DNA 서열 하류에서 오른쪽 HDR 영역으로 절단 부위로부터 의한 하류.
참고: TgCPL 유전자의 경우, 절단 부위는 코돈 시작과 정지 사이에 위치한다. 따라서, 다음 의 프라이머는 피리메타민 저항 카세트를 인코딩하는 템플릿으로서 pMDC64를 사용하여 수리 템플릿을 증폭하도록 설계된다. PCR 증폭을 위한 pMDC64 플라스미드에 대한 블랙 어닐로의 서열. 빨간색으로 표시된 영역은 상동 재조합에 대한 TgCPL-특이적시퀀스입니다.
- 표 4에설명된 PCR 조건하에서 PCR 프리믹스를 사용하여 PCR을 수행합니다.
- 아가로즈겔(그림 3E)에서PCR 제품을 실행한 다음 젤 추출 및 표준 핵산 정량화 절차를 수행합니다.
참고: 예상되는 대역을 성공적으로 증폭할 수 없는 경우 PCR 조건을 최적화및/또는 프라이머 쌍을 전환합니다.
- 선택된 sgRNA의 표적부위에 따르면, 5'-UTR 또는 3'-UTR의 50 bp를 찾아 상동성 의존재결합을 위한 표적 유전자(HDR, 토론 섹션 참조). 영역의 선택은 sgRNA 가 표적으로 하는 위치에 따라 아래에 나열된 기준을 따릅니다.
- 톡소플라즈마 감염
- RHΔku80통과 ::NLuc 기생충은 Confluent HHF를 함유하는 T25 플라스크에서 2일 동안. 완전히 용해된 기생충의 T25 플라스크는 2-3개의 형질전환에 충분합니다.
- 주사기 및 필터-1.2단계에서 기재된 바와 같이 기생충을 정화한다. 시토믹스 버퍼에서 기생충을 다시 일시 중단하고 RT에서 10분 동안 1,000 x g으로 회전합니다.
- 10 mL의 세포 혼합 버퍼로 펠릿 기생충을 씻고 RT에서 10 분 동안 1,000 x g에서 기생충을 회전시다.
- 조심스럽게 상류물을 붓고 1 x 108 기생충 / mL의 농도로 동일한 버퍼에서 기생충을 다시 일시 중단하십시오.
- sgRNA/Cas9 발현 플라스미드의 20 μg(질량 비 = 1:5, 1:3 몰 비에 해당)와 2 μg의 수리 템플릿 DNA를 혼합합니다. 수리 템플릿의 증폭 수율이 낮은 경우, 그에 따라 두 DNA 조각의 입력을 감소. 최소 0.5 μg의 수리 템플릿을 사용할 수 있습니다.
- 400 μL의 기생충 재서스펜션, DNA 및 200 mM ATP/500 mM의 5 μL을 1.5 mL 원심분리기 튜브에 글루타티온(GSH)을 섞는다. 필요한 경우 시토믹스 버퍼로 총 부피를 500 μL로 가져옵니다.
- 기생충과 DNA의 혼합물을 전기 개화 큐벳(4mm 갭 폭)으로 옮기고 전기 천공 장치를 사용하여 전기 천공 (2 kV 전압, 50 Ω 저항)을 수행합니다.
- 신선한 D10 배지에 동시 HF를 포함하는 T25 플라스크에 전기 포이션 기생충을 전송합니다. 24 시간 후에 약물 선택에 적절한 항생제를 적용하십시오.
- 형질전환 기생충의 성장이 안정될 때까지 약물 선택적 압력을 유지한다.
- 녹아웃 집단으로부터 게놈 DNA를 정화하고 PCR에 의해 TgCPL 궤적에 피리메타민 저항 카세트의 통합을 확인한다. 확인된 후 섹션 3.4로 진행합니다. 그렇지 않은 경우, 기생충 형질 감염 및 약물 선택의 또 다른 라운드를 수행. 약물 내성 카세트의 정확한 통합을 검출할 수 없는 것은 일반적으로 표적 유전자가 필수적이거나 유전자 궤적이 접근할 수 없다는 것을 시사한다.
- 녹아웃 기생충의 복제
- 종자 296 웰 마이크로플레이트와 HFF 세포를 사용하여 기생충을 복제하기 1주동안 37°C 및 5%CO2에서 배양한다.
- 융합된 HF를 함유한 T25 플라스크에서 형질전환 기생충 의 인구의 ~0.3-0.4 mL를 통과하고 2 일 동안 성장시다. 돌연변이가 성장 결함을 보여주는 경우에 더 많은 기생충을 통과하는 것을 고려하십시오.
참고 : 최상의 수율과 생존력을 달성하기 위해 숙주 세포는 기생충에 의해 심하게 감염되며 대부분의 기생충은 세포 내 단계에서 유지됩니다. - 주사기 감염 숙주 세포 및 필터-1.3단계에서 언급한 바와 같이 갓 용해된 기생충을 정화한다. D10 배지에서 기생충을 다시 일시 중단하고 RT에서 10 분 동안 1,000 x g에서 회전시십시오.
- D10 배지의 10 mL에서 펠릿 기생충을 다시 중단하십시오.
- 기생충 농도를 결정하기 위해 혈청계를 사용하여 기생충을 계산합니다.
- 적절한 항생제로 보충된 D10 배지에서 10개의 기생충/mL에 농도를 가져오기 위해 2단계 희석을 실시한다. 일반적으로, 초기 기생충 재현탁액은 1,000 배에 의해 희석되고, 10 개의 기생충 /mL에 두 번째 희석이 뒤따릅니다.
- 96개의 웰 마이크로플레이트로부터 의 매립매이 매물을 흡입하여 HF를 함유하고 각 우물 내로 희석된 기생충의 150 μL을 접종하였다.
- 플라크 형성을 허용하기 위해 방해없이 7 일 동안 5 %CO2로 37 °C에서 플레이트를 배양하십시오. 형질전환 기생충이 성장 결함을 전시하는 경우에 잠복기는 더 길수 있습니다.
- 상 대비 현미경을 사용하여 플레이트를 스크리닝하고 단일 플라크를 포함하는 웰만 표시합니다.
- 콜로니 PCR을 수행하여 올바른 클론을 식별합니다.
- 파이펫 팁을 사용하여 각 우물의 바닥을 긁어 감염된 HFF 단층을 들어 올립니다.
- 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 잘 표시된 각 셀 재현탁액의 피펫 75 μL.
- RT에서 최대 속도로 10 분 동안 원심 분리 튜브. 조심스럽게 상퍼니제를 흡인하고 키트에 제공된 희석 완충제 및 DNA 방출 첨가제를 함유하는 용해 완충제의 10.25 μL에서 펠릿을 다시 일시중단한다(재료 표).
- RT에서 4 분 동안 샘플을 인큐베이션 한 다음 98 °C에서 2 분 동안 배양하십시오. 그 후, 샘플은 PCR용으로 사용하거나 사용 될 때까지 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 3세트의 PCR 반응은 약물 내성 카세트의 통합 및 관심 유전자의 손실을 테스트하기 위해 사용된다(도4A). PCR 반응 설정은 표 5를 참조하고 열전자전거 설정은 표 6을 참조하십시오.
- 올바른 클론을 식별하고 4개의 클론을 Confluent HF를 포함하는 T25 플라스크로 전송합니다.
- 개별 클론 이 숙주 세포를 용해 한 후, 추가 PCR 검증을 위해 게놈 DNA를 정화.
- 관심 있는 단백질을 인식하는 항체가 유효하다면, 표준 면역블롯팅 절차를 따라 올바른 톡소플라즈마 녹아웃에서 표적 단백질의 손실을 확인한다. TgCPL-결실돌연변이체를 스크리닝하기 위한 대표적인 이미지는 도 4B,C에도시되어 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 1은 RHΔku80::NLuc 변형률 및 두 배 시간에 대한 파생 계산에 대한 성장 곡선의 예를 나타낸다. 일반적으로, 분석은 루시퍼라아제 활성 판독값의 변이를 설명하기 위해 3개의 생물학적 복제각각에 대해 3개의 기술적 복제물에서 수행된다. 기생충 성장의 정규화된 배 변화를 계산하기 위해, 감염 후 24-96h에서 각 판독값은 4시간 후 감염 후 초기 판독으로 나누어, 이는 분석에서 살아있는 기생충의 시작량을 반영한다(도1A,B). 기생충 두 배 시간을 결정하는 관점에서, 기생충 성장의 정규화 된 배 변화의 log2 값은 각 시간대에 대해 플롯되었다. 다음으로, 플롯은 두 배의 시간을 나타내는 경사를 얻기 위해 선형 회귀 함수를 실시하였다(도1C).
야생형 및 Δcpl 균주에서 LHVS의 억제 효능은 도 2에서8개의 억제제 농도에 대하여 루시퍼라아제 활동을 플로팅함으로써 결정되었다. 분석에서 원시 루시퍼라아제 활동의 정상화를 위한 억제제 처리 없이 감염된 세포를 포함하는 것이 필수적이다. 또한, 명확한 마이크로플레이트에서 수행된 모의 실험은 분석 기간이 끝날 때 기생충이 여전히 세포내 단계에 있는지 확인하기 위해 분석이 요구된다.
도 3에서, TgCPL을 대상으로 하는 sgRNA 발현 구문의 생성 및 검증 및 TgCPL 결실을 위한 복구 템플릿의 생산이 도시된다. 본래 플라스미드에 코딩된 TgUPRT 유전자에 매칭된 20 bp sgRNA는 PCR 기반 사이트 지시 돌연변이 발생을 통해 TgCPL 유전자를 표적화하는 DNA 서열로 돌연변이시켰다. 이를 달성하기 위해, 상이한 유전자를 인식하는 sgRNAs를 코딩하는 DNA 서열은 전방 프라이머로 설계되었고, 역프라이머는 프라이머 설계를 단순화하기 위해 변하지 않고 유지되었다.
도 3A는 선형화된 sgRNA 발현 벡터의 생성을 위해 사용되는 프라이머 세트뿐만 아니라 원래 템플릿 플라스미드에서 TgUPRT 유전자를 표적화하는 sgRNA DNA 서열의 확대-인 영역을 나타낸다. 도 3B는 선형화된 TgCPL-표적화sgRNA 발현 플라스미드의 대표적인 겔 사진을 나타낸다. 도 3C는 순환화된 TgCPL-표적화sgRNA 발현 플라스미드의 제한엔도누클레스 소화를 나타낸다. M13 역입어는 특정 유전자에 대해 생성된 sgRNA 발현 벡터 내에서 통합된 가이드 RNA를 서열화하는데 사용되었다. 도 3D에서,서열화된 DNA 영역은 성공적인 돌연변이 발생의 확인을 위해 플라스미드 템플릿에 정렬되었다. 도 3E는 피리메타민 저항 성 카세트의 시작 및 종료 영역을 도시하고, 프라이머가 TgCPL 유전자 결실을 위한 수리 템플릿의 생산을 위한 항음할 수 있는 곳을 도시한다. 상기 수리 템플릿은 PCR 증폭및 크기 검증 및 겔 추출을 위한 1% 아가로즈 겔에 적재하였다.
TgCPL 녹아웃 생성 및 스크리닝에 대한 전반적인 전략은 그림 4에나와 있습니다. 도 4A에 도시된 3세트의 프라이머는 TgCPL-결실기생충을 5'-------코딩 시퀀스의 올바른 TgCPL통합 및 삭제하기 위해 사용되었다. 도 4B에도시된 바와 같이, 일반적으로, 7~8개의 클론은 처음에 스크리닝을 위해 선택된다. 스크리닝은 일반적으로 관심 있는 유전자에 대한 코딩 서열의 삭제를 확인하는 것으로 시작됩니다. 그 다음에는 5' 및 3'-ARM을 감지하여 선별할 클론의 총 수를 최소화할 수 있습니다. 도 4C에 표시된 면역블롯팅에 의한 추가 검증은 표적 단백질을 인식하는 항체가 이용 가능한 경우 완료될 수 있다.
도 1: 루시퍼라제 기반 방법을 이용한 톡소플라즈마 기생충에 대한 세포내 성장 정량화. (A)스프레드시트 소프트웨어에서 원시 루시퍼라아제 활동 판독값입니다. 24 시간, 48 h, 72 h, 및 96 h 후 감염에서 판독은 기생충 성장에 있는 배 변경을 계산하기 위한 4 시간 사후 감염에 초기 독서에 대하여 정규화되었습니다. (B)정규화된 데이터를 평균화하고 플롯하였다. (C)접기 변화의 log2 값도 플로팅하고 기생충의 두 배 시간의 측정을 위한 선형 회귀를 실시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 루시퍼라제 기반 성장 분석기를 이용한 LHVS 및 피리메타민의 억제 효능 평가. 기생충은 숙주 세포의 침입을 허용하기 위해 4 시간 동안 96 웰 마이크로 플레이트로 접종하였다. 비침기생충을 씻어내고, 플레이트는 LHVS 또는 피리메타민의 상이한 농도를 포함하는 매체로 채워졌고, 루시퍼라아제 활성을 결정하기 전에 추가로 96시간 동안 배양하였다. 개별 억제제 농도로 처리된 기생충에 대한 측정된 루시퍼라제 판독값은 치료되지 않은 기생충으로부터 검출된 신호에 대해 정규화되었다. 데이터는 그래프 프로그램에 플롯되었고 IC50 측정을 위한 회귀 분석이 수행되었습니다. 이 분석기는 각각 3개의 기술적 복제물로 3개의 생물학적 복제물에서 반복되었다. 데이터는 평균 ±SEM, n=3생물학적 복제를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: TgCPL을 표적화하는 sgRNA를 발현하고 TgCPL 결실을 위한 수리 템플릿의 생산을 표현하는 플라스미드 구조의 생성. (a)본래 의 pSAG1-Cas9-sgRNA-UPRT 플라스미드(23)는 TgUPRT 유전자를 TgCPL로표적화하는 sgRNA의 대체를 위한 부위 지시 돌연변이 생성 키트를 통해 변형되었다.23 sgRNA 코딩 영역은 프라이머가 어닐린 영역을 나타내도록 확대된다. PCR 후, 돌연변이 된 플라스미드를 선형화하고 성공적인 증폭검증을 위해 1% 아가로즈 겔로 적재하고, 이어서 겔 추출을 하였다. (B)PCR 증폭 선형화된 sgRNA 발현 구조의 겔 이미지. (C)겔 추출 후, PCR 생성물은 순환시키고 이어서 대장균으로 변형시켰다. 예상 플라스미드를 함유하는 클론은 제한 엔도누클레스 소화 및 DNA 염기서열 분석에 의해 스크리닝되었다. DNA 소화 후 밴드 크기는 7.2 bp 및 2.4 kb였다. endonucleases에서 비특이적 절단에 의해 생성된 대역은 별표로 레이블이 지정됩니다. (D)도면에 표지된 M13 역프라이머는 생성된 TgCPL-표적화sgRNA 발현 벡터 내에서 돌연변이 가이드 RNA 영역을 서열화하는데 사용되었다. 서열화된 DNA 영역은 성공적인 돌연변이 발생을 확인하기 위해 플라스미드 템플릿에 정렬되었다. (e)본 연구에서, TgCPL의 5'---3'-UTR에 매칭되는 50 bp 상동 영역은 각각 PCR에 의한 피리메타민 저항 카세트의 5'-및 3'끝에서 측면및 수리 템플릿의 증폭을 위한 프라이머로 설계되었다. 아가로즈 겔 전기동동은 겔 추출 전에 PCR 제품의 정확한 크기를 확인하기 위해 사용되었다. 복구 템플릿의 예상 크기는 ~ 2.7 kb입니다. 일반적으로, 5-6 μg의 수리 템플릿은 200 μL의 PCR 반응으로부터 얻을 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: TgCPL-결핍기생충의 PCR 및 면역블롯팅 확인. (a)정확한 TgCPL 녹아웃 클론의 톡소플라즈마 및 PCR 기반 스크리닝에서 TgCPL-결실의일반적인 전략을 묘사한 회로도. TgCPL 스크리닝에 사용되는 프라이머에는 라벨이 부착되어 있습니다. (B)PCR 및 아가로즈 겔 전기동동은 TgCPL 궤적 및 TgCPL 유전자의 손실내로 피리메타민 저항 카세트를 올바르게 통합하는 클론을 선택하는 데 사용되었다. Δcpl 집단의 게놈 DNA는 5'-ARM 검출에 대한 양성 대조군역할을 했으며, WT 게놈 DNA는 TgCPL 유전자의 검출을 양성 대조군으로 사용하였다. 물은 음성 대조군으로 작용하기 위해 PCR 반응에서 DNA 템플릿 대신에 사용되었다. 예상되는 대역은 화살표로 표시되는 반면 비특이적 PCR 증폭은 별표로 레이블이 지정됩니다. (C)PCR 스크리닝에 의해 확인된 클론 1은 녹아웃에서 TgCPL 발현의 손실을 확인하기 위해 세포 용해제제 및 추가의 면역블롯팅 분석을 위한 조직 배양에서 성장하였다. TgActin은 로딩 제어로 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 루시퍼라제: | 끝점 |
| 통합 시간: | 1s |
| 필터 세트 - 방출: | 전체 조명 |
| 광학: | 맨 위로 |
| 이득: | 135 |
| 읽기 속도: | 정상적인 |
| 지연: | 100 ms |
| 읽기 높이: | 4.5 mm |
표 1: 루시퍼라아제 계 톡소플라즈마 성장 분석기 동안 루시퍼라아제 활성 측정을 위한 마이크로플레이트 리더 설정.
| 초기 변성: | 98 °C ( 5 분) |
| 25 사이클의 | |
| 변성: | 98 °C : 5 s |
| 어 닐 링: | 15s에 대한 60 °C |
| 확장: | 72 °C ( 1 분) |
| 최종 확장: | 72 °C ( 10 분) |
표 2: sgRNA 발현 벡터의 생성을 위한 열사이클러 설정.
| 샘플 | 볼륨(μ) |
| PCR 제품 (10-50 ng) | 1 |
| 2X KLD(키나아제, 리가제, DpnI) 반응 버퍼 | 5 |
| 10X KLD 효소 믹스 | 1 |
| 뉴클레아제 없는 물 | 3 |
| 총 | 10 |
표 3: sgRNA 발현 벡터의 순환화를 위한 반응 레시피.
| 초기 변성: | 98 °C ( 5 분) |
| 35사이클 | |
| 변성: | 98 °C : 15 s |
| 어 닐 링: | 58 °C : 15 s |
| 확장: | 72 °C : kb 당 30 s |
| 최종 확장: | 72 °C ( 10 분) |
표 4: 수리 템플릿 생성을 위한 열자전거 설정.
| 샘플 | 볼륨(μ) |
| 총 톡소플라즈마 게놈 DNA | 1 |
| 포워드 프라이머(25 μM) | 0.2 |
| 리버스 프라이머 (25 μM) | 0.2 |
| 2x PCR 마스터 프리믹스 | 5 |
| 뉴클레아제 없는 물 | 3.6 |
| 총 | 10 |
표 5: 단일 톡소플라즈마 클론을 스크리닝하기 위한 콜로니 PCR 반응 레시피.
| 초기 변성: | 98 °C ( 5 분) |
| 35사이클 | |
| 변성: | 98 °C : 5 s |
| 어 닐 링: | 55 - 62 °C : 5 s |
| 확장: | 72 °C : kb 당 20 s |
| 최종 확장: | 72 °C ( 1 분) |
표 6: 단일 톡소플라즈마 클론 스크리닝을 위한 열자전거 설치.
| 사이토믹스 버퍼 | 25 mM HEPES, pH 7.6, 120 mM KCl, 10 mMK2HPO4/KH2PO4,5 mM MgCl2,0.015 mM CaCl2,및 2 mM EGTA. |
| D10 매체 | DMEM 1X (코닝, 고양이 #: 10-013-CV), 10 mM HEPES, 10% (v/v) 우주 송아지 혈청 (하이클론, 고양이 #: SH30087.03), 1 mM 나트륨 피루바테, 4 mM L-글루타민, 페니실린 100 단위/mL, 및 100 μg/mL의 스트림 |
| 페놀 무첨가 미디엄 | DMEM / 고도로 수정된 (하이클론, 고양이 #: SH30284.02, 10 mM HEPES, 10% (v/v) 우주 송아지 혈청 (하이클론, 고양이 #: SH30087.03), 1 mM 나트륨 피루브, 4 mM L-글루타민, 페니실린 100 단위/mL, 및 100 μg/ml의 스트레미 |
| 2X NLuc 버퍼 | 100 mM MES, pH 6.0, 1mM CDTA, 0.5% 테르기톨, 0.05% 마즈 DF 204, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 35 mM 티우레아. |
보충 표 1: 버퍼에 대한 레시피입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
++이 프로토콜은 세포내 톡소플라즈마 성장을 평가하고 기생충 성장에 대한 화학 화합물의 억제 효능을 평가하기 위한 루시퍼라제 기반 프로토콜을 설명합니다. 세포내 톡소플라즈마 성장을 측정하는 데 사용할 수 있는 기존 전략에 비해 이 방법은 높은 감도와 특이성을 나타낸다. 기생충 성장을 모니터링하는 동안, 명확한 96 웰 마이크로플레이트에서 모의 분석실험은 시험된 균주가 평가 기간이 끝나기 전에 숙주 세포를 조기에 용해시키지 않는다는 것을 확인하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면, 발광 수치는 Toxoplasma가 숙주 세포 내에서만 복제되기 때문에 기생충 성장을 정확하게 반영하지 않습니다.
페놀 적색 염료는 신속하게 루시퍼라아제 활성을 담금질하는 것으로 관찰되었으며, 이는 플레이트 리더에 의한 개별 적인 웰 측정의 지연으로 인해 기술적 복제물 간의 루시퍼라제 판독값에 상당한 차이를 초래할 수 있다. 따라서, 96개의 웰 마이크로플레이트에서 파종하기 전에 페놀 무첨가 배지에서 HFF를 준비하는 것이 최적이다. 또한, 높은 루시퍼라아제 활성의 경우, 교차웰 간섭은 강한 루시퍼라아제 활성을 나타내는 이웃 웰들 사이에서 상당한 변화를 초래할 수 있다. 따라서 각 변형률 사이에 빈 열을 배치하는 것이 좋습니다.
구체적으로, RHΔku80::NLuc 균주에 대해, 1,500개의 기생충은 성장 분석에 대해 각각의 웰내로 접종된다. WT 톡소플라즈마 기생충에 대한 두 배의 시간은 ~6-8시간24이므로,감염 후 24시간에서 8-16배의 루시퍼라아제 활성이 증가할 것으로 예상된다. 그러나, 상당한 성장 결함을 가진 특정 변종은 luciferase 활성에 약간의 증가를 산출할 것이다. 따라서, 초기 기생충 접종이 낮은 경우, 루시퍼라아제 활성의 내재적 변화는 성장 기간 동안 발광의 증가를 관찰하는 것을 가리게 될 것이다. 따라서, 성장 결핍균에 대 한 정확한 접기 변화를 달성 하기 위해 기생충의 높은 수를 접종 하는 것이 좋습니다.
프로토콜에서, 가이드 RNA 설계는 포유류세포(25)에서CRISPR-Cas9 기반 게놈 변형에 사용되는 일반적인 규칙을 따른다. 현재, 소프트웨어 및 온라인 플랫폼의 많은 유형은 CHOPCHOP26,E-CRISP27및 EuPaGDT28과같은 다양한 유기체에서 가이드 RNA 설계를 위한 서비스를 제공합니다. 여기서, 상용소프트웨어(표 오브 머티리얼)는sgRNA를 설계하는데 사용된다. 앞서 언급 한 온라인 프로그램에 비해,이 소프트웨어는 sgRNA 디자인을위한 로컬 환경을 제공합니다. 이전에 발표된알고리즘(25,,29)을이용하여 각 후보 sgRNA에 대한 활성 및 특이성 점수를 계산한다.
기술적으로, 높은 특이성 점수를 포함하는 관심 있는 유전자 내에 위치한 임의의 sgRNA는 다운스트림 상동성 의존적 재조합을 위한 게놈 DNA의 절단을 효율적으로 중재할 수 있다. 실제로, sgRNA는 코돈 시작 또는 정지에 가까운 영역을 표적화하는 것이 바람직하다. 관심 있는 유전자는 유전자의 말단에서 이중 가닥 갭을 생성하는 sgRNA를 사용하여 내인성 에피토프 태그가 지정될 수 있다. 그것의 삭제 이전에 유전자를 내인성 태깅하는 것은 관심있는 단백질에 대하여 항체가 유효하지 않는 경우에 면역 블로팅 검출을 통해 유전자 손실을 확인하는 것을 도울 것입니다. 유전자의 에피토프 태깅은 또한 면역형광 현미경검사법을 통해 관심 단백질의 세포내 위치를 결정하는 데 도움이 될 수 있다. 더욱이, 표적 유전자가 필수적인 경우, 유전자의 시작 영역을 인식하는 sgRNA는 조건부 녹아웃을 생성하는 테트라사이클린 반응 프로모터에 대한 코그네이트 프로모터의 교체를 위해 사용될 수 있다.
추가적으로, 프로토콜은 TgCPL 유전자를 피리메타민 저항 카세트로 대체함으로써 톡소플라즈마에서 유전자 결실을 위한 기술을 기술한다. 다른 약물 내성 카세트를 인코딩하는 다른 플라스미드 템플릿을 사용하여, 연구원은 PCR을 통해 수리 템플릿에 다른 항생제 저항 유전자를 통합하기 위해 프라이머 서열을 수정할 수 있습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 내인성 유전자 태깅, 프로모터 교체 및 부위 지시 돌연변이 발생과 같은 다른 게놈 변형을 수행하도록 변형될 수 있다. 이 프로토콜에 사용되는 상동 영역의 길이는 50bp에 불과하다는 점은 주목할 만합니다. 별도의 연구는 성공적으로 독소 플라즈마 기생충22에서단일 뉴클레오티드 돌연변이 및 유전자 에피토프 태그를 소개하기 위해 40-43 bp 상동 DNA 서열을 사용했다. 이러한 짧은 길이의 상동성 DNA 서열은 프라이머내로 용이하게 통합될 수 있다. 우리는 상동 영역의 이 특정 길이에 대한 HDR 효율을 정량적으로 평가하지는 않았지만, 최근 달성된 여러 유전자의 성공적인 유전자 조작에 의해 입증된 바와 같이, TgKu80-결핍 톡소플라즈마 균주에서 효율적인 DNA 재조합에 40-50 bp 영역이 충분한 것으로보인다.,22
화학 화합물의 효능 측정 동안, 장래약물 표적 유전자가 필수적이라면, 야생형 및 녹아웃 균주 사이의 IC50 값의 이동을 비교하는 것은 실용적이지 않다. 이 시나리오에서는, 재조합 단백질 활성을 억제하는 화학 화합물의 능력을 직접 측정하는 분석이 약물의 효능 및 특이성을 평가하는 데 요구된다. 최근 문헌은 톡소플라즈마에서 개개인 유전자의 적합성 점수를 보고하여 게놈 와이드 CRISPR스크린(30)을수행함으로써, 관심 있는 유전자에 대한 직선 녹아웃 돌연변이를 생성하는 어려움을 평가하는 데 도움이 되는 가이드역할을 할 수 있다.
종합하면, 이 프로토콜은 루시퍼라제 기반의 세포내 톡소플라즈마 성장 분석의 성공적인 완료와 톡소플라즈마 성장에 대한 화학 적 억제제에 대한 평가 전략을 설명합니다. 또한 상세한 것은 현장에서 널리 사용되고 있는 톡소플라즈마 기생충의 유전자 결실을 위한 CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집 프로토콜이다. 개별 실험실은 내인성 유전자 태깅, 약물 선택 마커 전환 및 세포내 기생충 성장에 대한 평가 기간을 변경하는 실험적 필요에 따라 설명된 프로토콜을 수정할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT 플라스미드 및 항 TgCPL 및 TgActin 항체를 공유해 준 시블리 박사와 카루더에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 작품은 클렘슨 스타트업 기금 (Z.D.), 기사 기사단 눈 재단 소아 안과 경력 - 스타터 연구 보조금 (Z.D.), NIH COBRE 교부금 P20GM109094 (Z.D.에), 그리고 NIH R01AI143707 (Z.D.)의 파일럿 보조금에 의해 지원되었다. 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
- Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
- Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
- Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
- Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
- Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
- Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
- Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
- Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
- Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
- McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
- Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
- Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
- Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
- Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
- Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
- Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
- Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
- Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
