Summary
Presentert her er en protokoll for å evaluere hemming effekten av kjemiske forbindelser mot in vitro intracellulær vekst av Toxoplasma gondii ved hjelp av en luciferase-basert vekstanalyse. Teknikken brukes til å bekrefte hemmingsspesifisitet ved genetisk sletting av det tilsvarende målgenet. Hemming en LHVS mot TgCPL protease evalueres som et eksempel.
Abstract
Toxoplasma gondii er et protozopatogen som påvirker den menneskelige befolkningen. De nåværende antibiotika som brukes til behandling av klinisk toksoplasmose er begrenset. I tillegg viser de negative bivirkninger i visse grupper av mennesker. Derfor er oppdagelsen av nye terapeutiske midler for klinisk toksoplasmose viktig. Det første trinnet i ny antibiotikautvikling er å identifisere kjemiske forbindelser som viser høy effekt i hemming av parasittvekst ved hjelp av en høy gjennomstrømningsscreeningsstrategi. Som et obligatorisk intracellulært patogen kan Toxoplasma bare replikere i vertsceller, noe som forbyr bruk av optiske absorbansmålinger som en rask indikator på vekst. Presentert her er en detaljert protokoll for en luciferase-basert vekstanalyse. Som et eksempel brukes denne metoden til å beregne doblingstiden til villtype Toxoplasma-parasitter og måle effekten av morfofosin-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone fenyl (LHVS, en cystein protease-målretting sammensatt) om hemming av parasitt intracellulær vekst. Også beskrevet, er en CRISPR-Cas9-basert genslettingsprotokoll i Toxoplasma ved hjelp av 50 bp homologe regioner for homologiavhengig rekombinasjon (HDR). Ved å kvantifisere inhiberingsefficacies av LHVS i villtype og TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-lignende protease)-mangelfulle parasitter, er det vist at LHVS hemmer villtype parasittvekst mer effektivt enn Δcpl vekst, noe som tyder på at TgCPL er et mål som LHVS binder seg til i Toxoplasma. Den høye følsomheten og den enkle driften av denne luciferase-baserte vekstanalysen gjør den egnet for overvåking av Toxoplasma-spredning og evaluering av legemiddeleffekt på en høy gjennomstrømningsmåte.
Introduction
Toxoplasma gondii er en svært vellykket intracellulær parasitt som infiserer omtrent en tredjedel av den menneskelige befolkningen. Den høye overføringshastigheten skyldes hovedsakelig sine ulike overføringsruter, inkludert forbruk av underkokt kjøtt, eksponering for pattedyrreservoarer og medfødt overføring under fødselen. T. gondii forårsaker hovedsakelig opportunistiske infeksjoner som kan føre til alvorlig sykelighet og dødelighet hos immunkompromitterte individer1,2,3,4,5,6. Antibiotika som for tiden brukes til behandling av akutt toksoplasmose er spesielt ineffektive i behandling av medfødte og latente infeksjoner og forårsaker alvorlige reaksjoner hos noen individer3,,7,8. Dermed eksisterer et presserende behov for å identifisere nye terapeutiske midler. Å forstå forskjellene i subcellulære prosesser i Toxoplasma og verten vil bidra til å identifisere potensielle narkotikamål. Derfor er effektive og praktiske genommanipulasjonsteknikker nødvendig for å studere rollene til individuelle gener i Toxoplasma. I tillegg tilhører Toxoplasma phylum Apicomplexa, som inkluderer flere andre signifikante menneskelige patogener, som Plasmodium spp. og Cryptosporidium spp. Derfor kan Toxoplasma brukes som modellorganisme for å studere grunnleggende biologi i andre apicomplexan parasitter.
For å identifisere nye antibiotika mot mikrobielle patogener, utføres høy gjennomstrømningsscreening av et bibliotek av kjemiske forbindelser i utgangspunktet for å bestemme deres effekt i undertrykkelsen av mikrobiell vekst. Så langt er det utviklet flere mikroplatebaserte vekstanalyser for måling av intracellulær vekst på T. gondii (dvs. radioaktiv 3H-uracil inkorporeringsbasert kvantifisering9, kvantitativ ELISA-basert parasittdeteksjon ved hjelp av T. gondii-spesifikke antistoffer10,11, reporter proteinbasert måling ved hjelp av β-galaktosidase eller YFP-uttrykkende Toxoplasma stammer12,,13, og en nylig utviklet høyinnholdsbildebehandling analyse14).
Disse individuelle strategiene har alle unike fordeler; Visse begrensninger begrenser imidlertid også søknadene deres. For eksempel, siden Toxoplasma bare kan replikere i kjernerede dyreceller, autofluorescens og ikke-spesifikk binding avanti-T. gondii antistoffer for å være vert for celler forårsake interferens i fluorescensbaserte målinger. Videre krever bruk av radioaktive isotoper spesiell sikkerhetsoverholdelse og potensielle sikkerhetsproblemer. Noen av disse analysene er mer egnet for å vurdere vekst på ett tidspunkt i stedet for kontinuerlig overvåking av vekst.
Presentert her er en luciferase-basert protokoll for kvantifisering av intracellulær Toxoplasma vekst. I en tidligere studie ble NanoLuc luciferase genet klonet under Toxoplasma tubulin promoter, og denne luciferase uttrykkskonstruksjonen ble transfected til villtype (RHΔku80Δhxg stamme) parasitter for å skape en RHΔku80Δhxg::NLuc stamme (referert til som RHΔku80::NLuc heretter)15. Denne belastningen fungerte som foreldrestamme for intracellulær vekstbestemmelse og gensletting i denne studien. Ved hjelp av RHΔku80::NLuc-stamme ble parasittvekst i humane forhudfibroblaster (HFFs) overvåket over en 96 timers periode etter infeksjon for å beregne parasittdoblingstid.
I tillegg kan hemmingseffekten av LHVS mot parasittvekst bestemmes ved å plotte Toxoplasma vekstrater mot seriell LHVS-konsentrasjoner for å identifisere IC50-verdien. Tidligere litteratur har rapportert at TgCPL er et viktig mål for LHVS hos parasitter, og at behandling med LHVS reduserer utviklingen av akutte og kroniske Toxoplasma-infeksjoner 16,17,18,19. I tillegg ble RHΔku80::NLuc brukt som foreldrestamme for genommodifikasjon for å generere en TgCPL-mangelfullstamme (RHΔku80Δcpl::NLuc), og hemmingen av LHVS ble målt mot denne mutanten. Ved å observere en upshift av IC50 verdier for LHVS i TgCPL-mangelfulleparasitter sammenlignet med WT-stammen, ble det validert at TgCPL er målrettet av LHVS in vivo.
I denne protokollen brukes RHΔku80::NLuc som foreldrestamme, som mangler en effektiv ikke-homolog ende-sammenføyningsvei (NHEJ), og dermed tilrettelegge dobbel crossover homologi-avhengig rekombinasjon (HDR)20,21. I tillegg er 50 bp homologe regioner flankert i begge ender av en legemiddelresistenskassett av PCR. PCR-produktet fungerer som en reparasjonsmal for å fjerne hele genlokusvia HDR ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte genomredigeringsverktøy. Slike korte homologe regioner kan lett innlemmes i primere, noe som gir en praktisk strategi for produksjon av reparasjonsmalen. Denne protokollen kan endres for å utføre universell gensletting og endogene genmerking.
For eksempel, i vår nyeste publikasjon, ble tre proteasegener, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-lignende protease) og TgSUB1 (Toxoplasma subtilisinlignende protease 1), genetisk ablated i TgCRT (Toxoplasma klorokin-resistenstransporter)-mangelfulle parasitter ved hjelp av denne metoden15. I tillegg ble TgAMN (en antatt aminopeptidase N [TgAMN, TGGT1_221310]) endogenemerket15. Lourido-laboratoriet rapporterte også at de brukte korte homologe regioner i området 40-43 bp for innføring av stedsstyrt genmutasjon og endogen genmerking i Toxoplasma-genomet ved hjelp av en lignende metode22. Disse vellykkede genommodifikasjonene tyder på at en 40-50 bp homolog region er tilstrekkelig for effektiv DNA-rekombinasjon i TgKU80-mangelfullbelastning, noe som i stor grad forenkler genommanipulasjon i Toxoplasma gondii.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toxoplasma gondii er kategorisert i Risikogruppe 2 og må håndteres på et biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2). Protokollen er gjennomgått og godkjent av Institutional Biosafety Committee ved Clemson University.
1. Luciferase-basert Toxoplasma vekstanalyse
- Seed humane forhud fibroblaster (HFFs) 1 uke før parasitt inokulasjon for å sikre at vertsceller er fullt sammenmedvann. Utfør en mock-analyse i en gjennomsiktig plate for å sikre at parasitter forblir intracellulære gjennom evalueringsperioden.
MERK: Her utføres analysen i 96 brønnmikroplater. Ifølge eksperimentelle behov kan den skaleres opp til 384 eller 1536 brønnmikroplater. - Pass Toxoplasma parasitter i confluent HFFs 2 dager før bruk ved å overføre ~ 0,3-0,4 ml fullt lysed parasitter til en T25 kolbe. Inkuber infiserte vertsceller ved 37 °C med 5 % CO2 i 2 dager.
- Sprøyte 5 ml nylysed parasitter gjennom en 21 G sikkerhetsnål 5x for å frigjøre intracellulære parasitter, og deretter passere gjennom et 3 μm filter for å fjerne vertscellerester. Skyll gjenværende parasitter ut av kolben ved hjelp av 7 ml fenolrødfritt D10-medium, og pass deretter gjennom filteret igjen.
- Sentrifugeparasitter ved 1000 x g i 10 min ved romtemperatur (RT). Hell av supernatant og resuspend pellet i 10 ml fenol rød-fri D10 media.
- Telle parasitter ved hjelp av et hemocytometer for å bestemme konsentrasjonen.
- Fortynn parasitter til 1 x 104 parasitter/ ml for wild-type (WT) belastning. For vekst-mangelfulle parasittstammer øker konsentrasjonen tilsvarende for å observere en betydelig økning i luciferase-signaler.
- Aspirer media nøye fra 96 brønn mikroplater pre-seeded med HFFs og inokulere 150 μL parasitt resuspensjon i brønner i et format på tre kolonner og fem rader, som representerer tre tekniske replikerer og fem tidsrammer.
- Inkuber mikroplaten ved 37 °C og 5 % CO2 i 4 timer.
- Aspirer media forsiktig fra brønnene for å fjerne ikke-invaderte parasitter, og fyll deretter brønnene med RT fenol rødfrie medier i hver rad (med unntak av den første raden).
- Bland like store mengder PBS og 2x luciferase analysebuffer og fortynn luciferase substratet til 12,5 μM.
- Tilsett 100 μL fortynnet luciferase substrat i hver brønn i den øverste raden. Inkuber mikroplatene ved RT i 10 minutter for å la cellene lyse fullt ut.
- Mål luciferaseaktiviteten ved hjelp av en mikroplateleser. Innstillingene for plateleser er oppført i tabell 1. Hver avlesning representerer det første antallet invaderte parasitter ved 4 timer etter infeksjon.
- Gjenta trinn 1,9-1,12 for hver rad hver 24 timer i 4 dager uten å endre mediet. Disse målingene gjenspeiler det totale antallet replikerte parasitter ved 24 timer, 48 timer, 72 timer og 96 h postinfeksjon.
- Beregn de gjennomsnittlige avlesningene ved hvert tidspunkt og del dem med gjennomsnittlig avlesning på 4 h for å bestemme foldeendringene i parasittvekst over tid.
- Plott dataene ved hjelp av grafer programvare. En representativ vekst lesebord og tomter av RHΔku80::NLuc parasitter er vist i figur 1A,B.
- For å beregne doblingstid, plott logg2-verdiene for foldeendringer på de enkelte tidspunktene over inkubasjonstiden. Bruk en lineær regresjonsfunksjon til å beregne helling, som representerer doblingstiden for hver stamme (figur 1A,C).
2. Evaluering av kjemisk sammensatt hemming effekt mot Toxoplasma vekst
MERK: Her presenteres evaluering av hemmingen av LHVS i Toxoplasma-vekst som et eksempel. Åtte forskjellige konsentrasjoner av LHVS er testet, og tre tekniske replikater utføres for hver av de tre biologiske replikatene for både RHΔku80::NLuc og RHΔku80Δcpl::NLuc stammer.
- Før parasittinfeksjonen, frø HFFs til 96 brønn mikroplater i formatet tre rader og ni kolonner for en biologisk replikat per forbindelse per stamme. Vertsceller vil få lov til å vokse i minst 7 dager før bruk.
- Pass RHΔku80::NLuc og RHΔku80Δcpl::NLuc parasitter i 2 dager før bruk. Følg trinn 1.2-1.6 for parasittrensing og kvantifisering. Resuspender parasitter i fenolrødfrie medier ved 1 x 104 parasitter/ml.
- Aspirer media fra en plate som inneholder confluent HFFs og inokulerer hver brønn med 150 μL parasittresuspensjon. Inkuber mikroplaten ved 37 °C og 5 % CO2 i 4 timer.
- Forbered LHVS ved åtte forskjellige konsentrasjoner i et 12 brønnreservoar ved seriell fortynning. Vanligvis reduseres konsentrasjonene med tre ganger på en seriell fortynningsmåte.
MERK: Den laveste konsentrasjonen reduseres med 6561 ganger i forhold til den høyeste konsentrasjonen. Foldendringen av fortynningen kan justeres tilsvarende basert på forskjellige egenskaper av individuelle forbindelser. - Ved 4 h post-infeksjon, aspirate media for å fjerne ikke-invaderte parasitter og fylle hver brønn fra kolonner 2-9 med 150 μL av medier supplert med LHVS ved forskjellige konsentrasjoner. La den første kolonnen være fylt med vanlig medium for å fungere som en ikke-behandlet kontroll.
- Inkuber mikroplaten ved 37 °C og 5 % CO2 i ytterligere 96 timer.
- Utfør trinn 1.9-1.11 og mål luciferase aktivitet av individuelle brønner.
- Gjennomsnittlig luciferase aktiviteter av tre tekniske replikerer fra brønner av hver enkelt LHVS konsentrasjon.
- Del gjennomsnittlig luciferase aktivitet for hver LHVS konsentrasjon ved gjennomsnittlig luciferase aktivitet avledet fra ikke-behandlede parasitter for å beregne normalisert luciferase aktivitet som en prosentandel.
- Plott de normaliserte luciferase aktivitetene mot de enkelte LHVS-konsentrasjonene ved hjelp av graferprogramvare (Figur 2). Hemming av pyrimethamin mot parasittvekst måles også som en kontroll. Pyrimethamin er et klinisk antibiotikum som brukes til å behandle akutt toksoplasmose ved å hemme folsyremetabolismen i Toxoplasma.
- Beregn IC50-verdiene for individuelle forbindelser ved hjelp av den innebygde metoden i graferprogramvaren, normalisert respons vs. [inhibitor], under "dose-respons-hemming" regresjonsprogrammet. IC50 beregnes ved hjelp av følgende formel:
Y = 100/(1 + X/IC50)
Hvor: Y representerer normalisert luciferase aktiviteter av infiserte celler under forskjellige konsentrasjoner av inhibitor, og X representerer individuelle konsentrasjoner av inhibitor.
3. CRISPR-Cas9-basert gensletting i Toxoplasma-parasitter
- Generering av en plasmid konstruksjon uttrykker guide RNA (sgRNA) og Cas9 for å slette et gen av interesse
- Gå til www.ToxoDB.org og hent hele genkodesekvensen, inkludert introner og exoner, sammen med 1,5 kb 5'-UTRs og 3'-UTRs (uoversatte regioner).
MERK: Her er TgCPL (TGGT1_321530) målrettet som et representativt eksempel. - Kopier den hentede TgCPL-sekvensen til sekvensanalyseprogramvaren (se Material-tabellen for navnet og versjonen) og merk 5-- og 3'-UTR-regionene.
- Velg Verktøy-ikonet øverst på menylinjen, og velg deretter Kloning | Finn CRISPR-nettsteder.
- Velg 3'(Cas9)' for PAM-områdets plassering og velg mappen som inneholder Toxoplasma-genomsekvensen i delen spesifisitetspoenging. La resten av innstillingene være som standard.
- Velg en sgRNA med følgende to kriterier: 1) som viser en høy spesifisitetspoengsum, vanligvis > 98%og 2) mangler en G etter NGG, en protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens. Den valgte sgRNA er vanligvis plassert på steder nær starten og stoppe codons av genet av interesse.
- Kopier sekvensen av den valgte sgRNA og lim den inn i følgende primer mal.
Delen i rødt representerer den valgte TgCPL sgRNA-sekvensen. Det kan erstattes med forskjellige sgRNAs for ulike gener av interesse.
MERK: Hvis den valgte sgRNA ikke starter med G, legger du til G i begynnelsen av sgRNA for å forbedre uttrykket. - Utfør en PCR-reaksjon for å endre det eksisterende plasmiduttrykkende sgRNA (Figur 3A) som retter seg mot Toxoplasma uracil fosforføringsmiddel (TgUPRT) genet23 ved hjelp av en PCR-premix med innstillingene i tabell 2.
- Kjør PCR-produktet på en agarosegel for å bekrefte vellykket forsterkning. Et 10 kb PCR-produkt forventes å bli forsterket (figur 3B).
- Trekk ut PCR-produktet ved hjelp av et DNA gelekstraksjonssett og rundsett det ved hjelp av et stedsrettet mutagenesissett. Se tabell 3 for oppskriften. Inkuber reaksjonen i 10-20 min ved RT.
- Forvandle det sirkulæriserte PCR-produktet til E. coli og velg 10 kloner for ytterligere verifisering av inkorporering av designet sgRNA.
- Vokse to kloner og trekke plasmids. Klipp renset plasmids med BamHI og EcoRV. Kandidaten plasmids vil gi to band på 2,4 kb og 7,2 kb (Figur 3C).
- Send plasmidene for Sanger sekvensering ved hjelp av M13 omvendtprimere for å bekrefte vellykket utskifting av TgUPRT sgRNA med den utformede sgRNA (Figur 3D).
- Gå til www.ToxoDB.org og hent hele genkodesekvensen, inkludert introner og exoner, sammen med 1,5 kb 5'-UTRs og 3'-UTRs (uoversatte regioner).
- Generering av reparasjonsmal for gensletting via HDR-mekanisme
- I henhold til målrettingsstedene til den valgte sgRNA finner du 50 bp av 5'-UTRs eller 3'-UTRs av målgenet for homologiavhengig rekombinasjon (HDR, se diskusjonsseksjon). Utvalget av regioner følger kriteriene som er oppført nedenfor, avhengig av plasseringen sgRNA-målene.
- Hvis spaltingsstedet av Cas9 er plassert oppstrøms fra start-codon, velger du følgende: en 50 bp DNA-sekvens oppstrøms fra spaltningsstedet som den venstre HDR-regionen, og en 50 bp DNA-sekvens nedstrøms fra stoppcodon som høyre HDR-region.
- Hvis spaltingsstedet av Cas9 er mellom start- og stopp-codons, velger du følgende: en 50 bp DNA-sekvens oppstrøms fra startcodon en venstre HDR-region, og en 50 bp DNA-sekvens nedstrøms fra stoppcodon som riktig HDR-region.
- Hvis spaltingsstedet av Cas9 er plassert nedstrøms fra stoppcodonen, velger du følgende: en 50 bp DNA-sekvens oppstrøms fra startcodon en venstre HDR-region, og en 50 bp DNA-sekvens nedstrøms fra spaltningsstedet som riktig HDR-region.
MERK: For TgCPL-genet ligger spaltningsstedet mellom start- og stopp-codons. Dermed er følgende primere designet for å forsterke reparasjonsmalen ved hjelp av pMDC64 som mal, som koder en pyrimethamin motstandkassett. Sekvensene i svart anneal til pMDC64 plasmid for PCR forsterkning. Regionene merket med rødt er TgCPL-spesifikkesekvenser for homolog rekombinasjon.
- Utfør PCR ved hjelp av en PCR-premix under PCR-forholdene som er beskrevet i tabell 4.
- Kjør PCR-produktet på en agarosegel (figur 3E), etterfulgt av gelekstraksjon og standard nukleinsyrekvantifiseringsprosedyrer.
MERK: Hvis det forventede båndet ikke kan forsterkes, optimaliserer du PCR-forholdene og/eller bytter primerpar.
- I henhold til målrettingsstedene til den valgte sgRNA finner du 50 bp av 5'-UTRs eller 3'-UTRs av målgenet for homologiavhengig rekombinasjon (HDR, se diskusjonsseksjon). Utvalget av regioner følger kriteriene som er oppført nedenfor, avhengig av plasseringen sgRNA-målene.
- Toxoplasma transfection
- Pass RHΔku80::NLuc parasitter i 2 dager i en T25 kolbe som inneholder confluent HFFs. En T25 kolbe av fullt lysed parasitter er tilstrekkelig for to til tre transfections.
- Sprøyte og filter-rense parasitter som beskrevet i trinn 1.2. Resuspendparasitter i cytomixbuffer og snurre ned på 1000 x g i 10 min ved RT.
- Vask pelleted parasitter med 10 ml cytomixbuffer og spinn ned parasittene på 1000 x g i 10 min ved RT.
- Hell forsiktig av supernatanten og resuspend parasittene i samme buffer ved en konsentrasjon på 1 x 108 parasitter / ml.
- Bland 2 μg reparasjonsmal DNA med 20 μg av sgRNA/Cas9-uttrykksplasmider (masseforhold = 1:5, tilsvarende et 1:3 molar-forhold). Hvis forsterkningsutbyttet til reparasjonsmalen er lav, reduser inngangen til begge DNA-brikkene tilsvarende. Minst 0,5 μg reparasjonsmal kan brukes.
- Bland 400 μL parasittresuspensjon, DNA og 5 μL på 200 mM ATP/500 mM redusert glutation (GSH) i et 1,5 ml sentrifugerør. Ta det totale volumet til 500 μL med cytomixbuffer, om nødvendig.
- Overfør blandingen av parasitter og DNA til en elektroporasjonscuvette (4 mm gapbredde) og utfør elektroporasjon (2 kV spenning, 50 Ω motstand) ved hjelp av et elektroporasjonsapparat.
- Overfør elektropoerte parasitter til en T25 kolbe som inneholder sammenflytende HFFer i friskT D10-medium. Påfør passende antibiotika for legemiddelvalg etter 24 timer.
- Hold stoffet selektivt trykk til veksten av de transgene parasittene er stabil.
- Rense genomisk DNA fra knockout populasjonen og se etter integrering av pyrimethamin resistens kassett i TgCPL locus av PCR. Når det er bekreftet, går du videre til pkt. 3.4. Hvis ikke, utfør en ny runde parasitttransfection og narkotikavalg. Manglende evne til å oppdage riktig integrering av legemiddelresistenskassetten antyder vanligvis at målgenet er viktig eller at gengresslocusen ikke er tilgjengelig.
- Kloning av knockout parasitter
- Frø to 96 brønnmikroplater med HFF-celler og inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 uke før kloning av parasitter.
- Pass ~ 0,3-0,4 ml av befolkningen av transgene parasitter i en T25 kolbe som inneholder confluent HFFs og vokse dem i 2 dager. Vurder å passere flere parasitter hvis mutanten viser vekstfeil.
MERK: For å oppnå best utbytte og levedyktighet blir vertscellene sterkt smittet av parasittene, og de fleste parasittene holdes i det intracellulære stadiet. - Sprøyteinfiserte vertsceller og filterrensende nylysed parasitter som nevnt i trinn 1.3. Resuspend parasittene i D10 medium og spinn dem ned på 1000 x g i 10 min på RT.
- Resuspender de pelleted parasittene i 10 ml D10 medium.
- Telle parasitter ved hjelp av et hemocytometer for å bestemme parasittkonsentrasjonen.
- Utfør en to-trinns fortynning for å bringe konsentrasjonen til 10 parasitter / ml i D10 medium supplert med riktig antibiotika. Vanligvis fortynnes den første parasittresuspensjonen med 1000 ganger, etterfulgt av en annen fortynning til 10 parasitter / ml.
- Aspirer medier fra 96 brønnmikroplater som inneholder confluent HFFs og inokulerer 150 μL fortynnede parasitter i hver brønn.
- Inkuber plater ved 37 °C med 5 % CO2 i 7 dager uten forstyrrelser for å tillate plakkdannelse. Inkubasjonsperioden kan være lengre hvis transgene parasitter viser vekstfeil.
- Screen platene ved hjelp av et fasekontrastmikroskop og merk bare brønnene som inneholder en enkelt plakett.
- Utfør koloni-PCR for å identifisere riktige kloner.
- Bruk pipettespisser til å skrape bunnen av hver brønn for å løfte infiserte HFF monolag.
- Rør 75 μL av celleresuspensjonen fra hver merket godt inn i 1,5 ml mikrostimulerende rør.
- Sentrifugerør i 10 min ved maksimal hastighet ved RT. Aspirere forsiktig supernatanten og resuspendpellet en 10,25 μL lysisbuffer som inneholder fortynningsbuffer og DNA-frigjøringsadditiv som følger med i settet (Materialbord).
- Inkuber prøvene i 4 min ved RT, deretter 2 min ved 98 °C. Etterpå kan prøver brukes til PCR eller oppbevares ved -20 °C til bruk. Tre sett med PCR-reaksjoner brukes til å teste for integrering av legemiddelresistenskassetten og tap av genet av interesse (figur 4A). Se tabell 5 for PCR-reaksjonsoppsett og tabell 6 for termocyclerinnstillinger.
- Identifiser de riktige klonene og overfør fire kloner til T25 kolber som inneholder confluent HFFs.
- Etter individuelle kloner lyse vertsceller, rense genomic DNA for ytterligere PCR verifisering.
- Hvis et antistoff som gjenkjenner proteinet av interesse er tilgjengelig, følg en standard immunblotting prosedyre for å verifisere tap av målproteinet i de riktige Toxoplasma knockouts. Representative bilder for screening av en TgCPL-sletting mutant vises i figur 4B, C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 representerer et eksempel på en vekstkurve for RHΔku80::NLuc-stamme og den avledede beregningen for sin doblingstid. Generelt utføres analysen i tre tekniske replikater for hver av de tre biologiske replikatene for å ta høyde for variasjoner av luciferase aktivitetsavlesninger. For å beregne normalisert foldendring av parasittvekst ble hver avlesning ved 24-96 h postinfeksjon delt ved den første lesingen ved 4 h postinfeksjon, noe som gjenspeiler startmengden av levende parasitter i analysen (figur 1A,B). Når det gjelder å bestemme parasittdoblingstid, ble log2-verdiene av de normaliserte foldeendringene for parasittvekst plottet mot hvert tidspunkt. Deretter ble tomten utsatt for en lineær regresjonsfunksjon for å oppnå skråningen, som representerer doblingstid (figur 1C).
Hemmingefficacies av LHVS i villtype og Δcpl stammer ble bestemt ved å plotte luciferase aktiviteter mot åtte inhibitor konsentrasjoner i figur 2. Det er viktig å inkludere infiserte celler uten inhibitorbehandling for normalisering av rå luciferase aktiviteter i analysen. I tillegg er et mock-eksperiment utført i en klar mikroplate nødvendig for analysen for å sikre at parasitter fortsatt er i det intracellulære stadiet på slutten av analyseperioden.
I figur 3vises generering og validering av et sgRNA-uttrykkskonstruksjon rettet mot TgCPL og produksjonen av en reparasjonsmal for TgCPL-sletting. 20 bp sgRNA som matchet tguprtgenet kodet i den opprinnelige plasmid en ble mutert til DNA-sekvensen rettet mot TgCPL-genet via PCR-basert områderettet mutagenesis. For å oppnå dette ble DNA-sekvensene koding for sgRNAer som gjenkjenner forskjellige gener konstruert til den fremre primeren, mens den omvendte primeren ble holdt uendret for å forenkle primerdesign.
Figur 3A viser en zoomet inn-regionen av sgRNA DNA-sekvensene rettet mot TgUPRT-genet i den opprinnelige malplasmiden, samt primersettet som brukes til generering av den lineariserte sgRNA-uttrykksvektoren. Figur 3B viser et representativt gelbilde av det lineariserte TgCPL-målrettingsuttrykketsgRNA-uttrykksplasmid. Figur 3C viser begrensningen endonuclease fordøyelsen av sirkulærisert TgCPL-målretting sgRNA uttrykk plasmid. En M13 omvendt primer ble brukt til å sekvensere den inkorporerte guiden RNA innenfor sgRNA-uttrykksvektoren som ble generert for det spesifikke genet. I figur 3Dble den sekvenserte DNA-regionen justert til plasmidmalen for bekreftelse av vellykket mutagenesis. Figur 3E illustrerer start- og sluttområdene til pyrimethaminmotstandskassetten, som viser hvor primere kan gløde for produksjon av reparasjonsmalen for TgCPL gensletting. Reparasjonsmalen ble PCR-forsterket og lastet inn i en 1% agarose gel for størrelsesverifisering og gelekstraksjon.
Den overordnede strategien for TgCPL knockout generasjon og screening er vist i figur 4. Tre sett med primere vist i figur 4A ble brukt til å screene TgCPL-deletion parasitter for riktig integrering av 5'- og 3'-ARMs og sletting av TgCPL-kodesekvensen. Som vist i figur 4B, er det vanligvis sju til åtte kloner valgt for screening i utgangspunktet. Screeningen starter vanligvis med å se etter sletting av kodesekvensen for genet av interesse. Dette etterfølges av påvisning av 5' og 3'-ARMs, noe som bidrar til å minimere det totale antallet kloner som skal vises. Ytterligere verifisering av immunblotting som vises i figur 4C kan fullføres hvis et antistoff som gjenkjenner målproteinet er tilgjengelig.
Figur 1: Intracellulær vekstkvantifisering for Toxoplasma-parasitter ved hjelp av en luciferase-basert metode. (A) Raw luciferase aktivitet avlesninger i et regneark programvare. Målingene på 24 timer, 48 timer, 72 timer og 96 h post-infeksjon ble normalisert mot de første målingene ved 4 h etter infeksjon for beregning av foldeendringer i parasittvekst. (B) De normaliserte dataene ble gjennomsnittlig og plottet. (C) Log2-verdiene for foldeendringene ble også plottet og utsatt for lineær regresjon for bestemmelse av parasittens doblingstid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hemming effektvurdering av LHVS og pyrimethamin ved hjelp av luciferase-basert vekstanalyse. Parasitter ble vaksinert inn i en 96 brønnmikroplate i 4 timer for å tillate invasjon av vertsceller. Ikke-invaderte parasitter ble vasket bort, og platen ble fylt med medier som inneholdt forskjellige konsentrasjoner av LHVS eller pyrimethamin og inkubert for ytterligere 96 timer før bestemmelse av luciferase aktivitet. De målte luciferase-avlesningene for parasitter behandlet med individuelle inhibitorkonsentrasjoner ble normalisert mot signalet som ble oppdaget fra ubehandlede parasitter. Dataene ble plottet i et grafprogram, og en regresjonsanalyse for IC50-bestemmelse ble utført. Analysen ble gjentatt i tre biologiske replikater med tre tekniske replikater hver. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM, n = 3 biologiske replikater. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Generasjon av plasmid konstruksjon uttrykke sgRNA målretting TgCPL og produksjon av en reparasjon mal for TgCPL sletting. (A) Den opprinnelige pSAG1-Cas9-sgRNA-UPRT plasmid23 ble endret via et stedsrettet mutagenesis-sett for utskifting av SGRNA rettet mot TgUPRT-genet til TgCPL. SgRNA-kodeområdet er forstørret for å vise områder som primere anneal. Etter PCR ble den muterte plasmiden linearisert og lastet inn i en 1% agarosegel for verifisering av vellykket forsterkning, etterfulgt av gelekstraksjon. (B) Gelbildet av pcr-forsterket linearisert sgRNA uttrykkskonstruksjon. (C) Etter gel-ekstraksjon ble PCR-produktet sirkulærisert og deretter forvandlet til E. coli. Klonene som inneholder de forventede plasmidene ble screenet av begrensning endonuclease fordøyelse og DNA sekvensering. Båndstørrelsene etter DNA-fordøyelsen var 7,2 bp og 2,4 kb. Bandet generert av uspesifikk spalting fra endonucleases er merket av stjerne. (D) Den omvendte M13-primeren merket i figuren ble brukt til å sekvensere den muterte guide RNA-regionen innenfor den genererte TgCPL-målrettingssvektoren. TgCPL Den sekvenserte DNA-regionen ble justert til plasmidmalen for å bekrefte vellykket mutagenesis. (E) I denne studien ble 50 bp homologe regioner som matchet med 5'- og 3'-UTRs av TgCPL konstruert i primere for forsterkning av reparasjonsmalen og flankert på 5'- og 3'-endene av den pyrimethamine motstandskassetten av PCR, henholdsvis. Agarose gel elektroforese ble brukt til å verifisere riktig størrelse på PCR-produktet før gelekstraksjon. Den forventede størrelsen på reparasjonsmalen er ~2,7 kb. Vanligvis kan 5-6 μg reparasjonsmal fås fra 200 μL PCR-reaksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: PCR og immunblotting bekreftelse av TgCPL-mangelfulle parasitter. (A) Et skjematisk diagram som viser de generelle strategiene for TgCPL-sletting i Toxoplasma og PCR-basert screening av de riktige TgCPL knockout klonene. Primere som brukes til screeningen er merket. (B) PCR og agarose gel elektroforese ble brukt til å velge kloner som inneholder riktig integrering av pyrimethaminresistenskassetten i TgCPL-locus og tap av TgCPL-genet. Det genomiske DNA-et til Δcpl-populasjonen fungerte som en positiv kontroll for 5'- og 3'-ARM-deteksjon, mens WT genomisk DNA ble brukt til påvisning av TgCPL-genet som en positiv kontroll. Vann ble brukt i stedet for DNA-mal i PCR-reaksjonene for å tjene som en negativ kontroll. De forventede båndene er merket med piler, mens uspesifikke PCR-forsterkninger er merket med stjerner. (C) Klone 1 identifisert av PCR screening ble dyrket i vevkultur for celle lysate forberedelse og ytterligere immunblotting analyse for å bekrefte tap av TgCPL uttrykk i knockout. TgActin ble brukt som en lastekontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Luciferase, jeg er her. | Endepunktet |
| Integrasjonstid: | 1.1.1. |
| Filtersett - Utslipp: | Fullt lys |
| Optikk: | Topp |
| Få: | 135 |
| Les hastighet: | Normal |
| Forsinkelse: | 100 ms (andre kan være på |
| Les høyde: | 4,5 mm |
Tabell 1: Innstillinger for mikroplateleser for måling av luciferase-aktivitet under luciferase-basert Toxoplasma-vekstanalyse.
| Første denaturering: | 98 °C i 5 min |
| 25 sykluser av | |
| Denaturering: | 98 °C i 5 s |
| Annealing: | 60 °C i 15 s |
| Forlengelsen: | 72 °C i 1 min |
| Endelig forlengelse: | 72 °C i 10 min |
Tabell 2: Termocyclerinnstillinger for generering av sgRNA-uttrykksvektor.
| Eksempel | Volum (μl) |
| PCR-produkt (10-50 ng) | 1 |
| 2X KLD (kinase, ligase, DpnI) reaksjonsbuffer | 5 |
| 10X KLD enzym blanding | 1 |
| Kjernevann | 3 |
| Totalt | 10 |
Tabell 3: Reaksjonsoppskrift for sirkulærisering av sgRNA uttrykksvektor.
| Første denaturering: | 98 °C i 5 min |
| 35 sykluser av | |
| Denaturering: | 98 °C i 15 s |
| Annealing: | 58 °C i 15 s |
| Forlengelsen: | 72 °C i 30 s per kb |
| Endelig forlengelse: | 72 °C i 10 min |
Tabell 4: Termocycler-innstilling for generering av reparasjonsmal.
| Eksempel | Volum (μl) |
| total toxoplasma genomisk DNA | 1 |
| Forover primer (25 μM) | 0.2 |
| Omvendt primer (25 μM) | 0.2 |
| 2x PCR master premix | 5 |
| Kjernevann | 3.6 |
| Totalt | 10 |
Tabell 5: Colony PCR reaksjon oppskrift for screening enkelt Toxoplasma kloner.
| Første denaturering: | 98 °C i 5 min |
| 35 sykluser av | |
| Denaturering: | 98 °C i 5 s |
| Annealing: | 55 - 62 °C i 5 s |
| Forlengelsen: | 72 °C i 20 s per kb |
| Endelig forlengelse: | 72 °C i 1 min |
Tabell 6: Termocyclerinnstilling for screening av enkelttoxoplasmakloner.
| Cytomix buffer | 25 mM HEPES, pH 7.6, 120 mM KCl, 10 mM K2HPO4/KH2PO4,5 mM MgCl2,0.015 mM CaCl2og 2 mM EGTA. |
| D10 medium | DMEM 1X (Corning, Cat #: 10-013-CV), 10 mM HEPES, 10% (v/v) Kosmisk kalvserum (Hyclone, Cat #: SH30087.03), 1 mM natriumpyruvat, 4 m L-glutamin, 100 enheter/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. |
| Fenol rødfritt medium | DMEM / Svært modifisert (Hyclone, Cat #: SH30284.02), 10 mM HEPES, 10% (v/v) Cosmic Calf Serum (Hyclone, Cat #: SH30087.03), 1 mM natriumpyruvat, 4 mM L-glutamin, 100 enheter/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. |
| 2x Nluc buffer | 100 mM MES, pH 6.0, 1mM CDTA, 0,5% Tergitol, 0,05% Mazu DF 204, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 35 mM Thiourea. |
Tilleggstabell 1: Oppskrifter for buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
++Denne protokollen beskriver en luciferase-basert protokoll for å vurdere intracellulær Toxoplasma-vekst og evaluere hemmingseffekten av kjemiske forbindelser mot parasittvekst. Sammenlignet med de eksisterende strategiene som er tilgjengelige for måling av intracellulær Toxoplasma-vekst, viser denne metoden høy følsomhet og spesifisitet. Mens du overvåker parasittvekst, anbefales en mock-analyse i en klar 96 brønnmikroplate for å bekrefte at den testede stammen ikke for tidlig lyse vertsceller før slutten av evalueringsperioden. Ellers vil luminescensavlesningene ikke nøyaktig reflektere parasittvekst, siden Toxoplasma bare replikerer i vertsceller.
Det har blitt observert at fenol rød dye raskt slukke luciferase aktivitet, noe som kan resultere i betydelige forskjeller i luciferase avlesninger blant tekniske replikater på grunn av en forsinkelse i individuelle brønnmålinger av plateleseren. Derfor er det optimalt å forberede HFFs i fenol rødfritt medium før seeding i 96 brønnmikroplater. Også, i tilfelle av høy luciferase aktivitet, kryss-brønn interferens kan føre til betydelig variasjon blant nærliggende brønner som viser sterk luciferase aktivitet. Derfor anbefales det å plassere en tom kolonne mellom hver stamme.
Spesielt for RHΔku80::NLuc-stamme, er 1500 parasitter inokulert i hver brønn for vekstanalysen. Siden doblingstiden for WT Toxoplasma parasitter er ~ 6-8 t24, forventes det å se en økning i luciferase aktivitet med 8- til 16 ganger ved 24 timer etter infeksjon. Imidlertid vil visse stammer med betydelige vekstfeil bare gi en liten økning i luciferase aktivitet. Derfor, hvis den første parasitten inokulum er lav, vil den iboende variasjonen i luciferase aktivitet maskere observasjonen av en økning i luminescens over vekstperioden. Derfor anbefales det å inokulere et høyere antall parasitter for å oppnå en nøyaktig foldendring for stammer med vekstmangler.
I protokollen følger guide RNA-designde generelle reglene som brukes for CRISPR-Cas9-basert genommodifikasjon i pattedyrceller25. For tiden tilbyr mange typer programvare og online plattformer tjenester for guide RNA design i ulike organismer, for eksempel CHOPCHOP26,E-CRISP27,og EuPaGDT28. Her brukes kommersiell programvare (Table of Materials) til å designe sgRNA. Sammenlignet med tidligere nevnte online programmer, gir denne programvaren et lokalt miljø for sgRNA design. Den beregner aktivitets- og spesifisitetspoenger for hver kandidat sgRNA ved hjelp av en tidligere publisert algoritme25,29.
Teknisk sett kan enhver sgRNA som ligger innenfor et gen av interesse som inneholder en høy spesifisitetspoengsum, effektivt megle spaltningen av genomisk DNA for nedstrøms homologiavhengig rekombinasjon. I praksis er sgRNA rettet mot en region nær starten eller stopp codon foretrukket. Gener av interesse kan være endogene epitop-merket ved hjelp av sgRNA, som genererer et dobbeltstrandet gap på slutten av genet. Endogent merking av et gen før slettingen vil bidra til å bekrefte gentap via immunblotting deteksjon i tilfelle at et antistoff mot proteinav interesse ikke er tilgjengelig. Epitop-merking av et gen kan også bidra til å bestemme den subcellulære plasseringen av proteinet av interesse via immunofluorescensmikroskopi. Videre, hvis målgenet er viktig, kan sgRNA gjenkjenne startområdet til genet brukes til utskifting av sin cognate promoter til en tetracyklin-responsiv arrangør for å generere en betinget knockout.
I tillegg beskriver protokollen en teknikk for gensletting i Toxoplasma ved å erstatte TgCPL-genet med en pyrimethaminresistenskassett. Ved å bruke forskjellige plasmidmaler som koder andre legemiddelresistenskassetter, kan etterforskerne endre primersekvenser for å innlemme andre antibiotikaresistensgener i reparasjonsmalen via PCR. Videre kan denne protokollen endres for å utføre andre genommodifikasjoner, for eksempel endogene genmerking, promotererstatning og stedsrettet mutagenese. Det er bemerkelsesverdig at de homologe regionene som brukes i denne protokollen er bare 50 bp i lengde. En egen studie med hell brukt 40-43 bp homologe DNA-sekvenser for å introdusere single-nucleotide mutasjoner og genepitop tagging i Toxoplasma parasitter22. Homologe DNA-sekvenser i så kort lengde kan lett innlemmes i primere. Selv om vi ikke kvantitativt evaluerte HDR-effektiviteten for denne spesielle lengden av homolog region, ser det ut til at en 40-50 bp-region er tilstrekkelig for effektiv DNA-rekombinasjon i TgKu80-mangelfull Toxoplasma-stamme, som det fremgår av vellykket genetisk manipulering av flere gener som nylig oppnådde15,22.
Under effekten bestemmelse av kjemiske forbindelser, hvis det potensielle stoffet mål genet er avgjørende, en sammenligning av endringer i IC50 verdier mellom vill-type og knockout stammer er ikke praktisk. I dette scenariet er en analyse som direkte måler evnen til kjemiske forbindelser for å hemme rekombinant proteinaktivitet, nødvendig for å evaluere effekt og spesifisitet av stoffene. Nyere litteratur rapporterte treningsresultatene til individuelle gener i Toxoplasma ved å utføre en genet bred CRISPR-skjerm30, som kan tjene som en guide for å vurdere vanskeligheten med å generere en rett knockout mutant for genet av interesse.
Sammen beskriver protokollen vellykket gjennomføring av en luciferase-basert intracellulær Toxoplasma vekstanalyse og en evalueringsstrategi for kjemiske hemmere mot Toxoplasma vekst. Også detaljert er en CRISPR-Cas9-basert genomredigeringsprotokoll for gensletting i Toxoplasma parasitter, som har blitt mye brukt i feltet. Individuelle laboratorier kan endre den beskrevne protokollen i henhold til eksperimentelle behov, for eksempel endogene genmerking, bytte av legemiddelvalgmarkører og endre evalueringsperioden for intracellulær parasittvekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Drs. Sibley og Carruthers for å dele pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid og anti-TgCPL og TgActin antistoffer. Dette arbeidet ble støttet av Clemson Startup fund (til Z.D.), Knights Templar Eye Foundation Pediatric Ophthalmology Career-Starter Research Grant (til Z.D.), en pilot bevilgning av en NIH COBRE stipend P20GM109094 (til Z.D.), og NIH R01AI143707 (til Z.D.). Funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
- Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
- Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
- Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
- Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
- Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
- Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
- Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
- Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
- Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
- McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
- Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
- Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
- Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
- Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
- Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
- Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
- Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
- Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
