Summary
Представлен протокол для оценки эффективности ингибирования химических соединений против интраклеточного роста Toxoplasma gondii с использованием анализа роста на основе люциферазы. Метод используется для подтверждения специфики ингибирования путем генетического удаления соответствующего гена-мишени. В качестве примера оценивается ингибирование LHVS против протеазы TgCPL.
Abstract
Toxoplasma gondii является протозоанным патогеном, который широко влияет на популяцию человека. Текущие антибиотики, используемые для лечения клинического токсоплазмоза ограничены. Кроме того, они проявляют неблагоприятные побочные эффекты в определенных группах людей. Поэтому, открытие новых терапевтических препаратов для клинического токсоплазмоза является обязательным. Первым шагом развития новых антибиотиков является выявление химических соединений, показывающих высокую эффективность ингибирования роста паразитов с использованием высокой пропускной технологии стратегии скрининга. Как обязывательный внутриклеточный патоген, Токсоплазма может размножаться только в клетках-хозяинах, что запрещает использование оптических измерений абсорбции в качестве быстрого индикатора роста. Представлено здесь подробный протокол для luciferase основе роста асссе. В качестве примера, этот метод используется для расчета удвоения времени дикого типа паразитов токсоплазмы и измерения эффективности морфолинурея-лейцил-гомофенил-виниловый суфолфена фенил (LHVS, цистеин протеазы ориентации соединения) в отношении ингибирования паразита внутриклеточного роста. Также описан протокол удаления генов на основе CRISPR-Cas9 в Токсоплазме с использованием гомологических областей 50 bp для гомологически-зависимой рекомбинации (HDR). Путем количественной оценки эффективности ингибирования LHVS в диком типе и TgCPL (Токсоплазма катепсин L-как протеазы)-дефицитных паразитов, показано, что LHVS ингибирует рост паразитов дикого типа более эффективно, чем рост CPL, предполагая, что TgCPL является целью, что LHVS связывается с в Токсоплазма Высокая чувствительность и легкая работа этого анализа роста на основе люциферазы делают его пригодным для мониторинга пролиферации токсоплазмы и оценки эффективности препарата в высокой пропускной форме.
Introduction
Toxoplasma gondii является весьма успешным обликирующим внутриклеточным паразитом, который поражает примерно треть населения человека. Его высокая скорость передачи в основном объясняется его разнообразными путями передачи, включая потребление недоваренного мяса, воздействие млекопитающих и врожденную передачу во время родов. T. gondii в основном вызывает оппортунистические инфекции, которые могут привести к тяжелой заболеваемости и смертности у лиц с ослабленным иммунитетом1,,2,,3,,4,,5,6. Антибиотики в настоящее время используется для лечения острого токсоплазмоза особенно неэффективны в лечении врожденных и скрытых инфекций и вызвать тяжелые реакции у некоторых людей3,7,8. Таким образом, существует настоятельная необходимость в выявлении новых терапевтических препаратов. Понимание различий в подклеточных процессах в токсоплазме и ее хозяине поможет определить потенциальные цели препарата. Поэтому для изучения роли отдельных генов в токсоплазменеобходимы эффективные и удобные методы манипуляции геномом. Кроме того, Toxoplasma относится к phylum Apicomplexa, которая включает в себя несколько других значительных человеческих патогенов, таких как Plasmodium spp. и Cryptosporidium spp. Таким образом, токсоплазма может быть использована в качестве модели организма, чтобы помочь изучить основные биологии в других паразитов apicomplexan.
Для выявления новых антибиотиков против микробных патогенов, высокая пропускная мощность скрининга библиотеки химических соединений первоначально проводится для определения их эффективности в подавлении роста микробов. До сих пор, несколько микроплит на основе роста анализы были разработаны для измерения внутриклеточного роста Т. gondii (т.е., радиоактивные 3H-uracil инкорпорации на основе количественной количественной ELISA основе обнаружения паразитов с использованием T. gondii-специфическиеантитела10,11, репортер белка на основе измерения с использованием й-galactosidase или YFP-выражения Токсоплазма штаммов12,13, и недавно разработанный высокосодержание изображения анализа14).9
Все эти индивидуальные стратегии имеют уникальные преимущества; однако некоторые ограничения также ограничивают их применение. Например, поскольку токсоплазма может размножаться только в нуклеарных клетках животных, аутофлуоресценция и неспецифические связыванияанти-T. gondii антител к клеткам-хозяинам вызывают вмешательство в измерения на основе флуоресценции. Кроме того, использование радиоактивных изотопов требует особого соблюдения требований безопасности и потенциальных проблем безопасности. Некоторые из этих анализов больше подходят для оценки роста в один момент, а не для непрерывного мониторинга роста.
Здесь представлен люциферазена основе протокола для количественной оценки внутриклеточного роста токсоплазмы. В предыдущем исследовании, NanoLuc luciferase ген был клонирован под toxoplasma тубулина промоутер, и это luciferase экспрессии построить был трансфицирован в дикий тип (RH'ku80ххг штамма) паразитов для создания RHq ku80хххгг::NLuc штамма (именуемый RH'ku80::NLuc далее.15 Этот штамм служил родительским штаммом для внутриклеточного определения роста и удаления генов в этом исследовании. Использование RH qku80::Штамм NLuc, рост паразитов в крайней плоти человека фибробластов (HFFs) был проконтролирован в течение 96 ч период после инфекции для расчета паразита удвоение времени.
Кроме того, эффективность ингибирования LHVS против роста паразитов может быть определена путем построения темпов роста токсоплазмы против последовательных концентраций LHVS для определения значения IC50. Предыдущая литература сообщила, что TgCPL является основной мишенью LHVS у паразитов и что лечение LHVS снижает развитие острых и хронических инфекций токсоплазмы 16,17,18,19. Кроме того, RH'ku80::NLuc был использован в качестве родительского штамма для модификации генома для создания штамма TgCPL-дефицит (RH'ku80qcpl::NLuc), и торможение LHVS был измерен против этого мутанта. Наблюдая upshift ic50 значения для LHVS в TgCPL-дефицитныхпаразитов по сравнению с штаммом WT, было подтверждено, что TgCPL является мишенью LHVS in vivo.
В этом протоколе, RH'ku80::NLuc используется в качестве родительского штамма, который не имеет эффективного негомологического конца присоединения пути (NHEJ), тем самым облегчая двойной кроссовер гомологически химологии-зависимой рекомбинации (HDR)20,21. Кроме того, 50 bp гомологичные области фланговые на обоих концах лекарственной устойчивости кассеты ПЦР. Продукт PCR служит шаблоном ремонта для удаления всего генного локуса через HDR с помощью инструментов редактирования генома на основе CRISPR-Cas9. Такие короткие гомологичные области могут быть легко включены в грунтовки, обеспечивая удобную стратегию для производства шаблона ремонта. Этот протокол может быть изменен для выполнения универсального удаления генов и эндогенных генов пометки.
Например, в нашей последней публикации, три гена протеазы, TgCPL, TgCPB (Токсоплазма катепсин B-как протеазы), и TgSUB1 (Токсоплазма субтилизин-как протеазы 1), были генетически ablated в TgCRT (Токсоплазма хлорокина-резистентность транспортер)15 Кроме того, TgAMN (побудительная аминопептидаза N «TgAMN, TGGT1_221310») был эндогенно помечен15. Лаборатория Лууридо также сообщила об использовании коротких гомологичных областей в диапазоне 40-43 bp для введения направляемой на сайт генной мутации и эндогенного гена, пометки в геноме Токсоплазмы с помощью аналогичного метода22. Эти успешные изменения генома предполагают, что 40-50 bp гомологичная область достаточна для эффективной рекомбинации ДНК в TgKU80-дефицитный штамм, который значительно упрощает манипуляции генома в Toxoplasma gondii.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toxoplasma gondii отнесена к группе риска 2 и должна быть обработана на уровне биобезопасности 2 (BSL-2). Протокол был рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по биобезопасности при Университете Клемсона.
1. Люцифераза основе токсоплазмы роста анализ
- Семена человека крайней плоти фибробластов (HFFs) за неделю до прививки паразита, чтобы убедиться, что клетки-хозяина полностью сливается. Выполните макет асссе в прозрачной пластине, чтобы убедиться, что паразиты остаются внутриклеточными в течение всего периода оценки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь анализ проводится в 96 скважинах. В соответствии с экспериментальными потребностями, его можно масштабировать до 384 или 1536 скважин микроплит. - Передайте паразитов токсоплазмы в сливочные HFF за 2 дня до использования, переведя 0,3-0,4 мл полностью лисизированных паразитов в колбу T25. Инкубировать инфицированные клетки-хозяина при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 в течение 2 дней.
- Шприц 5 мл свежевылитных паразитов через 21 G безопасности иглы 5x освободить внутриклеточных паразитов, а затем пройти через фильтр 3 мкм для удаления мусора клетки-хозяина. Промыть остаточных паразитов из колбы с помощью 7 мл фенола красно-свободного D10 среды, а затем пройти через фильтр снова.
- Центрифуга паразитов при 1000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT). Налейте супернатант и resuspend гранулы в 10 мл фенола красно-свободного D10 средств массовой информации.
- Считайте паразитов с помощью гемоцитометра, чтобы определить концентрацию.
- Разбавить паразитов до 1 х 104 паразитов / мл для дикого типа (WT) штамма. Для роста дефицитных штаммов паразитов, увеличить концентрацию соответственно наблюдать значительное увеличение сигналов люциферазы.
- Тщательно аспирировать средства массовой информации из 96 скважин микроплиты предварительно посеяны с HFFs и привить 150 л паразита повторного в скважины в формате из трех столбцов и пяти строк, что представляет собой три технических репликации и пять тайм-пойнтов.
- Инкубировать микроплиту при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 4 ч.
- Тщательно аспирировать средства массовой информации из скважин, чтобы удалить невторгленных паразитов, а затем заполнить колодцы с RT фенол красно-свободных средств массовой информации в каждом ряду (за исключением первого ряда).
- Смешайте равные объемы PBS и 2x люциферазы ассеации буфера и разбавить субстрата люциферазы до 12,5 мкм.
- Добавьте 100 л разбавленного субстрата люциферазы в каждую скважину верхнего ряда. Инкубировать микроплиты на RT в течение 10 минут, чтобы позволить клеткам полностью лизировать.
- Измерьте активность люциферазы с помощью микроплитного считывателя. Настройки чтения пластин перечислены в таблице 1. Каждое чтение представляет собой первоначальное число вторгшихся паразитов на 4 ч после инфекции.
- Повторите шаги 1.9-1.12 для каждого ряда каждые 24 ч в течение 4 дней без изменения среды. Эти показания отражают общее количество реплицированных паразитов на уровне 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч после инфицирования.
- Рассчитайте средние показания в каждой точке времени и разделите их на средние показания на 4 ч, чтобы определить изменения в развратных изменениях роста паразитов с течением времени.
- Участок данных с помощью графического программного обеспечения. Представитель роста таблицы чтения и сюжеты RH'ku80::NLuc паразитов показаны на рисунке 1A,B.
- Чтобы вычислить время удвоения, начастоте значения log2 изменения склада в отдельных временных точках во время инкубации. Используйте функцию линейной регрессии для расчета наклона, который представляет собой удвоение времени каждого штамма(рисунок 1A,C).
2. Оценка эффективности ингибирования химических соединений против роста токсоплазмы
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, оценка ингибирования LHVS в росте Токсоплазмы представлена в качестве примера. Восемь различных концентраций LHVS проверяются, и три технических репликации выполняются для каждого из трех биологических репликации для обоих RH'ku80::NLuc и RH'ku80qpl::NLuc штаммов.
- До паразита инфекции, семена HFFs до 96 хорошо микроплиты в формате трех строк и девять столбцов для одной биологической репликации на соединение на штамм. Клетки-хозяина будут расти, по крайней мере, за 7 дней до использования.
- Передайте RH'ku80::NLuc иRH'ku80qcpl::NLuc паразитов в течение 2 дней до использования. Выполните шаги 1.2-1.6 для очистки и количественной оценки паразитов. Resuspend паразитов в фенол красно-свободных средств массовой информации на 1 х 104 паразитов / мл.
- Аспирировать средства массовой информации из пластины, содержащей сопливые HFFs и привить каждый колодец с 150 Зл паразитов повторной. Инкубировать микроплиту при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 4 ч.
- Подготовка LHVS в восьми различных концентрациях в 12 скважин резервуара последовательного разбавления. Как правило, концентрации уменьшаются в три раза в последовательном способе разбавления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самая низкая концентрация уменьшается в 6561 раз по отношению к самой высокой концентрации. Изменение разбавления может быть скорректировано соответствующим образом на основе различных свойств отдельных соединений. - На 4 ч после инфекции, аспирных средств массовой информации для удаления не вторгшихся паразитов и заполнить каждый колодец из столбцов 2-9 с 150 зЛ средств массовой информации дополняется LHVS в различных концентрациях. Оставьте первую колонку, заполненную обычной средой, в качестве необработанного элемента управления.
- Инкубировать микроплиту при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 еще на 96 ч.
- Выполните шаги 1.9-1.11 и измерьте активность люциферазы отдельных скважин.
- Среднее деятельность люциферазы трех технических репликаций из скважин каждой отдельной концентрации LHVS.
- Разделите среднюю активность люциферазы для каждой концентрации LHVS на среднюю активность люциферазы, полученную от необработанных паразитов, чтобы вычислить нормализованную активность люциферазы в процентах.
- Участок нормализованной деятельности люциферазы против отдельных концентраций LHVS с помощью программного обеспечения для графиков(рисунок 2). Ингибирование пириметамина против роста паразитов также измеряется как контроль. Пириметамин является клиническим антибиотиком, используемым для лечения острого токсоплазмоза путем ингибирования метаболизма фолиевой кислоты в токсоплазме.
- Рассчитайте значения IC50 для отдельных соединений, используя встроенный метод в графирующем программном обеспечении, нормализованную реакцию против «ингибитора» в рамках программы регрессии «доза-ответ-ингибирование». IC50 рассчитывается по следующей формуле:
Y 100/(1 й X/IC50)
Где: Y представляет собой нормализованную деятельность инфицированных клеток при различных концентрациях ингибитора, а X представляет индивидуальные концентрации ингибитора.
3. Удаление гена на основе CRISPR-Cas9 у паразитов токсоплазмы
- Поколение плазмидной конструкции, выражающей направляющую РНК (sgRNA) и Cas9 для удалять интересующий ген
- Перейти к www.ToxoDB.org и получить всю последовательность кодирования генов, в том числе интроны и экзоны, а также 1,5 кб 5'-UTRs и 3'-UTRs (непереведенные регионы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь TgCPL (TGGT1_321530) является репрезентативным примером. - Копируйте полученную последовательность TgCPL в программное обеспечение анализа последовательности (обратитесь к таблице материалов для названия и версии) и пометьте 5'- и 3'UTR регионов.
- Выберите значок «Инструменты» в верхнем баре меню, а затем выберите Клонирование Найти сайты CRISPR.
- Выберите 3'(Cas9) для расположения сайта PAM и выберите папку, содержащую последовательность генома Toxoplasma в разделе оценки специфичности. Оставьте остальные настройки по умолчанию.
- Выберите sgRNA со следующими двумя критериями: 1) показывая высокий балл специфичности, как правило, йgt;98%, и 2) не хватает G после NGG, протосказер смежных мотив (PAM) последовательность. Выбранный sgRNA обычно расположен на участках близко к старту и останавливает codons гена интереса.
- Копируйте последовательность выбранной sgRNA и вставьте ее в следующий шаблон грунтовки.
Часть в красном цвете представляет выбранную последовательность TgCPL sgRNA. Его можно заменить различными sgRNA для различных генов, представляющих интерес.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбранная sgRNA не начинается с G, добавьте G в начале sgRNA, чтобы помочь улучшить его выражение. - Выполните пЦР реакции, чтобы изменить уже существующие плазмиды выражения sgRNA (Рисунок 3A), что цели Toxoplasma uracil фосфорозилтрансферазы (TgUPRT) ген23 с помощью пЦР-премикс с настройками, предусмотренными в таблице 2.
- Запустите продукт ПЦР на геле агарозы, чтобы подтвердить успешное усиление. Ожидается, что продукт ПЦР 10 кб будет усилен(рисунок 3B).
- Извлеките продукт PCR используя набор экстракции геля дна и циркулировать его используя набор mutagenesis site-направленного. Обратитесь к таблице 3 для рецепта. Инкубировать реакцию в течение 10-20 мин на RT.
- Преобразуйте циркулярный продукт ПЦР в кишечную палочку и выберите 10 клонов для дальнейшей проверки включения разработанной сгРНК.
- Вырастить два клона и извлечь плазмиды. Вырезать очищенные плазмиды с BamHI и EcoRV. Кандидат плазмиды даст две полосы на 2,4 кб и 7,2 кб(рисунок 3C).
- Отправить плазмиды для секвенирования Сэнгер с помощью M13 обратных грунтовки, чтобы подтвердить успешную замену TgUPRT sgRNA с разработанs sgRNA (Рисунок 3D).
- Перейти к www.ToxoDB.org и получить всю последовательность кодирования генов, в том числе интроны и экзоны, а также 1,5 кб 5'-UTRs и 3'-UTRs (непереведенные регионы).
- Поколение шаблона ремонта для удаления генов с помощью механизма HDR
- Согласно сайтам таргетинга выбранной sgRNA, найдите 50 bp 5'-UTRs или 3'-UTRs целевого гена для гомологически-зависимой рекомбинации (HDR, см. раздел обсуждения). Выбор регионов соответствует критериям, перечисленным ниже, в зависимости от местоположения целей sgRNA.
- Если место расщепления Cas9 расположено вверх по течению от начала кодона, выберите следующее: последовательность ДНК 50 bp вверх по течению от места расщепления в качестве левой области HDR, и 50 bp последовательность ДНК вниз по течению от стоп-кодона как правой области HDR.
- Если место расщепления Cas9 находится между стартом и остановкой кодонов, выберите следующее: 50 bp последовательность ДНК вверх по течению от стартового кодона как левой области HDR, и 50 bp последовательность ДНК вниз по течению от остановки кодон как правая область HDR.
- Если место расщепления Cas9 расположено вниз по течению от остановки Кодон, выберите следующее: 50 bp последовательность ДНК вверх по течению от стартового кодона как левой области HDR, и 50 bp последовательность ДНК вниз по течению от места расщепления, как правая область HDR.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для гена TgCPL, место расщепления расположено между стартом и стоп-кодонами. Таким образом, следующие праймеры предназначены для усиления шаблона ремонта с помощью pMDC64 в качестве шаблона, который кодирует кассету сопротивления пириметамина. Последовательности в черном anneal к pMDC64 плазмида для усиления ПЦР. Области, помеченные красным цветом, являются TgCPL-специфическимипоследовательностями для гомологичных рекомбинаций.
- Выполните ПЦР с помощью пЦР-премикса в условиях ПЦР, описанных в таблице 4.
- Запустите продукт ПЦР на геле агарозы(Рисунок 3E), а затем гель экстракции и стандартные процедуры количественной оценки нуклеиновой кислоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ожидаемая полоса не может быть успешно усилена, оптимизируйте условия ПЦР и/или переключите пары грунтовки.
- Согласно сайтам таргетинга выбранной sgRNA, найдите 50 bp 5'-UTRs или 3'-UTRs целевого гена для гомологически-зависимой рекомбинации (HDR, см. раздел обсуждения). Выбор регионов соответствует критериям, перечисленным ниже, в зависимости от местоположения целей sgRNA.
- Трансфекция токсоплазмы
- Передайте RH'ku80::NLuc паразитов в течение 2 дней в T25 колбу, содержащую сопливые HFFs. Колба T25 полностью лисизированных паразитов достаточна для двух-трех трансфекций.
- Шприц и фильтр-очистите паразитов, как описано в шаге 1.2. Resuspend паразитов в буфере cytomix и спина вниз на 1000 х г в течение 10 минут на RT.
- Вымойте гранулированных паразитов с 10 мл буфера цитомикс и спина вниз паразитов на 1000 х г в течение 10 минут на RT.
- Тщательно слить супернатант и resuspend паразитов в том же буфере в концентрации 1 х 108 паразитов / мл.
- Смешайте 2 мкг днк шаблона ремонта с 20 мкг плазмид с выражением sgRNA/Cas9 (массовое соотношение 1:5, эквивалентно соотношению 1:3 моляров). Если выход усиления шаблона ремонта низок, уменьшите вход обеих частей дна соответственно. Можно использовать как минимум 0,5 мкг шаблона ремонта.
- Смешайте 400 л повторений паразитов, ДНК и 5 л 200 мМ АТФ/500 мМ, уменьшенного глутатиона (ГСГ) в 1,5 мл центрифуги. При необходимости доведите общий объем до 500 кЛ с буфером цитомикса.
- Перенесите смесь паразитов и ДНК в электропорацию cuvette (ширина зазора 4 мм) и выполняйте электропорацию (напряжение 2 кВ, сопротивление 50 кВ) с помощью электропорационного аппарата.
- Передача электропорированных паразитов в колбу T25, содержащую сопливые HFF в свежей среде D10. Применить соответствующий антибиотик для выбора препарата после 24 ч.
- Держите препарат селективное давление до тех пор, пока рост трансгенных паразитов не будет стабильным.
- Очистите геномную ДНК от нокаут населения и проверить на интеграцию пылики сопротивления пириметамина в локус TgCPL пЦР. После проверки перейдите в раздел 3.4. Если нет, выполните еще один раунд трансфекции паразитов и отбора лекарств. Неспособность обнаружить правильную интеграцию кассеты лекарственной устойчивости обычно свидетельствует о том, что ген-мишень необходим или что генная локус недоступна.
- Клонирование тунеядцев нокаута
- Семя два 96 хорошо микроплиты с Клетками HFF и инкубировать на 37 КС и 5% CO2 в течение 1 недели до клонирования паразитов.
- Передайте 0,3-0,4 мл популяции трансгенных паразитов в колбу T25, содержащую сольятся ГФФ, и выращивайте их в течение 2 дней. Рассмотрим передачу больше паразитов, если мутант показывает дефекты роста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучшей урожайности и жизнеспособности клетки-хозяина сильно инфицированы паразитами, и большинство паразитов находятся во внутриклеточной стадии. - Шприц инфицированных клеток-хозяев и фильтр-очистите свежевылищых паразитов, как упоминалось в шаге 1.3. Resuspend паразитов в D10 среды и спина их вниз на 1000 х г в течение 10 минут на RT.
- Приостановите пеллетные паразиты в 10 мл среды D10.
- Подсчитайте паразитов с помощью гемоцитометра для определения концентрации паразитов.
- Проведите двухступенчатое разбавление, чтобы довести концентрацию до 10 паразитов/мл в среде D10, дополненной соответствующим антибиотиком. Как правило, первоначальная повторная подвеска паразита разбавляется в 1000 раз, а затем второй разбавления до 10 паразитов / мл.
- Аспирные носители из 96 хорошо микроплит, содержащих сольятся HFFs и прививать 150 л разбавленных паразитов в каждой скважине.
- Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 в течение 7 дней без помех, чтобы налет образования. Инкубационный период может быть более длительным, если трансгенные паразиты проявляют дефекты роста.
- Экран пластин с помощью фазово-контрастного микроскопа и пометить только колодцы, содержащие один налет.
- Выполните колонии ПЦР для выявления правильных клонов.
- Используйте пипетки советы, чтобы очистить дно каждой скважины, чтобы поднять инфицированных монослой Овф.
- Пипетка 75 л повторений клеток от каждого отмечены хорошо в 1,5 мл микроцентрифуговых труб.
- Центрифуги трубки в течение 10 минут на максимальной скорости на RT. Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend гранулы в 10,25 л люсиса буфера, содержащего буфер разбавления и ДНК релиз добавки, предусмотренные в комплекте (Таблица материалов).
- Инкубировать образцы в течение 4 мин на RT, затем 2 мин при 98 градусах По Цельсию. После этого образцы можно использовать для ПЦР или хранить при -20 градусов до использования. Три набора реакций ПЦР используются для тестирования на интеграцию кассеты лекарственной устойчивости и потери гена интереса(рисунок 4A). Обратитесь к таблице 5 для установки реакции ПЦР и таблице 6 для настроек термоциклора.
- Определите правильные клоны и перенесите четыре клона в фляги T25, содержащие сопредельные HFF.
- После того, как отдельные клоны лиза ютяни клетки, очистить геномную ДНК для дальнейшей проверки ПЦР.
- Если антитела признавая белок интерес доступен, следуйте стандартной процедуре иммуноблтинга, чтобы проверить потерю целевого белка в правильной токсоплазмы нокаутов. Репрезентативные изображения для скрининга мутанта TgCPL-удаленияотображаются на рисунке 4B, C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 представляет собой пример кривой роста для RH qku80::Штамм NLuc и производные расчеты для его удвоения времени. Как правило, асссможно проводится в трех технических репликациях для каждой из трех биологических репликаторов, учитывающих вариации показаний активности люциферазы. Для того, чтобы рассчитать нормализованное изменение складок роста паразитов, каждое чтение на 24-96 ч после инфекции было разделено на начальное чтение на 4 ч после инфекции, которая отражает начальное количество живых паразитов в ходе ассс(Рисунок 1A,B). С точки зрения определения времени удвоения паразитов, значения log2 нормализованных изменений складок роста паразитов были построены против каждой временной точки. Далее, участок был подвергнут линейной регрессионной функции для получения склона, который представляет собой удвоение времени(рисунок 1C).
Эффективность ингибирования LHVS в диком типе штаммов и штаммовcpl были определены путем построения люциферазы деятельности против восьми концентраций ингибитора на рисунке 2. Важно включить инфицированные клетки без ингибитора лечения для нормализации сырой деятельности люциферазы в ассе. Кроме того, макет эксперимента, выполненного в четкой микроплите, требуется для проведения анализов, чтобы убедиться, что паразиты все еще находятся внутриклеточной стадии в конце периода асссе.
На рисунке 3показано генерацию и проверку конструкции выражения sgRNA, ориентированной на TgCPL, и производство шаблона ремонта для удаления TgCPL. 20 bp sgRNA, соответствующий гену TgUPRT, закодированному в оригинальной плазмиде, был мутирован в последовательность ДНК, нацеленную на ген TgCPL с помощью мутагенеза на основе ПЦР. Для достижения этой цели, последовательности ДНК кодирования для sgRNAs, которые признают различные гены были разработаны для переднего грунтовки, в то время как обратный грунтовка была сохранена без изменений, чтобы упростить дизайн грунтовки.
На рисунке 3А показана увеличенная область последовательностей ДНК sgRNA, нацеленная на ген TgUPRT в оригинальном шаблоне плазмида, а также набор грунтов, используемый для генерации линейного вектора экспрессии sgRNA. На рисунке 3B показана репрезентативная картинка геля линейного выражения TgCPL-таргетингаплазмида sgRNA. На рисунке 3C показано ограничение эндонуклеазы пищеварения циркулярной плазмидной экспрессии TgCPL. Реверс M13 был использован для секвенирования включенной направляющей РНК в вектор экспрессии sgRNA, генерируемый для конкретного гена. На рисунке 3Dобласть секвенированной ДНК была выровнена с плазмидным шаблоном для подтверждения успешного мутагенеза. Рисунок 3E иллюстрирует начало и конец областей копетки сопротивления пириметамина, показывая, где грунтовки могут anneal для производства шаблона ремонта для удаления гена TgCPL. Шаблон ремонта был пЦР-усилен и загружен в 1% агарозный гель для проверки размера и извлечения геля.
Общая стратегия для tgCPL нокаут поколения и скрининга показано в Рисунке 4. Три набора праймеров, показанных на рисунке 4А, были использованы для проверки паразитов TgCPL-удалениядля правильной интеграции 5'- и 3'-ARMs и удаления последовательности кодирования TgCPL. Как показано на рисунке 4B, как правило, семь-восемь клонов выбираются для скрининга на начальном этапе. Скрининг обычно начинается с проверки на удаление последовательности кодирования гена интереса. За этим следует обнаружение 5' и 3'-ARMs, что помогает свести к минимуму общее количество клонов, которые будут проверены. Дальнейшая проверка путем иммуноблоттинга, отображаемого на рисунке 4C, может быть завершена, если имеется антитело, распознающее целевой белок.
Рисунок 1: Внутриклеточная количественная оценка роста паразитов токсоплазмы с помощью метода на основе люциферазы. (A) Сырые показания активности luciferase в программном обеспечении электронной таблицы. Показания на 24 ч, 48 ч, 72 ч, и 96 ч после инфекции были нормализованы по отношению к первоначальным показаниям на 4 ч после инфекции для расчета раз изменения в ростпаразитов. (B) Нормализованные данные были усреднены и построены. (C) Значения log2 изменений складок также были построены и подвергнуты линейной регрессии для определения удвоения времени паразита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Оценка эффективности ингибирования LHVS и пириметамина с использованием исследования роста на основе люциферазы. Паразиты были привиты в микроплиту 96 скважин на 4 ч, чтобы обеспечить вторжение в клетки-хозяина. Невторгимые паразиты были смыты, и пластина была заполнена средствами, содержащими различные концентрации LHVS или пириметамина и инкубировали еще на 96 ч до определения активности люциферазы. Измеренные показания люциферазы для паразитов, обработанных индивидуальными концентрациями ингибитора, были нормализованы против сигнала, обнаруженного у необработанных паразитов. Данные были построены в программе графиков, и был проведен регрессионный анализ определения IC50. Ассес был повторен в трех биологических репликациях с тремя техническими репликациями каждый. Данные представляют собой среднее время ДЛЯ СЭМ, n - 3 биологические репликации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Генерация плазмидной конструкции, выражающей sgRNA таргетинг TgCPL и производство шаблона ремонта для удаления TgCPL. ()Оригинальный pSAG1-Cas9-sgRNA-UPRT плазмид23 был модифицирован с помощью сайта направлены мутагенез комплект для замены sgRNA ориентации гена TgUPRT TgCPL. Область кодирования sgRNA увеличена, чтобы показать области, к которым грунтовки anneal. После ПЦР мутировавшая плазмида была линейной и загружена в 1% агарозный гель для проверки успешного усиления, за которым последовала экстракция геля. (B) Гель изображение ПЦР-усиленной линейной конструкции sgRNA выражения. (C) После гель-экстракции, продукт ПЦР был циркуляризирован и впоследствии преобразован в кишечную палочку. Клоны, содержащие ожидаемые плазмиды, были проверены путем ограничения эндонуклеазы пищеварения и секвенирования ДНК. Размеры полосы после пищеварения ДНК составляли 7,2 б.п. и 2,4 кб. Группа, генерируемая неспецифическим расщеплеем из эндонуклизов, помечена звездочкой. (D) Обратный грунтовка M13, обозначенная на рисунке, была использована для последовательности мутировавшей области РНК-руководства в сгенерированном векторе экспрессии TgCPL-targetingsgRNA. Секвенированная область ДНК была выровнена с шаблоном плазмида для подтверждения успешного мутагенеза. (E) В этом исследовании, 50 bp гомологичные регионы, соответствующие 5'- и 3'UTRs TgCPL были разработаны в грунтовки для усиления шаблона ремонта и в окружении 5'- и 3'-концы пылинки пириметамина сопротивления пЦР, соответственно. Электрофорус геля Агарозе был использован для проверки правильного размера продукта ПЦР до извлечения геля. Ожидаемый размер шаблона ремонта составляет 2,7 кб. Как правило, 5-6 мкг шаблона ремонта можно получить из 200 ЗЛ реакции ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: ПЦР и иммуноблоттическое подтверждение TgCPL-дефицитных паразитов. (A) Схемаическая диаграмма, изображающая общие стратегии TgCPL-удалениев Токсоплазме и ПЦР основе скрининга правильного tgCPL нокаут клонов. Праймеры, используемые для скрининга, помечены. (B) ПЦР и агарозный гель электрофорез были использованы для выбора клонов, содержащих правильную интеграцию пылики сопротивления пириметамина в локус TgCPL и потерю гена TgCPL. Геномная ДНК популяцииЧПЛ служила положительным контролем для обнаружения 5'- и 3'ARM, в то время как геномная ДНК WT использовалась для обнаружения гена TgCPL в качестве положительного контроля. Вода использовалась вместо шаблона ДНК в реакциях ПЦР, чтобы служить негативным контролем. Ожидаемые полосы обозначаются стрелками, в то время как неспецифические усиления ПЦР маркируются звездочками. (C) Клон 1 определены ПЦР скрининга был выращен в культуре тканей для подготовки клеточного лизата и дальнейшего иммуноблтинга анализа, чтобы подтвердить потерю экспрессии TgCPL в нокаут. TgActin использовался в качестве погрузочного контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Люцифераза: | Конечной точки |
| Время интеграции: | 1 с |
| Набор фильтров - Выброс: | Полный свет |
| Оптика: | Вверх |
| Получить: | 135 |
| Скорость чтения: | Нормальной |
| Задержки: | 100 мс |
| Читайте высоту: | 4,5 мм |
Таблица 1: Настройки чтения микроплит для измерения активности люциферазы во время анализа роста токсоплазмы на основе люциферазы.
| Первоначальная денатурация: | 98 кв. c в течение 5 мин |
| 25 циклов | |
| Денатуринг: | 98 кк с 5 с |
| Отжига: | 60 кв. м на 15 с |
| Расширение: | 72 КК в течение 1 мин |
| Окончательное расширение: | 72 КК в течение 10 мин |
Таблица 2: Настройки термоциклоза для генерации вектора экспрессии sgRNA.
| Образец | Объем (l) |
| Продукт ПЦР (10-50 нг) | 1 |
| 2X KLD (киназа, лигаза, DpnI) Реакция буфера | 5 |
| 10X KLD Ферментный микс | 1 |
| Безнущее вода | 3 |
| Общая | 10 |
Таблица 3: Рецепт реакции для круговой циркуляции вектора экспрессии sgRNA.
| Первоначальная денатурация: | 98 кв. c в течение 5 мин |
| 35 циклов | |
| Денатуринг: | 98 кк с 15 с |
| Отжига: | 58 кк с 15 с |
| Расширение: | 72 кК за 30 с за кб |
| Окончательное расширение: | 72 КК в течение 10 мин |
Таблица 4: Настройка Thermocycler для генерации шаблона ремонта.
| Образец | Объем (l) |
| общая геномная ДНК токсоплазмы | 1 |
| Передняя грунтовка (25 мкм) | 0.2 |
| Обратная грунтовка (25 мкм) | 0.2 |
| 2x PCR мастер премикс | 5 |
| Безнущее вода | 3.6 |
| Общая | 10 |
Таблица 5: Рецепт реакции СпЦ колонии для скрининга одного клона Токсоплазмы.
| Первоначальная денатурация: | 98 кв. c в течение 5 мин |
| 35 циклов | |
| Денатуринг: | 98 кк с 5 с |
| Отжига: | 55 - 62 кк с 5 с |
| Расширение: | 72 кК за 20 с за кб |
| Окончательное расширение: | 72 КК в течение 1 мин |
Таблица 6: Термоциклер настройки для скрининга одного клонов Токсоплазмы.
| Цитомикс буфер | 25 мМ HEPES, рН 7.6, 120 mM KCl, 10 мМ K2HPO4/KH2PO4, 5 мМ MgCl2, 0.015 mM CaCl2, и 2 мМ EGTA. |
| D10 средний | DMEM 1X (Корнинг, Кошка: 10-013-CV), 10 мм HEPES, 10% (v/v) Космическая сыворотка теленка (Hyclone, Cat No: SH30087.03), 1 мм пируват натрия, 4 мм L-глутамина, 100 единиц/мл пениколлина, и 100 м/ м/ г/ |
| Фенол красно-свободной среде | DMEM / Высокомодифицированный (Hyclone, Кошка: SH30284.02), 10 мМ HEPES, 10% (v/v) Космическая сыворотка теленка (Hyclone, Cat No: SH30087.03), 1 мМ натриевный пируват, 4 мМ L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина, и 100 мкг/мл стрептоцин. |
| 2X НЛюк Буфер | 100 мМ МЧС, рН 6,0, 1мМ CDTA, 0,5% Тергитоль, 0,05% Мазу DF 204, 150 мм КЛ, 1 мМ ДТТ, 35 мм Tiourea. |
Дополнительная таблица 1: Рецепты буферов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
«Этот протокол описывает протокол на основе люциферазы для оценки роста внутриклеточной токсоплазмы и оценки эффективности ингибирования химических соединений против роста паразитов. По сравнению с существующими стратегиями измерения внутриклеточного роста токсоплазмы, этот метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью. При мониторинге роста паразитов, макет анализ в ясной 96 хорошо микроплиты рекомендуется подтвердить, что испытания штамма преждевременно лиза клетки-хозяина до конца периода оценки. В противном случае показания люминесценции не будут точно отражать рост паразитов, так как Токсоплазма только реплицируется в клетках-хозяинах.
Было отмечено, что фенол красный краситель быстро утоляет активность люциферазы, что может привести к значительным различиям в показаниях люциферазы среди технических репликизируемых из-за задержки в отдельных измерений скважины считывателя пластин. Таким образом, оптимально подготовить HFFs в фенол красно-свободной среде до посева в 96 хорошо микроплиты. Кроме того, в случае высокой активности люциферазы, перекрестное вмешательство может привести к значительным изменениям среди соседних скважин, демонстрирующих сильную активность люциферазы. Поэтому рекомендуется разместить пустую колонку между каждым штаммом.
В частности, для RH qku80::Штамм NLuc, 1500 паразитов прививаются в каждую скважину для оценки роста. Так как удвоение времени для Паразитов Токсоплазмы WT составляет 6-8 ч24, ожидается, что увидеть увеличение активности люциферазы в 8-16 раз на 24 ч после инфекции. Тем не менее, некоторые штаммы со значительными дефектами роста будет только дать небольшое увеличение активности люциферазы. Поэтому, если первоначальный инокулум паразита низок, присущие изменения в активности люциферазы будут маскировать наблюдение за увеличением люминесценции в течение периода роста. Таким образом, рекомендуется прививать большее количество паразитов для достижения точного изменения раза для штаммов с недостатками роста.
В протоколе, руководство РНК дизайн следует общим правилам, используемым для CRISPR-Cas9 на основе изменения генома в клетках млекопитающих25. В настоящее время многие виды программного обеспечения и онлайн-платформы предоставляют услуги для руководства РНК дизайн в различных организмах, таких как CHOPCHOP26, E-CRISP27, и EuPaGDT28. Здесь коммерческое программное обеспечение(Таблица материалов) используется для проектирования sgRNA. По сравнению с ранее упомянутыми онлайн-программами, это программное обеспечение обеспечивает локальную среду для проектирования sgRNA. Он вычисляет оценки активности и специфичности для каждого кандидата sgRNA с помощью ранее опубликованного алгоритма25,29.
Технически, любой sgRNA, расположенный в гене интереса, который содержит высокую оценку специфичности, может эффективно посредничать в расщеплении геномной ДНК для зависимой от гомологии рекомбинации. На практике предпочтительным является sgRNA, ориентированный на регион, близкий к началу или стоп-кодон. Гены интереса могут быть эндогенно эпитоп-помечены с помощью sgRNA, который генерирует двухцепочечный разрыв в конце гена. Эндогенно пометки гена до его удаления поможет подтвердить потерю гена с помощью иммуноблоттирования обнаружения в случае, если антитела против белка интерес не доступна. Эпитоп-метка гена также может помочь определить субклеточное расположение белка, представляющих интерес с помощью иммунофлюоресценциальной микроскопии. Кроме того, если целевой ген имеет важное значение, sgRNA признавая стартовой области гена могут быть использованы для замены его коньяк промоутер тетрациклин-ответный промоутер для создания условного нокаута.
Кроме того, протокол описывает метод удаления генов в токсоплазме, заменив ген TgCPL на кассету сопротивления пириметамина. С помощью различных шаблонов плазмид кодирования других кассет лекарственной устойчивости, исследователи могут изменить грунтовки последовательности для включения других генов устойчивости к антибиотикам в шаблон ремонта через ПЦР. Кроме того, этот протокол может быть изменен для выполнения других модификаций генома, таких как эндогенные гены пометки, промоушен замены, и сайт-направленный мутагенез. Примечательно, что гомологичные области, используемые в этом протоколе, имеют длину всего 50 б.п. Отдельное исследование успешно использовало 40-43 bp гомологичные последовательности ДНК для введения однонуклеотидных мутаций и генных эпитопов, пометки в паразитах Токсоплазмы 22. Гомологичные последовательности ДНК в такой короткой длине могут быть легко включены в грунтовки. Хотя мы не количественно оценить эффективность HDR для этой конкретной длины гомологичный регион, кажется, что 40-50 bp области достаточно для эффективной рекомбинации ДНК в TgKu80-дефицит ный штамм токсоплазмы, о чем свидетельствует успешная генная манипуляция нескольких генов недавно достигнута15,22.
Во время определения эффективности химических соединений, если перспективный ген цели препарата имеет важное значение, сравнение сдвигов в значениях IC50 между диким типом и нокаутштаммов не является практическим. В этом сценарии, анализ непосредственно измерения способности химических соединений подавлять рекомбинантной активности белка требуется для оценки эффективности и специфичности препаратов. Недавняя литература сообщила о фитнес-оценки отдельных генов в Toxoplasma, выполняя геном широкий экран CRISPR30, который может служить в качестве руководства, чтобы помочь оценить сложность создания прямого мутации нокаут для гена интереса.
В совокупности протокол описывает успешное завершение анализа роста внутриклеточной токсоплазмы на основе люциферазы и стратегии оценки химических ингибиторов против роста токсоплазмы. Также подробно описан протокол редактирования генома на основе CRISPR-Cas9 для удаления генов у паразитов токсоплазмы, который широко используется в этой области. Отдельные лаборатории могут изменять описанный протокол в соответствии с экспериментальными потребностями, такими как эндогенные пометки генов, переключение маркеров отбора лекарств и изменение периода оценки роста внутриклеточного паразита.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Сибли и Каррутерс для обмена pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT плазмид и антитела анти-TgCPL и TgActin. Эта работа была поддержана Фондом стартапов Clemson (к З.Д.), Рыцари Тамплиеров Глаз Фонд детской офтальмологии Карьера-Стартер исследований Грант (к З.Д.), пилотный грант NIH COBRE грант P20GM109094 (к З.Д.), и NIH R01AI143707 (к З.Д.). Спонсоры не принимали никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).
- Kieffer, F., Wallon, M. Congenital toxoplasmosis. Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).
- Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens. Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).
- Dubey, J. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).
- Lindsay, D., Dubey, J. Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis. Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).
- Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening. European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).
- Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management. Clinical & Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).
- Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil. Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).
- Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture. Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).
- Derouin, F., Chastang, C. Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).
- McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).
- Touquet, B., et al. High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds. PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).
- Thornton, L. B., et al. An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion. PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).
- Larson, E. T., et al. Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl. The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).
- Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins. mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).
- Cristina, M., et al. Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection. Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).
- Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).
- Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
- Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).
- Radke, J. R., et al. Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).
- Ran, A. F., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
