Substructure Analyzer: En brukervennlig arbeidsflyt for rask utforskning og nøyaktig analyse av cellulære organer i fluorescensmikroskopibilder
Summary
Vi presenterer en fritt tilgjengelig arbeidsflyt bygget for rask utforskning og nøyaktig analyse av cellulære organer i bestemte cellerom i fluorescensmikroskopibilder. Denne brukervennlige arbeidsflyten er utformet på åpen kildekode-programvare isete og bruker også ImageJ-funksjonalitet. Rørledningen er rimelig uten kunnskap i bildeanalyse.
Abstract
Det siste tiåret har vært preget av gjennombrudd i fluorescensmikroskopiteknikker illustrert av forbedring av romlig oppløsning, men også i live-celleavbildning og høygjennomstrømningsmikroskopiteknikker. Dette førte til en konstant økning i mengden og kompleksiteten til mikroskopidataene for et enkelt eksperiment. Fordi manuell analyse av mikroskopidata er svært tidkrevende, subjektiv og forbyr kvantitative analyser, blir automatisering av bioimageanalyse nesten uunngåelig. Vi bygget en informatikkarbeidsflyt kalt Substructure Analyzer for å automatisere signalanalysen i bioimages fra fluorescerende mikroskopi. Denne arbeidsflyten er utviklet på den brukervennlige åpen kildekode-plattformen Icy og fullføres av funksjoner fra ImageJ. Det inkluderer forhåndsbehandling av bilder for å forbedre signalet til støyforhold, den individuelle segmenteringen av celler (deteksjon av cellegrenser) og deteksjon / kvantifisering av cellelegemer beriket i bestemte cellerom. Den største fordelen med denne arbeidsflyten er å foreslå komplekse bio-imaging funksjonalitet til brukere uten bildeanalyse kompetanse gjennom et brukervennlig grensesnitt. Videre er det svært modulært og tilpasset flere problemer fra karakterisering av kjernefysisk / cytoplasmatisk translokasjon til komparativ analyse av forskjellige cellelegemer i forskjellige cellulære understrukturer. Funksjonaliteten til denne arbeidsflyten illustreres gjennom studiet av Cajal (kveilet) Organer under oksidative stressforhold (OS). Data fra fluorescensmikroskopi viser at deres integritet i menneskelige celler påvirkes noen timer etter induksjon av OS. Denne effekten er preget av en reduksjon av coilinkjerning i karakteristiske Cajal Bodies, forbundet med en nukleoplasmisk omfordeling av coilin til et økt antall mindre foci. Coilins sentrale rolle i utvekslingen mellom CB-komponenter og den omkringliggende nukleoplasma tyder på at OS indusert omfordeling av coilin kan påvirke sammensetningen og funksjonaliteten til Cajal Bodies.
Introduction
Lett mikroskopi og, mer spesielt, fluorescensmikroskopi er robuste og allsidige teknikker som vanligvis brukes i biologiske vitenskaper. De gir tilgang til nøyaktig lokalisering av ulike biomolekyler som proteiner eller RNA gjennom deres spesifikke fluorescerende merking. Det siste tiåret har vært preget av raske fremskritt innen mikroskopi og bildeteknologi som det fremgår av Nobelprisen i kjemi i 2014 som tildeler Eric Betzig, Stefan W. Hell og William E. Moerner for utviklingen av super-løst fluorescensmikroskopi (SRFM)1. SFRM omgår diffraksjonsgrensen for tradisjonell optisk mikroskopi for å bringe den inn i nanodimensionen. Forbedring i teknikker som live-imaging eller høy gjennomstrømning screening tilnærminger øker også mengden og kompleksiteten av dataene til å behandle for hvert eksperiment. Mesteparten av tiden står forskerne overfor høye heterogene populasjoner av celler og ønsker å analysere fenotyper på encellet nivå.
I utgangspunktet ble analyser som foci telling utført av øyet, som foretrekkes av noen forskere siden det gir full visuell kontroll over telleprosessen. Manuell analyse av slike data er imidlertid for tidkrevende, fører til variasjon mellom observatører, og gir ikke tilgang til mer komplekse funksjoner slik at dataassisterte tilnærminger blir mye brukt og nesten uunngåelig2. Bioimage informatikk metoder øker effektiviteten av dataanalyse betydelig og er fri for uunngåelig operatør subjektivitet og potensielle skjevhet av manuell telling analyse. Den økte etterspørselen på dette feltet og forbedring av datakraft førte til utvikling av et stort antall bildeanalyseplattformer. Noen av dem er fritt tilgjengelig og gir tilgang til ulike verktøy for å utføre analyse med personlige datamaskiner. En klassifisering av åpne tilgangsverktøy har nylig blitt etablert3 og presenterer Icy4 som en kraftig programvare som kombinerer brukervennlighet og funksjonalitet. Videre har Icy fordelen av å kommunisere med ImageJ.
For brukere uten bildeanalyseekspertise er de viktigste hindringene å velge riktig verktøy i henhold til de problematiske og riktig innstilte parametrene som ofte ikke er godt forstått. Videre er oppsettstidene ofte lange. Isete foreslår et brukervennlig pek-og-klikk-grensesnitt kalt “Protokoller” for å utvikle arbeidsflyt ved å kombinere noen plugins som finnes i en uttømmende samling4. Den fleksible modulære utformingen og pek-og-klikk-grensesnittet gjør det mulig å sette opp en analyse for ikke-programmerere. Her presenterer vi en arbeidsflyt kalt Substructure Analyzer, utviklet i Isens grensesnitt, hvis funksjon er å analysere fluorescerende signaler i bestemte cellulære rom og måle forskjellige funksjoner som lysstyrke, foci nummer, foci størrelse og romlig distribusjon. Denne arbeidsflyten løser flere problemer, for eksempel kvantifisering av signaloverføring, analyse av transfiserte celler som uttrykker en fluorescerende reporter, eller analyse av foci fra forskjellige cellulære understrukturer i individuelle celler. Det tillater samtidig behandling av flere bilder, og utdataresultater eksporteres til et tabulatord som kan åpnes i vanlige regnearkprogrammer.
Rørledningen Understrukturanalysator presenteres i figur 1. Først er alle bildene i en spesifisert mappe forhåndsbehandlet for å forbedre signalet til støyforholdet. Dette trinnet øker effektiviteten av følgende trinn og reduserer driftstiden. Deretter identifiseres og segmenteres interesseområdene( ROIer), som tilsvarer bildeområdene der det fluorescerende signalet skal oppdages, og segmenteres. Til slutt analyseres det fluorescerende signalet, og resultatene eksporteres til et tabulatord.
Objektsegmentering (påvisning av grenser) er det mest utfordrende trinnet i bildeanalyse, og effektiviteten bestemmer nøyaktigheten av de resulterende cellemålingene. De første objektene som er identifisert i et bilde (kalt primære objekter) er ofte kjerner fra DNA-farget bilder (DAPI eller Hoechst flekker), selv om primære objekter også kan være hele celler, perler, flekker, svulster, eller hva farget objekter. I de fleste biologiske bilder berører celler eller kjerner hverandre eller overlapper hverandre, noe som fører til at de enkle og raske algoritmene mislykkes. Til dags dato kan ingen universell algoritme utføre perfekt segmentering av alle objekter, hovedsakelig fordi deres egenskaper (størrelse, form eller tekstur) modulerer effektiviteten av segmentering5. Segmenteringsverktøyene som vanligvis distribueres med mikroskopiprogramvare (for eksempel MetaMorph Imaging Software av Molecular Devices6, eller NIS-Elements Advances Research-programvaren av Nikon7) er vanligvis basert på standardteknikker som korrelasjonsmatching, terskel eller morfologiske operasjoner. Selv om de er effektive i grunnleggende systemer, presenterer disse overgeneraliserte metodene raskt begrensninger når de brukes i mer utfordrende og spesifikke sammenhenger. Faktisk er segmentering svært følsom for eksperimentelle parametere som celletype, celletetthet eller biomarkører, og krever ofte gjentatt justering for et stort datasett. Arbeidsflyten for substructureanalysator integrerer både enkle og mer sofistikerte algoritmer for å foreslå ulike alternativer tilpasset bildekompleksitet og brukerbehov. Det foreslår spesielt den markørbaserte vannskillealgoritmen8 for svært grupperte objekter. Effektiviteten til denne segmenteringsmetoden er avhengig av valg av individuelle markører på hvert objekt. Disse markørene velges manuelt mesteparten av tiden for å få riktige parametere for full segmentering, noe som er svært tidkrevende når brukerne står overfor et høyt antall objekter. Substructure Analyzer foreslår en automatisk påvisning av disse markørene, noe som gir en svært effektiv segmenteringsprosess. Segmentering er, mesteparten av tiden, det begrensende trinnet for bildeanalyse og kan betydelig endre behandlingstiden avhengig av oppløsningen av bildet, antall objekter per bilde og nivået av klynger av objekter. Vanlige datasamlebånd krever noen sekunder til 5 minutter per bilde på en standard stasjonær datamaskin. Analyse av mer komplekse bilder kan kreve en kraftigere datamaskin og litt grunnleggende kunnskap i bildeanalyse.
Fleksibiliteten og funksjonaliteten til denne arbeidsflyten illustreres med ulike eksempler i de representative resultatene. Fordelene med denne arbeidsflyten vises spesielt gjennom studiet av kjernefysiske understrukturer under oksidative stressforhold (OS). OS tilsvarer en ubalanse i redoks homeostase i favør av oksidanter og er forbundet med høye nivåer av reaktive oksygenarter (ROS). Siden ROS fungerer som signalmolekyler, påvirker endringer i konsentrasjon og subcellulær lokalisering positivt eller negativt et mylder av veier og nettverk som regulerer fysiologiske funksjoner, inkludert signaltransduksjon, reparasjonsmekanismer, genuttrykk, celledød og spredning9,10. OS er dermed direkte involvert i ulike patologier (nevrodegenerative og kardiovaskulære sykdommer, kreft, diabetes, etc.), men også cellulær aldring. Derfor, dechiffrere konsekvensene av OS på den menneskelige cellens organisasjon og funksjon utgjør et avgjørende skritt i forståelsen av rollene til OS i utbruddet og utviklingen av menneskelige patologier. Det er fastslått at OS regulerer genuttrykk ved å modulere transkripsjon gjennom flere transkripsjonsfaktorer (p53, Nrf2, FOXO3A)11, men også ved å påvirke reguleringen av flere sam- og post-transkripsjonelle prosesser som alternativ spleising (AS) av pre-RNAs12,13,14. Alternativ spleising av primære koding og ikke-koding transkripsjoner er en viktig mekanisme som øker koding kapasiteten av genomene ved å produsere transkripsjon isoformer. AS utføres av et stort ribonucleoprotein kompleks kalt skjøteosom, som inneholder nesten 300 proteiner og 5 U-rike små kjernefysiske RNAs (UsnRNAs)15. Spleikaenhet og AS er tett kontrollert i celler, og noen trinn i den skjøteosommodningen forekommer i membranfrie kjernefysiske rom kalt Cajal Bodies. Disse kjernefysiske understrukturene er preget av den dynamiske naturen til deres struktur og deres sammensetning, som hovedsakelig utføres av multivalente interaksjoner mellom deres RNA og proteinkomponenter med coilinproteinet. Analyse av tusenvis av celler med arbeidsflyten for substructure analyzer tillot karakterisering av aldri beskrevne effekter av OS på Cajal Bodies. Faktisk, innhentet data tyder på at OS endrer kjernen av Cajal Bodies, indusere en nukleoplasmisk omfordeling av coilin protein i mange mindre kjernefysiske foci. En slik endring av strukturen i Cajal Bodies kan påvirke modningen av skjøteosomet og delta i AS-modulasjon av OS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et økende antall gratis programvareverktøy er tilgjengelige for analyse av fluorescenscellebilder. Brukere må riktig velge tilstrekkelig programvare i henhold til kompleksiteten av deres problematiske, til deres kunnskap i bildebehandling, og til den tiden de ønsker å bruke i sin analyse. Isete, CellProfiler eller ImageJ/Fiji er kraftige verktøy som kombinerer både brukervennlighet og funksjonalitet3. Isete er et frittstående verktøy som presenterer et klart grafisk brukergrensesnitt (GUI…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.H. ble støttet av en utdannet stipendiat fra Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. ble støttet av en utdannet stipendiat fra Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), mens Q.T. ble støttet av et offentlig stipend overvåket av det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR) som en del av det andre “Investissements d’Avenir” -programmet FIGHT-HF (referanse: ANR-15-RHU4570004). Dette arbeidet ble finansiert av CNRS og Université de Lorraine (UMR 7365).
Materials
| 16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | to fix the cells |
| Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | fluorescent secondary antibody |
| Alexa Fluor 555 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A34055 | fluorescent secondary antibody |
| Bovine serum albumin standard (BSA) | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | cell culture medium |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | mounting medium |
| Human: HeLa S3 cells | IGBMC, Strasbourg, France | cell line used to perform the experiments | |
| Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | used as a stressing agent |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | transfection reagent |
| Mouse monoclonal anti-coilin | abcam | ab11822 | Coilin-specific antibody |
| Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope | Nikon | epifluoresecence microscope | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | transfection medium |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | to wash the cells |
| Rabbit polyclonal anti-53BP1 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1-specific antibody |
| Rabbit polyclonal anti-EDC4 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4-specific antibody |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | to permeabilize the cells |
References
- Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
- Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
- Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
- Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
- . MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018)
- . NIS-Elements Imaging Software Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014)
- Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- D’Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
- Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D’Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
- Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
- Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
- Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
- Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
- Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
- Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
