Substructuur Analyzer: Een gebruiksvriendelijke workflow voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in fluorescentiemicroscopie beelden

Summary

We presenteren een vrij beschikbare workflow gebouwd voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in specifieke celcompartimenten in fluorescentiemicroscopie beelden. Deze gebruiksvriendelijke workflow is ontworpen op de open-source software Icy en maakt ook gebruik van ImageJ functionaliteiten. De pijplijn is betaalbaar zonder kennis van beeldanalyse.

Abstract

Het laatste decennium werd gekenmerkt door doorbraken in fluorescentie microscopie technieken geïllustreerd door verbetering van de ruimtelijke resolutie, maar ook in live-cel beeldvorming en high-throughput microscopie technieken. Dit leidde tot een constante toename van de hoeveelheid en complexiteit van de microscopiegegevens voor één experiment. Omdat handmatige analyse van microscopiegegevens zeer tijdrovend, subjectief is en kwantitatieve analyses verbiedt, wordt automatisering van bioimageanalyse bijna onvermijdelijk. We bouwden een informatica workflow genaamd Substructure Analyzer om de signaalanalyse volledig te automatiseren in biobeelden van fluorescerende microscopie. Deze workflow is ontwikkeld op het gebruiksvriendelijke open-source platform Icy en wordt aangevuld met functionaliteiten van ImageJ. Het omvat de voorbewerking van beelden om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, de individuele segmentatie van cellen (detectie van celgrenzen) en de detectie/kwantificering van cellichamen verrijkt in specifieke celcompartimenten. Het belangrijkste voordeel van deze workflow is om complexe bio-imaging functionaliteiten voor te stellen aan gebruikers zonder kennisanalyse expertise via een gebruiksvriendelijke interface. Bovendien is het zeer modulair en aangepast aan verschillende kwesties van de karakterisering van nucleaire / cytoplasmische translocatie aan de vergelijkende analyse van verschillende cellichamen in verschillende cellulaire substructuren. De functionaliteit van deze workflow wordt geïllustreerd door de studie van de Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) voorwaarden. Gegevens van fluorescentiemicroscopie tonen aan dat hun integriteit in menselijke cellen een paar uur na de inductie van OS wordt beïnvloed. Dit effect wordt gekenmerkt door een afname van coilin nucleatie in karakteristieke Cajal Bodies, geassocieerd met een nucleoplasmische herverdeling van coilin in een verhoogd aantal kleinere foci. De centrale rol van coilin in de uitwisseling tussen CB-componenten en het omringende nucleoplasma suggereert dat os-geïnduceerde herverdeling van coilin de samenstelling en de functionaliteit van Cajal Bodies kan beïnvloeden.

Introduction

Lichte microscopie en, meer in het bijzonder, fluorescentiemicroscopie zijn robuuste en veelzijdige technieken die vaak worden gebruikt in de biologische wetenschappen. Ze geven toegang tot de precieze lokalisatie van verschillende biomoleculen zoals eiwitten of RNA door hun specifieke fluorescerende etikettering. Het afgelopen decennium is gekenmerkt door snelle vooruitgang in microscopie en imaging technologieën zoals blijkt uit de 2014 Nobelprijs voor de Scheikunde toekenning Eric Betzig, Stefan W. Hell en William E. Moerner voor de ontwikkeling van super-resolved fluorescentie microscopie (SRFM)¹. SFRM omzeilt de diffractielimiet van traditionele optische microscopie om deze in de nanodimensie te brengen. Verbetering van technieken zoals live-imaging of hoge doorvoer screening benaderingen verhoogt ook de hoeveelheid en de complexiteit van de gegevens te behandelen voor elk experiment. De meeste van de tijd, onderzoekers worden geconfronteerd met hoge heterogene populaties van cellen en willen fenotypes te analyseren op het eencellige niveau.

Aanvankelijk werden analyses zoals foci tellen uitgevoerd door het oog, wat de voorkeur heeft van sommige onderzoekers, omdat het volledige visuele controle biedt over het telproces. Handmatige analyse van dergelijke gegevens is echter te tijdrovend, leidt tot variabiliteit tussen waarnemers en geeft geen toegang tot complexere functies, zodat computerondersteunde benaderingen op grote schaal worden gebruikt en bijna onvermijdelijk². Bioimage informaticamethoden verhogen de efficiëntie van data-analyse aanzienlijk en zijn vrij van de onvermijdelijke operator subjectiviteit en potentiële bias van de handmatige telanalyse. De toegenomen vraag op dit gebied en de verbetering van computerkracht leidden tot de ontwikkeling van een groot aantal beeldanalyseplatforms. Sommigen van hen zijn vrij beschikbaar en geven toegang tot verschillende tools om analyse uit te voeren met personal computers. Een classificatie van open access tools is onlangs opgericht³ en presenteert Icy⁴ als een krachtige software die bruikbaarheid en functionaliteit combineert. Bovendien heeft Icy het voordeel van de communicatie met ImageJ.

Voor gebruikers zonder expertise op het gebied van beeldanalyse zijn de belangrijkste obstakels het kiezen van het juiste gereedschap op basis van de problematische en correct afgestemde parameters die vaak niet goed worden begrepen. Bovendien zijn de insteltijden vaak lang. Icy stelt een gebruiksvriendelijke point-and-click interface genaamd "Protocollen" voor om workflow te ontwikkelen door een aantal plug-ins te combineren die in een uitputtende verzameling zijn gevonden⁴. Het flexibele modulaire ontwerp en de point-and-click interface maken het opzetten van een analyse haalbaar voor niet-programmeurs. Hier presenteren we een workflow genaamd Substructure Analyzer, ontwikkeld in Icy's interface, wiens functie is om fluorescerende signalen in specifieke cellulaire compartimenten te analyseren en verschillende functies te meten als helderheid, foci-getal, foci-grootte en ruimtelijke verdeling. Deze workflow behandelt verschillende kwesties, zoals kwantificering van signaaltranslocatie, analyse van doorfecteerde cellen die een fluorescerende reporter uitdrukken, of analyse van foci uit verschillende cellulaire substructuren in individuele cellen. Hiermee u meerdere afbeeldingen gelijktijdig verwerken en worden uitvoerresultaten geëxporteerd naar een door tabbladen afgebakend werkblad dat kan worden geopend in veelgebruikte spreadsheetprogramma's.

De substructuuranalyzerpijplijn wordt gepresenteerd in figuur 1. Ten eerste worden alle afbeeldingen in een opgegeven map vooraf verwerkt om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Deze stap verhoogt de efficiëntie van de volgende stappen en vermindert de looptijd. Vervolgens worden de regio's van belang (ROI's), die overeenkomen met de afbeeldingsgebieden waar het fluorescerende signaal moet worden gedetecteerd, geïdentificeerd en gesegmenteerd. Ten slotte wordt het fluorescerende signaal geanalyseerd en worden de resultaten geëxporteerd naar een door tabbladen afgebakend werkblad.

Objectsegmentatie (detectie van grenzen) is de meest uitdagende stap in beeldanalyse en de efficiëntie ervan bepaalt de nauwkeurigheid van de resulterende celmetingen. De eerste objecten geïdentificeerd in een afbeelding (de zogenaamde primaire objecten) zijn vaak kernen van DNA-gekleurde beelden (DAPI of Hoechst vlekken), hoewel primaire objecten kunnen ook hele cellen, kralen, spikkels, tumoren, of wat gekleurde objecten. In de meeste biologische beelden raken cellen of kernen elkaar of overlappen elkaar waardoor de eenvoudige en snelle algoritmen mislukken. Tot op heden kan geen enkel universeel algoritme een perfecte segmentatie van alle objecten uitvoeren, vooral omdat hun kenmerken (grootte, vorm of textuur) de efficiëntie van segmentatie⁵moduleren. De segmentatietools die gewoonlijk worden gedistribueerd met microscopiesoftware (zoals de MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices⁶, of de NIS-Elements Advances Research software van Nikon⁷) zijn over het algemeen gebaseerd op standaardtechnieken zoals correlatiematching, thresholding of morfologische bewerkingen. Hoewel efficiënt in basissystemen, deze overgegeneraliseerde methoden snel presenteren beperkingen bij gebruik in meer uitdagende en specifieke contexten. Segmentatie is namelijk zeer gevoelig voor experimentele parameters zoals celtype, celdichtheid of biomarkers en vereist vaak herhaalde aanpassing voor een grote gegevensset. De Substructure Analyzer workflow integreert zowel eenvoudige als meer geavanceerde algoritmen om verschillende alternatieven voor te stellen die zijn aangepast aan de complexiteit van het beeld en de behoeften van de gebruiker. Het stelt met name de marker-gebaseerde waterscheiding algoritme⁸ voor sterk geclusterde objecten. De efficiëntie van deze segmentatiemethode is afhankelijk van de selectie van afzonderlijke markeringen op elk object. Deze markeringen worden meestal handmatig gekozen om de juiste parameters voor volledige segmentatie te krijgen, wat zeer tijdrovend is wanneer gebruikers geconfronteerd worden met een groot aantal objecten. Substructuur Analyzer stelt een automatische detectie van deze markers voor, wat een zeer efficiënt segmentatieproces biedt. Segmentatie is meestal de beperkende stap van beeldanalyse en kan de verwerkingstijd aanzienlijk wijzigen, afhankelijk van de resolutie van de afbeelding, het aantal objecten per afbeelding en het niveau van clustering van objecten. Typische pijplijnen vereisen enkele seconden tot 5 minuten per afbeelding op een standaard desktopcomputer. Analyse van complexere beelden kan een krachtigere computer en enige basiskennis in beeldanalyse vereisen.

De flexibiliteit en functionaliteit van deze workflow worden geïllustreerd met verschillende voorbeelden in de representatieve resultaten. De voordelen van deze workflow worden met name weergegeven door de studie van nucleaire substructuren onder oxidatieve stress (OS) omstandigheden. OS komt overeen met een onbalans van de redox homeostase ten gunste van oxidanten en wordt geassocieerd met hoge niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS). Aangezien ROS fungeren als signaalmoleculen, beïnvloeden veranderingen in hun concentratie en subcellulaire lokalisatie positief of negatief een groot aantal trajecten en netwerken die fysiologische functies reguleren, waaronder signaaltransductie, reparatiemechanismen, genexpressie, celdood en proliferatie^9,10. OS is dus direct betrokken bij verschillende pathologieën (neurodegeneratieve en hart- en vaatziekten, kankers, diabetes, enz.), maar ook cellulaire veroudering. Daarom is het ontcijferen van de gevolgen van OS op de organisatie en functie van de menselijke cel een cruciale stap in het begrijpen van de rol van OS in het begin en de ontwikkeling van menselijke pathologieën. Er is vastgesteld dat OS genexpressie reguleert door transcriptie te moduleren via verschillende transcriptiefactoren (p53, Nrf2, FOXO3A)¹¹, maar ook door de regulering van verschillende co- en posttranscriptieprocessen zoals alternatieve splicing (AS) van pre-RNAs¹²,^13,,14. Alternatieve splicing van primaire codering en niet-coderende transcripties is een essentieel mechanisme dat de coderingscapaciteit van de genomen verhoogt door transcriptie-isovormen te produceren. AS wordt uitgevoerd door een enorm ribonucleoprotein complex genaamd spliceosoom, met bijna 300 eiwitten en 5 U-rijke kleine nucleaire RNAs (UsnRNAs)¹⁵. Spliceosoom assemblage en AS zijn strak gecontroleerd in cellen en sommige stappen van de spliceosoom rijping optreden binnen membraan-minder nucleaire compartimenten genaamd Cajal Bodies. Deze nucleaire substructuren worden gekenmerkt door de dynamische aard van hun structuur en hun samenstelling, die voornamelijk worden uitgevoerd door multivalente interacties van hun RNA en eiwitcomponenten met het coilin-eiwit. Analyse van duizenden cellen met de Substructure Analyzer-workflow liet karakterisering toe van nooit beschreven effecten van OS op Cajal Bodies. Inderdaad, verkregen gegevens suggereren dat OS wijzigt de nucleatie van Cajal Bodies, het induceren van een nucleoplasmische herverdeling van de coilin eiwit in tal van kleinere nucleaire foci. Een dergelijke verandering van de structuur van Cajal Bodies kan de rijping van het spliceosoom beïnvloeden en deelnemen aan AS-modulatie door OS.

Protocol

LET OP: Gebruiksvriendelijke tutorials zijn beschikbaar op de website van Icy http://icy.bioimageanalysis.org.

1. Download Icy en het Substructure Analyzer protocol

1. Download Icy van de Icy website(http://icy.bioimageanalysis.org/download) en download het Substructure Analyzer protocol: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
   OPMERKING: Als u een 64-bits besturingssysteem gebruikt, moet u de 64-bits versie van Java gebruiken. Deze versie maakt het mogelijk om het geheugen toegewezen aan Icy(Voorkeuren | Algemeen | Max geheugen).

2. Opening van het protocol

1. Open Ijzig en klik op Extra in het menu Van het lint.
2. Klik op Protocollen om de interface voor protocolleneditor te openen.
3. Klik op Laden en open het protocol Substructuur Analyzer. Het laden van protocollen kan enkele seconden duren. Zorg ervoor dat de opening van het protocol is voltooid voordat u het gebruikt.
   OPMERKING: De werkstroom bestaat uit 13 algemene blokken die worden gepresenteerd in figuur 2a. Elk blok werkt als een pijplijn die bestaat uit meerdere vakken die specifieke subtaken uitvoeren.

3. Interactie met de workflow op ijzig

OPMERKING: Elk blok of vak is genummerd en heeft een specifieke rang binnen de werkstroom(figuur 2b). Door op dit nummer te klikken, wordt de dichtst mogelijke positie bij de eerste toegewezen aan het geselecteerde blok/vak, waarna de positie van de andere blokken/vakken wordt gereorganiseerd. Respecteer de juiste volgorde van de blokken bij het voorbereiden van de workflow. Spotdetector-blok heeft bijvoorbeeld vooraf gedefinieerde ROI's nodig, zodat segmentatieblokken moeten worden uitgevoerd voordat Spot Detector blokkeert. Wijzig de positie van de vakken niet. Gebruik '' niet in de naam van de afbeelding.

1. Door op het pictogram linkerbovenhoek te klikken, vouwt, vouwt, vergroot, verkleint of verwijdert u het blok(figuur 2b).
2. Elke pijplijn van de workflow wordt gekenmerkt door een netwerk van vakken die zijn verbonden via hun invoer en uitvoer(figuur 2b). Als u een verbinding wilt maken, klikt u op Uitvoer en houdt u deze aan totdat de cursor een invoer heeft bereikt. Verbindingen kunnen worden verwijderd door op de uitvoertag te klikken.

4. Samenvoeging van de kanalen van een afbeelding

1. Gebruik de samenvoegkanalen voor blok samenvoegen om samengevoegde afbeeldingen te genereren. Indien nodig wijzigt u de naam van de bestanden, zodat reeksen die moeten worden samengevoegd, hetzelfde naamsvoorvoegsel hebben, gevolgd door een afzonderlijke scheidingsteken. Reeksen van afzonderlijke kanalen uit een afbeelding A worden bijvoorbeeld benoemd: ImageA_red, ImageA_blue.
   OPMERKING: Gebruik voor de scheidingsteken geen tekens die al in de naam van de afbeelding aanwezig zijn.
2. Maak in dezelfde map één nieuwe map per kanaal om samen te voegen. Als u bijvoorbeeld rode, groene en blauwe kanalen wilt samenvoegen, maakt u 3 mappen en slaat u de bijbehorende reeksen op in deze mappen.
3. Gebruik alleen de kanalen voor het samenvoegenvan het blok, verwijder de andere blokken en sla het protocol op als Samenvoegkanalen.
   1. Toegang tot de vakken om parameters in te stellen. Vul voor elk kanaal de vakken Kanaalnummer X (vakken 1, 5 of 9), Map kanaalnummer X (vakken 2, 6 of 10), Separator kanaalnummer X (vakken 3, 7 of 11) en Colormapkanaal nb X (vakken 4, 8 en 12) respectievelijk.
      OPMERKING: Deze vakken zijn horizontaal gegroepeerd op vier, elke regel die overeenkomt met hetzelfde kanaal. In elke regel is er ook een display beschikbaar (vakken 23, 24 of 25) om de volgorde van het overeenkomstige kanaal direct te visualiseren.
      1. Kies in het vak Kanaal nummer Xwelk kanaal u wilt extraheren (in klassieke RGB-afbeeldingen, 0=Rood, 1=Groen, 2=Blauw). De gebruiker heeft snel toegang tot de verschillende kanalen van een afbeelding in het venster Inspecteur van Icy, in het tabblad Volgorde. Schrijf de waarde van het kleinste kanaal in de bovenste regel en de hoogste in de onderste regel.
      2. Schrijf in het vak Map kanaal nummer Xde \Naam van de map met afbeeldingen van kanaal X.
      3. Schrijf in het vak Separator-kanaalnummer Xde scheidingsteken die wordt gebruikt voor de naam van de afbeelding (in het vorige voorbeeld: "_red", "_green" en '_blue').
      4. Geef in het vak Colormap kanaal nb Xaan met een getal welk colormapmodel u moet gebruiken om het bijbehorende kanaal in Icy te visualiseren. De beschikbare kleurkaarten zijn zichtbaar op het tabblad Volgorde van het venster Controle.
      5. Schrijf in het vak Opmaak van samengevoegde afbeeldingen (vak 28) de extensie om samengevoegde afbeeldingen op te slaan: .tif, .gif, .jpg, .bmp of .png.
         OPMERKING: Als u slechts 2 kanalen wilt samenvoegen, vult u de vier vakken die overeenkomen met het derde kanaal niet.
   2. Klik in de linkerbovenhoek van het blok Kanalen samenvoegen op de koppeling direct rechts van map. Dubbelklik in het dialoogvenster Openen dat wordt weergegeven op de map met reeksen van het eerste kanaal die is gedefinieerd in het vak Mapkanaal nummer 1 (vak 2). Klik vervolgens op Openen.
   3. Voer het protocol uit door op de zwarte pijl in de linkerbovenhoek van het blok Kanalen samenvoegen te klikken (zie deel 7 voor meer details). Samengevoegde afbeeldingen worden opgeslagen in een map Samenvoegen in dezelfde map als de mappen van afzonderlijke kanalen.

5. Segmentatie van de bezienswaardigheden

OPMERKING: Substructure Analyzer integreert zowel eenvoudige als meer geavanceerde algoritmen om verschillende alternatieven voor te stellen die zijn aangepast aan de complexiteit van het beeld en de behoeften van de gebruiker.

1. Selecteer het aangepaste blok.
   1. Als objecten elkaar niet raken of als de gebruiker geclusterde objecten niet afzonderlijk hoeft te onderscheiden, gebruikt u de bloksegmentatie A: Niet-geclusterde objecten.
   2. Als objecten elkaar niet raken, maar sommige objecten in de buurt zijn, gebruikt u de bloksegmentatie B: Slecht geclusterde objecten.
   3. Voor objecten met een hoog clusteringniveau en een bolle vorm gebruikt u de bloksegmentatie C: Geclusterde objecten met bolle vormen.
   4. Als objecten een hoog clusterniveau hebben en onregelmatige vormen hebben, gebruikt u de bloksegmentatie D: Geclusterde objecten met onregelmatige vormen.
   5. Gebruik de bloksegmentatie E: Geclusterd cytoplasma om het individueel aanraken van cytoplasma's te segmenteren met gesegmenteerde kernen als markeringen. Dit blok heeft absoluut gesegmenteerde kernen nodig om te verwerken.
      OPMERKING: Blokken die onafhankelijk zijn aangepast voor het primaire objectsegmentatieproces, zodat meerdere blokken in dezelfde run kunnen worden gebruikt om hun efficiëntie voor een bepaalde substructuur te vergelijken of om verschillende typen substructuren te segmenteren. Als het clusteringniveau heterogeen is binnen dezelfde reeks afbeeldingen, verwerkt u kleine en sterk geclusterde objecten afzonderlijk in de aangepaste blokken.
2. Koppel de output0 (Bestand) van de blokkeermap aan de mapinvoer van het gekozen segmentatieblok.
3. Stel parameters in van het gekozen segmentatieblok.
   1. Segmentatie A: niet-geclusterde objecten en Segmentatie C: geclusterde objecten met bolle vormen
      1. Stel in vak Kanaalsignaal (kader 1) het kanaal van de objecten in op segment.
      2. Als optie, in vak Gaussian filter (vak 2), verhoging van de X en Y sigma waarden als het signaal in objecten is heterogeen. Het Gaussian-filter maakt texturen glad om meer uniforme regio's te verkrijgen en verhoogt de snelheid en efficiëntie van de kernsegmentatie. Hoe kleiner de objecten, hoe lager de sigmawaarde is. Vermijd hoge sigmawaarden. Stel standaardwaarden in op 0.
      3. Stel in vak HK-Means (kader 3) de parameter Intensiteitsklassen en de geschatte minimum- en maximumgrootte (in pixels) van objecten in die moeten worden gedetecteerd.
         OPMERKING: Voor intensiteitsklassen classificeert een waarde van 2 pixels in 2 klassen: achtergrond en voorgrond. Het wordt dus aangepast wanneer het contrast tussen de objecten en de achtergrond hoog is. Als objecten op de voorgrond verschillende intensiteiten hebben of als het contrast met de achtergrond laag is, verhoogt u het aantal klassen. De standaardinstelling is 2. Objectgrootte kan snel worden geëvalueerd door handmatig een ROI te tekenen rond het object van belang. De grootte van de ROI (Interieur in pixels) wordt direct op de afbeelding weergegeven wanneer deze met de cursor wordt aanwijzen of kan worden geopend in het venster ROI-statistieken (open deze vanaf de zoekbalk). Optimale parameters detecteren elk voorgrondobject in éénROI. Ze kunnen handmatig worden gedefinieerd in Icy(Detectie en Tracking | HK-Means).
      4. Optimaliseer in het vak Actieve contouren (kader 4) de detectie van objectranden. Uitgebreide documentatie voor deze plugin is online beschikbaar: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. De juiste parameters kunnen ook handmatig worden gedefinieerd in Icy(Detectie en Tracking | Actieve contouren).
      5. Tijdens het proces wordt automatisch een map gemaakt om afbeeldingen van gesegmenteerde objecten op te slaan. Geef in het vak Tekst (vak 6) een naam aan deze map (bijvoorbeeld gesegmenteerde kernen). Als u de indeling wilt instellen voor het opslaan van afbeeldingen van gesegmenteerde objecten (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG), vult u de vaknotatie van afbeeldingen van gesegmenteerde objecten. De map wordt gemaakt in de map met samengevoegde afbeeldingen.
      6. Voer de werkstroom uit (zie deel 7 voor meer informatie).
   2. Segmentatie B: slecht geclusterde objecten
      1. Volg dezelfde stappen als in 5.3.1 om parameters van vakken kanaalsignaal, HK-Means, Actieve contouren, Uitbreiding in te stellen om gesegmenteerde objecten en tekst op te slaan (vakkenrangen zijn niet hetzelfde als in stap 5.3.1).
      2. Stel in het vak Call IJ-plug-in (vak 4) de parameter Rollen in om achtergrondaftrekken te regelen. Stel deze parameter in op ten minste de grootte van het grootste object dat geen deel uitmaakt van de achtergrond. Het verlagen van deze waarde verhoogt de achtergrondverwijdering, maar kan ook leiden tot verlies van voorgrondsignaal.
      3. In het vak Adaptieve histogramegalisatie (kader 6) verbeteren de contrasten tussen de objecten op de voorgrond en de achtergrond. Het verhogen van de helling geeft meer contrasterende sequenties.
      4. Voer de werkstroom uit (zie deel 7 voor meer informatie).
   3. Segmentatie D: geclusterde objecten met onregelmatige vormen
      OPMERKING: Voor elke afbeelding gelden drie verschillende segmentatiemethoden: ten eersteHK-middelen clusteringin combinatie met deMethode actieve contourenwordt toegepast. Dan is deklassiek waterscheidingsalgoritme(met behulp van de Afstandskaart van Euclidian) wordt toegepast op eerder verkeerd gesegmenteerde objecten. Tot slot is eenop marker gebaseerde waterscheidingsalgoritmewordt gebruikt. Alleen HK-middelen en op marker gebaseerde waterscheidingsmethoden hebben tussenkomst van de gebruiker nodig. Voor beide methoden kunnen dezelfde parameters worden toegepast voor alle afbeeldingen (volledig geautomatiseerde versie) of worden gewijzigd voor elke afbeelding (semi-geautomatiseerde versie). Als de gebruiker niet is getraind in deze segmentatiemethoden, wordt de semi-geautomatiseerde verwerking ten zeerste aanbevolen. Tijdens de verwerking van dit blok is handmatig ingrijpen nodig. Wanneer een segmentatiemethode is voltooid, moet de gebruiker handmatig verkeerd gesegmenteerde objecten verwijderen vóór het begin van de volgende segmentatiemethode. Met succes gesegmenteerde objecten worden opgeslagen en niet in aanmerking genomen in de volgende stap(en). Dit blok moet verbonden zijn met het blokDialoogvenster Segmentatie van geclusterde/heterogene vormen primaire objectenom correct te werken.
      1. Download de ImageJ-collectie MorphoLibJ op https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. De MorphoLibJ 1.4.0 versie wordt gebruikt in dit protocol. Plaats het bestand MorphoLibJ_-1.4.0.jar in de map icy/ij/plugins. Meer informatie over de inhoud van deze collectie is beschikbaar op https://imagej.net/MorphoLibJ.
      2. Volg dezelfde stappen als in stap 5.3.1 om parameters van vakken Kanaalsignaal, Gaussian-filter, Actieve contouren, Uitbreiding in te stellen om gesegmenteerde objecten en tekstop te slaan . Dozen rangen zijn niet hetzelfde als in stap 5.3.1.
      3. Parameters van het vak Adaptieve histogramegalisatie instellen (zie stap 5.3.2.3).
      4. Als u Achtergrond aftrekkenwilt activeren, schrijft u ja in Achtergrond toepassen? (vak 5). Anders, schrijf nee. Als de plug-in is geactiveerd, stelt u de rolling parameter in (zie stap 5.3.2), in het vak Achtergrond aftrekken (vak 7).
      5. Automatisering van HK-middelen: Als u dezelfde parameters wilt toepassen voor alle afbeeldingen (volledig geautomatiseerde verwerking), stelt u de nb van klassen in (vak 11), de minimumgrootte (vak 12) en de maximale grootte (box13) (zie stap 5.3.1). Deze parameters moeten zijn ingesteld om een maximum aan voorgrondpixels te selecteren en om de individualisering van objecten op de voorgrond te optimaliseren. Voor de semi-geautomatiseerde verwerkingsversie is geen interventie nodig.
      6. Automatisering van markeringsextracties: voor de volledig geautomatiseerde versie u de extractie van de doos Interne markeringen (kader 27) uitbreiden en de waarde van de parameter dynamisch instellen in regel 13 van het script. Voor de semi-geautomatiseerde verwerkingsversie is geen interventie nodig.
         OPMERKING: Markeringen worden geëxtraheerd door een extended-minima-transformatie toe te passen op een invoerafbeelding die wordt beheerd door een parameter "dynamisch". In het op marker gebaseerde waterscheidingsalgoritme wordt overstromingen van deze markeringen gesimuleerd om objectsegmentatie uit te voeren. Voor de succesvolle segmentatie van voorgrondobjecten moet één markering per voorgrondobject worden geëxtraheerd. De instelling van de parameter "dynamische" voor optimale extractie van markeringen is meestal afhankelijk van de resolutie van afbeeldingen. Dus, als niet vertrouwd zijn met deze parameter, gebruik maken van de semi-geautomatiseerde versie.
      7. Voer de werkstroom uit (zie deel 7 voor meer informatie).
      8. Aan het begin van de verwerking worden dialoogvensters HK-middelenparameters en op markerbasis achtereenvolgens geopend. Als u dezelfde parameters wilt toepassen voor alle afbeeldingen (volledig geautomatiseerde versie), klikt u op JA. Klik anders op NEE. Er wordt een informatievak geopend met de vraag "Optimal ROIs determine with HK-Means plugin and close image". Klik op OK en breng handmatig de HK-Means plugin aan(Detectie en Tracking| HK-Middelen) op de afbeelding, die automatisch wordt geopend. Selecteer de optie ROI's exporteren in het vak Plug-in-HK-Means. Pas de beste parameters toe om ROI's te hebben die een maximum aan voorgrondpixels bevatten en om de individualisering van objecten op de voorgrond te optimaliseren. Wanneer optimale ROI's worden gevonden, sluit u de afbeelding direct.
      9. Aan het einde van de eerste segmentatiemethode wordt een informatievak geopend en wordt gevraagd om "Ongewenste ROM's verwijderen en afbeelding sluiten". Deze ROI's komen overeen met de randen van de gesegmenteerde objecten. Selecteer OK en verwijder ROI's van verkeerd gesegmenteerde objecten in de afbeelding, die automatisch worden geopend. Een ROI kan eenvoudig worden verwijderd door de cursor op de rand te plaatsen en de knop 'Verwijderen' van het toetsenbord te gebruiken. Sluit de afbeelding. Herhaal dezelfde procedure na voltooiing van de tweede segmentatiestap.
      10. In dit stadium, als de JA-knop is geselecteerd voor de volledige automatisering van het op marker gebaseerde waterscheidingsalgoritme, worden de eerder ingestelde parameters toegepast op alle afbeeldingen.
      11. Als de knop NEE is geselecteerd, wordt een informatievak geopend met de vraag 'Interne markeringen bepalen en aanpassen'. Klik op OK en binnen de ImageJ interface van Icy, ga naar Plugins | MorphoLibJ | Minima en Maxima| Uitgebreide Min & Max. Selecteer Uitgebreide minimain Bewerking .
      12. Selecteer Voorbeeld om vooraf te visualiseren op de automatisch geopende afbeelding het resultaat van de transformatie. Verplaats de dynamiek totdat optimale markeringen worden waargenomen. Markeringen zijn groepen pixels met een waarde van 255 (niet noodzakelijkerwijs witte pixels). Optimale parameters leiden tot één markering per object. Focus op de resterende objecten die niet goed zijn gesegmenteerd met de twee vorige segmentatiemethoden.
      13. Verbeter indien nodig de markeringen door aanvullende morfologische bewerkingen toe te passen zoals "Openen" of "Sluiten" (Plug-ins | MorphoLibJ | Morfologische filters). Houd het uiteindelijke beeld van markeringen open en sluit alle andere afbeeldingen die eindigen met de afbeelding die in eerste instantie wordt gebruikt als invoer voor de uitgebreide Minima-bewerking. Klik op Nee als een vak ImageJ vraagt om wijzigingen op deze afbeelding op te slaan.
      14. Bepaal in het vak Nb van afbeeldingen met informatievak (vak 14) hoeveel afbeeldingen met informatievakken moeten worden weergegeven.
   4. Segmentatie E: Geclusterd cytoplasma
      OPMERKING: Dit blok gebruikt eerder gesegmenteerde kernen als afzonderlijke markeringen om cytoplasmasegmentatie te starten. Zorg ervoor dat het blok van kernen segmentatie is verwerkt voordat u het gebruikt.
      1. In de doos Kanaal cytoplasma (vak 1), stel het kanaal van de cytoplasmatische signaal.
      2. Schrijf in het vak Extensie gesegmenteerde kernen (vak 2) de indeling die wordt gebruikt om afbeeldingen van gesegmenteerde kernen op te slaan (tif, jpeg, bmp, png). De standaardindeling is tif.
      3. Schrijf in het vak Tekst (kader3) de \Naam van de map met gesegmenteerde kernen.
      4. Stel in het vak Opmaak van afbeeldingen van gesegmenteerde cytoplasma 's (vak 4) de indeling in die wordt gebruikt voor het opslaan van gesegmenteerde objectenafbeeldingen (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG).
      5. Tijdens het proces wordt automatisch een map gemaakt om afbeeldingen van gesegmenteerde cytoplasma's op te slaan. Geef in het vak Tekst (kader 5) een naam aan deze map (bijvoorbeeld gesegmenteerde cytoplasma's). De map wordt gemaakt in de map met samengevoegde afbeeldingen.
      6. Volg dezelfde stappen als in stap 5.3.1 om parameters in te stellen van vakken Gaussian filter en Active Contours (Wees voorzichtig, vak rangen zijn niet hetzelfde als in stap 5.3.1).
      7. Voer de werkstroom uit (zie deel 7 voor meer informatie).

6. Fluorescerende signaaldetectie en -analyse

1. Selecteer het aangepaste blok.
   1. In het blok Fluorescentie Analyse A: 1 Kanaal, uit te voeren detectie en analyse van foci in een kanaal binnen een type gesegmenteerd object: detectie van coilin foci (rood kanaal) binnen de kern.
   2. In het blok Fluorescentie Analyse B: 2 Kanalen in hetzelfde compartiment, uit te voeren detectie en analyse van foci in twee kanalen binnen een type gesegmenteerd object: detectie van coilin (rood kanaal) en 53BP1 (groene kanaal) foci binnen de kern.
   3. In het blok Fluorescentie Analyse C: 2 Kanalen in twee compartimenten, uit te voeren detectie en analyse van foci in een of twee kanalen, met name in de kernen en hun overeenkomstige cytoplasma: detectie van Coilin foci (rood kanaal) zowel binnen de kern en de bijbehorende cytoplasma of detectie van Coilin foci (rood kanaal) binnen de kern en G3BP foci (groene kanaal) binnen de overeenkomstige cytoplasma.
   4. In het blok Fluorescentie Analyse D: Global Translocatie, bereken het percentage van het signaal van een kanaal in twee cellulaire compartimenten (a en b). Bijvoorbeeld, in een cytoplasma/ kern translocatie test, export berekende percentages van nucleaire en cytoplasmatische signalen voor elk beeld in de uiteindelijke "Resultaten" spreadsheet. De formule die wordt gebruikt om het kernsignaalpercentage te berekenen, wordt hieronder weergegeven. Dit blok kan worden gebruikt voor elk subcellulair compartiment:
      
   5. In het blok Fluorescentie Analyse E: Individuele celtranslocatie,bereken het percentage van het signaal van een kanaal in twee cellulaire compartimenten voor elke cel. Dit blok is speciaal geoptimaliseerd voor nucleus/cytoplasma translocatietest op het niveau van één cel.
      OPMERKING: Omdat het blok Fluorescentie Analyse E: Individuele celtranslocatie analyses uitvoert op eencellig niveau, is een efficiënte segmentatie van nucleus en cytoplasma nodig.
2. Koppel de output0 (Bestand) van de blokkeermap (blok 1) aan de mapinvoer (witte pijlen in zwarte cirkels) van het gekozen blok.
3. Stel de parameters van het gekozen blok in.
   1. Fluorescentie Analyse A: 1 Kanaal, Fluorescentie Analyse B: 2 Kanalen in hetzelfde compartiment en Fluorescentie Analyse C: 2 Kanalen in twee compartimenten
      1. Schrijf in het vak Map afbeeldingen ROIde naam van de map met afbeeldingen van gesegmenteerde objecten voorafgegaan door een backslash. (Bijvoorbeeld: \Gesegmenteerde kernen).
      2. Schrijf in het vak Opmaak van afbeeldingen van gesegmenteerde objecten (kader 2) de indeling die wordt gebruikt om afbeeldingen van gesegmenteerde objecten op te slaan (tif, jpeg, bmp, png). De standaardindeling is tif.
      3. In het vak Kill Borders?, schrijf Ja om randobjecten te verwijderen. Anders, schrijf Nee. De installatie van de MorphoLibJ-collectie van ImageJ is vereist om deze functie te gebruiken (zie stap 5.3.3).
      4. In het vak(en) Kanaal spots signaal, stel het kanaal waar vlekken moeten worden gedetecteerd. In klassieke RGB-afbeeldingen, 0=Rood, 1=Groen en 2=Blauw.
      5. In de dozen Naam van gelokaliseerde molecuul, schrijf de naam van het molecuul lokaliseren in de vlekken. Het aantal velden dat moet worden ingevoerd, is afhankelijk van het aantal moleculen.
      6. Stel in het vak (es) Wavelet Spot Detector Blockde parameters voor de detectie van de spot voor elk kanaal in. Stel de schaal(en) in (aangeduid met de spotgrootte) en de gevoeligheid van de detectie (een kleinere gevoeligheid vermindert het aantal gedetecteerde vlekken, waarbij de standaardwaarde 100 is en de minimumwaarde 0). Uitgebreide documentatie van deze plugin is online beschikbaar: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. Parameters kunnen ook handmatig worden gedefinieerd in Icy(Detectie en Tracking | Spot Detector).
      7. Als optie filtert u in het vak De ROI van filteren op groottede gesegmenteerde objecten waar vlekken worden gedetecteerd door een interval van grootte in te stellen (in pixels). Deze stap is vooral handig om objecten onder- of oversegmenteerde objecten te verwijderen. Zie stap 5.3.1 als u de grootte van objecten handmatig wilt schatten. Standaardparameters omvatten het filteren van ROI's niet op grootte. Blok 2 Kanalen in twee compartimenten bevat twee dozen: Filterkern op grootte (vak 19) en Filter cytoplasma op grootte (vak 46).
      8. Optioneel, in het vak Filter vlekken op grootte, filter de gedetecteerde plekken op basis van hun grootte (in pixels) om ongewenste artefacten te verwijderen. Als u de spotgrootte handmatig wilt schatten, klikt u op Detectie en bijhouden en opent u de plug-in van de spotdetector. Selecteer in uitvoeropties de optie Exporteren naar ROI. Let erop dat standaardparameters geen filtering van vlekken op grootte omvatten en dat gefilterde vlekken niet in aanmerking worden genomen voor de analyse. Het aantal velden dat u wilt invoeren, is afhankelijk van het aantal kanalen.
      9. Optioneel, in het vak Filter vlekken, breng een extra filter (contrast, homogeniteit, perimeter, rondheid) op de gedetecteerde plekken. Let erop dat standaardparameters geen spotfiltering bevatten en dat gefilterde vlekken niet in aanmerking worden genomen voor de analyse. Het aantal velden dat u wilt invoeren, is afhankelijk van het aantal kanalen.
      10. In de vakken Drempelgrootte instellenin de vakken Drempelgrootte een drempel voor het gebied (in pixels) van geanalyseerde vlekken. Het aantal getelde plekken onder en boven deze drempel wordt geëxporteerd in de uiteindelijke spreadsheet Resultaten. Het aantal te informeren dozen is afhankelijk van het aantal kanalen.
      11. Voer de werkstroom uit (zie deel 7 voor meer informatie). Gegevens worden geëxporteerd in een spreadsheet met resultaten die is opgeslagen in de map met samengevoegde afbeeldingen.
   2. Fluorescentie Analyse D: Global Translocatie en Fluorescentie Analyse E: Individuele celtranslocatie:
      1. Schrijf in de vakken Mapafbeeldingen (vakken 1 en 2) de \Naam van de map met afbeeldingen van gesegmenteerde objecten. In het blok Fluorescentie Analyse D: Global Translocatie, de twee soorten ROI worden geïdentificeerd als ROI a en ROI b. Voor het blok Fluorescentie Analyse E: Individuele celtranslocatie, in Map afbeeldingen gesegmenteerde kernen en Map afbeeldingen gesegmenteerde cytoplasma vakken, schrijf de naam van de map met gesegmenteerde kernen en cytoplasma's, respectievelijk.
      2. Voer in het vak Kanaalsignaal (kader 3) het kanaal van het signaal in.
      3. Schrijf in het vak Opmaak van afbeeldingen van gesegmenteerde objecten (kader 4) de indeling die wordt gebruikt om afbeeldingen van gesegmenteerde objecten op te slaan (tif, jpeg, bmp, png). De standaardindeling is tif. De optie Randen doden is ook beschikbaar om randobjecten te verwijderen (zie stap 6.3.1).
      4. Optioneel filtert u in vakken De ROI op grootte,filtert u de gesegmenteerde objecten door een interval van grootte in te stellen (in pixels). Deze stap kan handig zijn om objecten onder- of oversegmenteerde objecten te verwijderen. Zie stap 5.3.1 om de objectgrootte handmatig te schatten. Er zijn twee velden om in te voeren, één per kanaal. Standaardparameters omvatten geen ROI-filtering op grootte.
      5. Voer de werkstroom uit (zie deel 7 voor meer informatie). Gegevens exporteren in een spreadsheet Resultaten die zijn opgeslagen in de map met samengevoegde afbeeldingen.

7. Het protocol uitvoeren

1. Als u één blok in een run wilt verwerken, verwijdert u de verbinding tussen het geselecteerde blok en de blokkeermap selecteren. Plaats het gezochte blok op de^1e rang. Klik in de linkerbovenhoek van het gezochte blok op de link direct rechts van de map. Dubbelklik in het dialoogvenster Openen dat wordt weergegeven op de map met de samengevoegde afbeeldingen. Klik vervolgens op Openen. Klik op Uitvoeren om de werkstroom te starten. De verwerking kan worden gestopt door op de knop Stoppen te klikken.
2. Als u verschillende blokken in een run wilt verwerken, houdt u verbindingen van gekozen blokken met de blokkeermap selecteren (blok 1). Zorg ervoor dat hun rang de goede verwerking van de werkstroom mogelijk maakt. Als een specifiek blok bijvoorbeeld gesegmenteerde objecten moet verwerken, moet u er zeker van zijn dat het segmentatieblok eerder wordt verwerkt. Voordat u de werkstroom uitvoert, verwijdert u ongebruikte blokken en slaat u het nieuwe protocol op met een andere naam.
3. Klik op Uitvoeren om de werkstroom te starten. Wanneer het geopende dialoogvenster wordt weergegeven, dubbelklikt u op de map met de samengevoegde afbeeldingen. Klik vervolgens op Openen. De werkstroom wordt automatisch uitgevoerd. Stop indien nodig de verwerking door op de knop Stoppen te klikken.
4. Controleer aan het einde van de verwerking of het bericht De uitgevoerde werkstroom is in de rechterbenedenhoek weergegeven en dat alle blokken worden gemarkeerd met een groen bord(figuur 2b). Zo niet, dan geven het blok en het binnenvak met het foutteken het te corrigeren element aan (Figuur 2b).
   OPMERKING: Nadat de werkstroom is uitgevoerd, kan een nieuwe run niet direct worden gestart en om de werkstroom opnieuw te verwerken, moet ten minste één blok worden gemarkeerd met het teken 'klaar om te verwerken'. Als u de status van een blok wilt wijzigen, verwijdert en maakt u opnieuw een koppeling tussen twee vakken in dit blok of sluit en opent u het protocol gewoon. Als er een fout optreedt tijdens de verwerking, kan een nieuwe run direct worden gestart. Tijdens een nieuwe run worden alle blokken van de pijplijn verwerkt, zelfs als sommige worden gemarkeerd met het groene bord.

Representative Results

Alle beschreven analyses zijn uitgevoerd op een standaard laptop (64-bits, quad-core processor op 2,80 GHz met 16 GB random-access memory (RAM)) werken met de 64-bits versie van Java. Random-access geheugen is een belangrijke parameter om rekening mee te houden, afhankelijk van de hoeveelheid en de resolutie van beelden te analyseren. Met behulp van de 32-bits versie van Java beperkt het geheugen tot ongeveer 1300 MB, die ongeschikt zou kunnen zijn voor big data-analyse, terwijl de 64-bits versie maakt het verhogen van het geheugen toegewezen aan Icy. Figuur 3 rapporteert de tijd die nodig is voor segmentatie voor verschillende soorten afbeeldingen en verschillende resoluties. Het bevestigt dat hoge resolutie de tijd van primaire objectsegmentatie aanzienlijk verhoogt.

De gegevens die in de volgende alinea's worden gepresenteerd, tonen aan dat de Substructure Analyzer-workflow kan worden gebruikt om de meeste veelvoorkomende problemen op te lossen die in de cellulaire en moleculaire biologie worden aangetroffen (celtelling, foci-telling en analyse, translocatieanalyse).

Meting in talrijke cellen van het precieze percentage moleculen geconcentreerd in een bepaald compartiment of de verandering van lokalisatie in subcellulaire domeinen kan een zeer omslachtige en foutgevoelige taak zijn, vooral wanneer het handmatig wordt uitgevoerd. Figuur 4 illustreert het vermogen van de workflow om de goed beschreven nucleaire translocatie van de transcriptiefactor NFκB snel en nauwkeurig te kwantificeren in reactie op TNFα-stimulatie. Beelden die voor de analyse werden gebruikt, zijn genadig samengesteld door Ilya Ravkin (http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm) en zijn openbaar beschikbaar op de Broad Bioimage Benchmark Collection¹⁶. Deze set bevat afbeeldingen van MCF7- en A549-cellijnen die zijn behandeld met toenemende concentraties TNFα. De analyse is uitgevoerd op meer dan 40.000 cellen en 96 beelden (48 beelden voor elk kanaal) van de MCF7-cellijn(figuur 4a). De hele analyse (van het importeren van afbeeldingen tot het opslaan van gegevens) duurde 26 minuten. Elke afbeelding komt overeen met een specifieke TNFα-concentratie. De nucleaire/cytoplasmische verhoudingen van NFκB waren homogeen in alle cellen voor een bepaald beeld. Om deze reden werden voor elk beeld de waarden van alle nucleaire of cytoplasmische pixels samengevat om de nucleaire en cytoplasmatische verhoudingen van NFκB te berekenen, en was individualisering van het aanraken van kernen/cytoplasma's tijdens hun segmentatie niet vereist. DAPI-afbeeldingen werden verwerkt in de Segmentatie C: Geclusterde objecten met bolle vormen blokkeren om kernen te segmenteren en het groene kanaal werd gebruikt om de cytoplasma's af te bakenen met het Segmentatie E: Geclusterd cytoplasmablok (Figuur 4b). De Fluorescentie Analyse D: Global Translocatie blok werd gebruikt om de som van nucleaire en cytoplasma pixel waarden te exporteren. De verkregen gegevens worden weergegeven in een dosisresponscurve (figuur 4c) en illustreren de toename van nfκb-kernverhouding na stimulatie met toenemende concentraties TNFα.

De workflow analyseert niet alleen het globale intensiteitssignaal in verschillende subcellulaire compartimenten, maar kan ook worden gebruikt om foci te detecteren en specifieke informatie over hun functies te extraheren. Figuur 5a illustreert de detectie van P-lichamen in individuele cellen door de versterker van mRNA-decapping 4 (EDC4) eiwit te lokaliseren. Het blok Segmentatie A: Niet-geclusterde objecten werd gebruikt om kernen te segmenteren die een laag clusterniveau vertonen, de Segmentatie E: Geclusterd cytoplasmablok om de cytoplasma's en de Fluorescentieanalyse C af te bakenen: 2 kanalen in twee compartimenten om EDC4-foci te detecteren. Gesegmenteerde objecten worden geïdentificeerd (Gesegmenteerde nuclei_0, Gesegmenteerde cytoplasms_0) en er worden meerdere informatie verzameld in het overeenkomstige werkblad (Gesegmenteerde kernen-informatie en gesegmenteerde cytoplasma-informatie) zoals de gemiddelde intensiteit van EDC4 of het aantal/de grootte van gedetecteerde lichamen in elke ROI(figuur 5b). Voordat ze worden geanalyseerd, kunnen gedetecteerde lichamen vooraf worden gefilterd op basis van hun gebied, wat handig kan zijn om objecten onder de resolutiekracht van de microscoop uit te sluiten. Om de grootte van geconserveerde objecten te schatten, kan een extra gebiedsdrempel worden ingevoerd. Gebieden van alle gedetecteerde instanties worden gerapporteerd in speciale werkbladen (Gesegmenteerde nuclei_Distribution foci grootte, Gesegmenteerd cytoplasms_Distribution foci grootte). In dit voorbeeld markeren we de analyse van twee cellen (Gesegmenteerde nuclei_0 and_1 en Gesegmenteerde cytoplasm_0 and_1), waar cytoplasma EDC4 foci worden gedetecteerd. Merk op dat, hoewel het signaal van het EDC4-eiwit wordt gedetecteerd in zowel de nucleaire als cytoplasmische compartimenten, alleen de cytoplasmatische foci overeenkomen met P-lichamen. Het nucleaire signaal is waarschijnlijk het gevolg van de kruisreactiviteit van het antilichaam dat wordt gebruikt om immunofluorescentie-experimenten uit te voeren. De grootte in pixels van elk van de foci wordt gegeven.

Toen het effect van oxidatieve stress (OS) op Cajal Bodies nog onbekend was, maakten we gebruik van de veelzijdigheid van de workflow om het te bestuderen tijdens de tijd kinetiek (2 tot 20 uur na OS inductie met 500 μM H₂O₂) (Figuur 6). Cajal Lichamen zijn dynamische structuren nucleating en oplossen binnen het nucleoplasma onder de controle van specifieke parameters zoals de transcriptie snelheid of celcyclus progressie. Cajal Bodies werden gevisualiseerd door het lokaliseren van hun belangrijkste structurele en functionele component, de coilin eiwit. Informatie over het aantal en de grootte van Cajal lichamen werden verzameld door het bestuderen van 2300 individuele cellen uit hoge resolutie beelden (3840X3072) met 3 kanalen: DAPI (blauw), 53BP1 (groen) en coilin (rood) (Figuur 6a). Volledige verwerking duurde minder dan 1 uur. Omdat kernen bolle vorm gepresenteerd en sommige van hen werden geclusterd, het blok Segmentatie C: Geclusterde objecten met bolle vormen werd gekozen om de segmentatie uit te voeren. Aangezien OS bekend staat om DNA double-streng breaks (DDSB's) te induceren, werd het p53-bindende eiwit 1 (53BP1), bekend als een essentiële effector van DNA-schadesignaleringstrajecten, gebruikt als marker om onderscheid te maken tussen gestreste en niet-gestreste cellen. Bij afwezigheid van DNA-schade wordt 53BP1 namelijk homogeen verdeeld binnen het nucleoplasma, terwijl het zich na DNA-schade concentreert op DDSB's, die gemakkelijk te onderscheiden foci vormen in microscopie. Het aantal en de grootte van zowel 53BP1 en coilin nucleaire foci in elke cel werden geanalyseerd met behulp van het blok Fluorescentie Analyse B: 2 Kanalen in hetzelfde compartiment. Ten eerste heeft de analyse van 53BP1-gegevens geholpen om voor elk tijdspunt van de kinetiek de beste drempel te bepalen om cellen te classificeren op basis van hun stressstatus. Onder de hele kinetiek, OS induceert een aanzienlijke toename van de 53BP1 foci nummer met een 11-voudige toename op 2, 4, en 8 uur na de inductie van OS (Figuur S1). Dit effect is minder uitgesproken bij 6 uur (6,5 keer) vanwege een hoger initieel niveau van DSB in niet-gestreste cellen. Zelfs na 20 uur blijft er een aanhoudende stijging over (bijna 6 keer). Deze gegevens weerspiegelen de efficiëntie van de behandeling om het os te induceren en 53BP1 vast te stellen als een efficiënte stress-marker voor zowel vroege als late waarnemingen in microscopie. Aan de andere kant werd een klein deel van de gestreste cellen met een laag niveau van DDSB's waargenomen op elk moment van de kinetiek, wat suggereert dat cellen niet homogeen worden benadrukt, waardoor het belang van het gebruik van een stressmarker in stress-experimenten wordt afgedwongen. Op basis van de ROC-analyse werd een algemene drempel van 17 53BP1 foci geselecteerd om onderscheid te maken tussen gestreste en niet-gesttresste cellen in de kinetiek(figuur S1).

Vervolgens werden het aantal en de grootte van nucleaire foci van coilin geanalyseerd op basis van de stressstatus van de cel. Een aanzienlijke toename van het aantal foci werd waargenomen 2, 4 en 6 uur na stress-inductie (figuur 6b). Het meest aanhoudende effect wordt waargenomen bij 2 uur, het aantal cellen met meer dan 10 foci stijgt van 0% in de niet-gesttresste cellen tot 75% in de gestreste cellen. Bovendien had meer dan 25% van de gestreste cellen van dat tijdpunt meer dan 20 coilin foci. Dit effect neemt geleidelijk af tot 8 uur. Bij 20 uur wordt een kleine toename van de eerste en de derde kwartiel waargenomen, maar gegevens tonen ook aan dat 84% en 80% van de cellen minder dan 8 foci aanwezig zijn in respectievelijk niet-gestreste en gestreste cellen. Deze gegevens tonen aan dat OS heeft ook late effecten op parameters die de nucleatie van Cajal Bodies, die kunnen afwijken van vroege effecten. Interessant is dat een zorgvuldige analyse van de kenmerken van de coilin nucleaire foci bleek dat de waargenomen toename van het aantal coilin foci geassocieerd met een afname van hun grootte (Figuur 6c). Bijvoorbeeld, 2 uur na OS inductie, het aandeel van coilin foci met een gebied onder 0,2 μm² stijgt van 26% tot 64%. Dit effect neemt af tot 8 uur, maar, in tegenstelling tot het aantal van Cajal Bodies, wordt er geen significante verandering waargenomen bij 20 uur. Dit kan weerspiegelen dat vroege en late nucleoplasmische herverdeling van Cajal Bodies verschillende gebeurtenissen zijn.

Totaal stellen deze gegevens sterk voor dat OS de nucleatiemacht van Organen Cajal verandert, die een nucleoplasmische herverdeling in talrijke kleinere kernfoci teweegbrengt. Aangezien nucleatie van Cajal Bodies wordt aangedreven door hun eiwit- en RNA-componenten, suggereert dit dat het OS-effect de samenstelling van Cajal Bodies kan veranderen. Binnen Cajal Bodies werkt het coilin eiwit samen met verschillende eiwitpartners, zoals componenten van het SMN-complex en Sm-eiwitten. Deze interacties vaak betrokken fosfodomeinen van coilin, en men kan zich voorstellen dat een wijziging van de structuur van Cajal Organen kan worden gekoppeld aan veranderingen in de fosforylatie status van coilin. Bovendien hebben recente werken aangetoond dat Cajal-lichamen niet willekeurig gelokaliseerd zijn binnen de kern en de genexpressie kunnen beïnvloeden door middel van proximale associatie met specifieke gen loci¹⁷. Gezien al deze feiten zou het niet verwonderlijk zijn als een effect op de functionaliteit van Cajal-organen gepaard zou gaan met veranderingen in hun structuur. Uit deze resultaten kunnen we ook vragen of de verbouwing van dergelijke Cajal Bodies een passief gevolg is van OS of deelneemt aan de respons door bijvoorbeeld te interageren met specifieke gen loci.

Om te testen of een verandering in coilin expressie de lokalisatie kan veranderen en de nucleatie van Cajal Bodies zou kunnen veranderen, hebben we een exogene GFP-coilin fusion eiwit overuitgedrukt. Kernen zijn niet geclusterd, dus segmentatie werd uitgevoerd met de bloksegmentatie A: Niet-geclusterde objecten. Dan, om precies te kwantificeren het aantal en de grootte van de coilin foci (rood signaal, kanaal 1) volgens het niveau van GFP-coilin (groen signaal, kanaal 2) overexpressie, het blok Fluorescentie Analyse B: 2 Kanalen in hetzelfde compartiment werd gebruikt. Het niveau van GFP-coilin werd weerspiegeld door de gemiddelde intensiteit van het GFP-signaal in de afzonderlijke kern (figuur 7a). In cellen met een gemiddeld of hoog niveau van GFP-coilin overexpressie (GFP-intensiteit hoger dan 10), neemt het aantal Cajal-lichamen per kern aanzienlijk toe met sommige kernen die tot 21 foci(figuur 7b)weergeven. We hebben ook gemerkt dat de helderheid (gemiddelde intensiteit) van Cajal Bodies aanzienlijk toeneemt parallel met het overexpressieniveau dat leidt tot intensiteitsverzadiging. Dergelijke verzadigde gebieden kunnen dus de aanwezigheid van kleinere en zwakkere foci maskeren. In cellen die een gemiddeld of hoog niveau van GFP-coilin overspuiten, neemt ook de grootte van Cajal Bodies aanzienlijk toe, de mediaanwaarden stijgen van 1 naar 2 μm² (figuur 7c). Bovendien is meer dan 25% van de cellen met een hoog GFP-coilin expressieniveau aanwezig foci met een gebied groter dan 2,5 μm², terwijl het nooit meer dan 0,8 μm² in niet-transfected cellen bedraagt. Tot slot, GFP-Coilin overexpressie leidt tot een aanzienlijke toename van zowel het aantal en de grootte van Cajal Bodies. Aangezien OS het aantal Cajal Bodies verhoogt, maar hun grootte vermindert, kunnen deze gegevens weerspiegelen dat os-effect op de structuur van Cajal Bodies waarschijnlijk wordt veroorzaakt door een verandering van hun samenstelling in plaats van door een effect op de cellulaire hoeveelheid coilin.

Figuur 1: De substructuur analyzer-pijplijn
De workflow is ontwikkeld in Icy, een open community platform voor bioimage informatica, en voert automatische analyse uit van meerdere fluorescentiemicroscopiebeelden. Ten eerste worden multi-channel beelden automatisch geladen binnen het protocol en vooraf verwerkt om, indien nodig, de signaal-ruisverhouding te verbeteren en beeldvormingsartefacten te verwijderen. Vervolgens isoleert beeldsegmentatie regio's van belang (ROI's) vanaf de achtergrond. Afhankelijk van het clusteringniveau en de aard van de objecten van belang zijn er verschillende segmentatiemethoden beschikbaar. Gesegmenteerde objecten worden opgeslagen met een specifieke beschrijving (bijvoorbeeld Image name_Nucleus_1) in een specifieke map en kunnen worden gebruikt/opnieuw worden gebruikt voor latere analyse. Fluorescerende signalen zoals vlekken worden vervolgens geanalyseerd binnen de ROI's en meerdere functies (locatie, grootte, vorm, intensiteit, textuur, spotnummer en grootte) worden geëxporteerd naar een automatisch gemaakte spreadsheet. Alle gemeten functies, zoals het aantal gedetecteerde plekken, worden gerapporteerd aan de beschrijving van de bijbehorende ROI. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Grafische interface van de ijzige werkstroom
(a) De werkstroom bestaat uit 13 algemene blokken, die kunnen worden gegroepeerd op basis van hun algemene functie: Selecteer Map (blok 1) toegang tot afbeeldingen mogelijk te maken; Kanalen samenvoegen (blok 2) wordt gebruikt om verschillende kanalen van afbeeldingen samen te voegen. De blokken 3 tot en met 8 zijn gewijd aan objectsegmentatie, waarbij elk wordt aangepast voor een specifieke context: Segmentatie A: Niet-geclusterde objecten, Segmentatie B: Slecht geclusterde objecten, Segmentatie C: Geclusterde objecten met bolle vormen, Segmentatie D: Geclusterde objecten met onregelmatige vormen (blok 7, werkt in samenwerking met blok 6), Segmentatie E: Geclusterde cytoplasma's. Blokken 9 tot 11 worden gebruikt om foci te tellen/analyseren in subcellulaire compartimenten: Fluorescentieanalyse A: 1 Kanaal, Fluorescentieanalyse B: 2 Kanalen in hetzelfde compartiment en FluorescentieAnalyse C: 2 Kanalen in twee compartimenten. De blokken 12 en 13 zijn aangepast voor de analyse van translocatiegebeurtenissen: Fluorescentieanalyse D: Global Translocatie en FluorescentieAnalyse E: Individuele celtranslocatie. bb) Wereldwijde presentatie van een blokarchitectuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Tijd die nodig is voor segmentatie als functie van beeldresolutie en objectclusteringsniveau
(a)Grafische illustratie van de tijd die nodig is om segmentatie uit te voeren, afhankelijk van de beeldresolutie en het clusteringniveau. Er zijn twee verschillende segmentatieblokken getest: Segmentatie A (voor niet-geclusterde objecten) en Segmentatie D (voor geclusterde objecten met onregelmatige vormen). De tijd van verwerking (in seconden per afbeelding) wordt uitgezet als een functie van de beeldresolutie (aantal pixels). (b) Voorbeeld van afbeeldingen geanalyseerd met segmentatie A of Segmentatie D blok. DAPI kleuring en gesegmenteerde kernen zijn aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Workflow-analyse van een NFκB-kerntranslocatietest in reactie op TNFα-stimulatie
(a) Voorbeeld van afbeeldingen van menselijke MCF7-cellen (human breast adenocarcinoma cell line) behandeld met TNFα uit de BBBC014-afbeeldingsset (Broad Bioimage Benchmark Collection)¹². Lokalisatie van de transcriptiefactor NFκB is onderzocht in cellen die zijn behandeld met 12 toenemende concentraties TNFα (van 0 tot 10^-7g/mL). Voor elke concentratie werden 4 replica's gedaan. DAPI-afbeeldingen (blauw kanaal) werden verwerkt in de Segmentatie C: Geclusterde objecten met bolle vormen blokkeren tot segmentkernen, waarna NFκB-kleuring met FITC (groen kanaal) werd gebruikt om de cytoplasma's af te bakenen met het Segmentatie E: Geclusterd cytoplasmablok. De Fluorescentie Analyse D: Global Translocatie blok werd gebruikt om de som van nucleaire en cytoplasma pixel waarden te exporteren. b) Gesegmenteerde kernen (grijs) en cytoplasma (wit) worden gebruikt om de totale intensiteit van het Tl-signaal NFκB in elk compartiment te bepalen. c) De dosisresponscurve uit data-analyse illustreert de toename van het kernaandeel van NFκB naarmate de concentratie van TNFα toeneemt. Afbeeldingen hebben een 8-bits BMP-formaat en de afbeeldingsgrootte is 1360 x 1024 pixels. Voor elke concentratie wordt de standaarddeviatie tussen de 4 replica's berekend en geïllustreerd als foutbalken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Kwantificering van EDC4 foci (P-organen) binnen het cytoplasma in individuele cellen
aa) Co-kleuring met DAPI (blauw kanaal) en Phalloidin (rood kanaal) maakt de segmentatie en identificatie van respectievelijk celkernen en F-actin mogelijk. Het EDC4 eiwit (groene kanaal) wordt gebruikt als een marker voor de detectie van P-lichamen waarvan bekend is dat ze uitsluitend cytoplasmatisch zijn. Schaalbalk, 10 μm. (b) Foci worden geteld en verschillende functies (hier hun gebied in pixels) worden geëxporteerd naar de spreadsheet Resultaten die in verschillende bladen is gestructureerd. Twee vellen zijn gewijd aan de analyse van kernen en twee aan de analyse van cytoplasma's. Elke ruwe integreert de informatie van een specifieke ROI. In Nucleus/Cytoplasma-informatiebladen worden de kenmerken van gesegmenteerde objecten geëxporteerd (ROI ID, grootte en gemiddelde intensiteit), gevolgd door het aantal gedetecteerde foci binnen elke ROI. Indien nodig kan een groottedrempel (100 pixels in dit voorbeeld) worden toegevoegd en wordt het aantal foci onder en boven deze drempelwaarde gerapporteerd in de twee laatste kolommen. In Nucleus/Cytoplasm_Distribution van foci-groottebladen wordt het gebied (in pixels) van alle gedetecteerde foci gerapporteerd in de ruwe van de overeenkomstige ROI. In dit voorbeeld wijzen we op de analyse van twee cellen (Gesegmenteerd cytoplasm_0 and_1), waarbij cytoplasma EDC4-foci zijn gedetecteerd. De grootte in pixels van elk van de foci wordt ook gegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Kinetiek van coilin en 53BP1 nucleoplasmische verdeling na oxidatieve stress
De analyse van het aantal en de grootte van foci was gebaseerd op meer dan 110 individuele cellen voor elk keer punt van 3 onafhankelijke kinetiek. aa) Immunofluorescentiedetectie van coilin en 53BP1 foci in HeLa S3-cellen gedurende de behandeling van kinetiek met 500 μM H₂O₂. 53BP1 concentreert zich op DNA Double-Strand Break sites en wordt gebruikt om de efficiëntie van de behandeling op elke cel te beoordelen. Coilin is verrijkt in Cajal Bodies. Cellen werden vastgesteld 2, 4, 6, 8 en 20 uur na oxidatieve stress-inductie en co-gekleurd met anti-coilin (rood kanaal) en anti-53BP1 (groene kanaal) antilichamen. Schaalbalk, 10 μm. (b) Het aantal coilin nuclear foci na oxidatieve stress. De resultaten worden weergegeven als boxplots, waarbij het centrale teken de mediaan is, de onderste en bovenste randen van de doos de^25e en 75e percentielen zijn.^th In cellen behandeld met H₂O₂wordt een aanzienlijke toename van het aantal coilin foci gedetecteerd en is het maximaal na 2 en 4 uur behandeling. Wilcoxon - Mann Whitney testanalyse toont een significant verschil aan tussen onbehandelde en H₂O₂ behandelde cellen (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). c) Het aandeel cellen in functie van het coilin foci-gebied (μm²). De meeste foci hebben een kleiner gebied op 2 uur en 4 uur tijdpunten in vergelijking met de controle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Studie van de nucleatie van Cajal Bodies in cellen die een GFP-coilin fusion eiwit overexpressie uitdrukten
a) HeLa S3-cellen werden tijdelijk doorsneed in biologische drieledige cellen met 500 ng van een plasmide die een GFP-Coilin-fusieeiwit uitdrukte volgens een standaardprocedure volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Na 48 uur werden cellen gefixeerd en bevlekt met een antilichaam tegen coilin. DAPI (blue channel) maakt het mogelijk om kernen te segmenteren. Voor deze analyses werden meer dan 100 cellen geanalyseerd. GFP signaal weerspiegelt ectopische coilin-GFP eiwit (groene kanaal) lokalisatie, terwijl de coilin signaal (rood kanaal) komt overeen met zowel endogene en exogene eiwit lokalisatie. Voor elke kern weerspiegelt de gemiddelde intensiteit van het GFP-signaal het niveau van coilin-expressie. Volgens deze parameter, de kenmerken van Coilin foci zijn geanalyseerd met behulp van het blok Fluorescentie Analyse B: 2 Kanalen in hetzelfde compartiment. Schaalbalk, 10 μm. (b) Relatie tussen het aantal coilin foci en gemiddelde GFP-intensiteit per kern. De resultaten worden weergegeven als box plots, waarbij het centrale teken de mediaan is, de onderste en bovenste rand van het vak de^25e en 75e percentielen zijn.^th Wilcoxon - Mann Whitney test analyse toont een aanzienlijke toename van het aantal foci voor een GFP intensiteit >10 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). c) Verhouding tussen het gebied van coilin foci en gemiddelde GFP-intensiteit per kern. De resultaten worden weergegeven als box plots, waarbij het centrale teken de mediaan is, de onderste en bovenste rand van het vak de^25e en 75e percentielen zijn.^th Wilcoxon - Mann Whitney test analyse toont een aanzienlijke toename van het gebied van coilin foci voor een GFP intensiteit >10 (*, p<0,05; **, p<0.01; ***, p<0.001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur S1: Kinetiek van 53BP1 nucleoplasmische verdeling na oxidatieve stress
aa) Kwantificering van 53BP1 kernfoci in onbehandelde of H₂O₂ behandelde cellen na verschillende incubatietijden. De resultaten worden weergegeven als box plots, waarbij het centrale teken de mediaan is, de onderste en bovenste rand van het vak de^25e en 75e percentielen zijn.^th Wilcoxon - Mann Whitney testanalyse toont een significant verschil aan tussen onbehandelde en H₂O₂ behandelde cellen (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). b) Voor elk tijdstip van de kinetiek is een ROC-curve (Receiver Operating Characteristic) vastgesteld om de beste drempel te bepalen om onderscheid te maken tussen gestreste en niet-gesttresste cellen. De parameters van elke test worden gerapporteerd in de tabel (Sensitivity, specificiteit, TP: echt positief, TN: true negative, FP: false positive, FN: false negative). Uit deze gegevens werd een globale drempel van 17 53BP1 foci vastgesteld om gestrest van niet-gestreste cellen te discrimineren via de kinetiek. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Een toenemend aantal vrije software tools zijn beschikbaar voor de analyse van fluorescentie celbeelden. Gebruikers moeten correct kiezen voor de adequate software op basis van de complexiteit van hun problematische, om hun kennis in beeldverwerking, en de tijd die ze willen doorbrengen in hun analyse. Icy, CellProfiler of ImageJ/Fiji zijn krachtige tools die zowel bruikbaarheid als functionaliteit^{combineren 3.} Icy is een stand-alone tool die een duidelijke grafische gebruikersinterface (GUI) presenteert, en met name de "Protocollen" point and click interface waarmee workflows gemakkelijk kunnen worden ontworpen of gemanipuleerd⁴. De functionaliteit van deze software wordt verbeterd door het ondersteunen en gebruiken van ImageJ plug-ins, en veel documentatie is beschikbaar dankzij de grote gemeenschap van gebruikers. We gebruikten deze sterke combinatie van bruikbaarheid en functionaliteit van de Icy software om de Substructure Analyzer workflow te ontwikkelen. Het belangrijkste doel is om een geautomatiseerde oplossing voor te stellen om een volledige analyse van cel fluorescerend signaal uit meerdere beelden uit te voeren. De analyse omvat beeldvoorbewerking, objectsegmentatie en fluorescerende signaalanalyse.

Verschillende protocollen worden dankbaar gedeeld op de Icy website en stellen voor om Icy functionaliteiten te gebruiken om fluorescerende signalen zoals cellulaire foci te detecteren en te analyseren. Sommige van deze protocollen verwerken echter slechts één afbeelding per run, exporteren de resultaten niet in een specifiek bestand of analyseren geen enkel kanaal. Anderen bevatten geen voorlopige segmentatie om interessegebieden (ROI's) te bepalen of eenvoudige algoritmen voor te stellen, zoals "HK-middelen" die niet geschikt zijn voor de segmentatie van sterk geclusterde objecten. Substructuur Analyzer automatiseert alle stappen van de beeldanalyse van beeldvoorverwerking tot de segmentatie van objecten en de detectie/analyse van tl-signalen. Het protocol stelt ook eenvoudige of complexere methoden voor objectsegmentatie en export van de gegevens (namen van de gesegmenteerde objecten, foci-analyse) wordt gerealiseerd in geoptimaliseerde uitgangen aangepast aan het problematische. CellProfiler stelt ook krachtige pijpleidingen voor die bestaan uit modules die functionaliteiten^18,19inkapselen . De beschikbare pijpleidingen zijn goed aangepast aan specifieke problemen. Ijzige workflows zijn een netwerk van verschillende vakken, die elk een specifieke taak uitvoeren. Via de interface "Protocollen" zijn dozen die het netwerk samenstellen intuïtief en gemakkelijk te manipuleren. Substructuur Analyzer is aangepast aan verschillende contexten, zoals het eenvoudig samenvoegen van kanalen, de kwantificering van fluorescerende signalen verdeling tussen twee subcellulaire compartimenten, de analyse van foci in een of meerdere kanalen van een of twee cellulaire compartimenten in individuele cellen. Met verschillende beeldschermen kunnen de tussenliggende resultaten tijdens elke run worden gevisualiseerd om de verwerking te controleren. Bovendien presenteert Icy pictogrambalken die de methoden groeperen op onderwerp en van waaruit functionaliteiten in de workflow afzonderlijk kunnen worden gemanipuleerd om specifieke parameters op sommige afbeeldingen handmatig te testen voordat u ze op een hele afbeeldingsset gebruikt.

Net als in het gebied bioimage-analyse is de meest kritieke stap van dit protocol de objectsegmentatie. Het protocol stelt de segmentatie voor van primaire objecten, die meestal celkernen zijn, en bevat ook een ander blok dat een tweede type objecten in de cel moet segmenteren. Nuclei segmentatie kan moeilijk zijn wanneer de objecten zijn sterk geclusterd, zodat ze elkaar raken of overlappen. Verschillende alternatieven voor de segmentatie van primaire objecten zijn opgenomen in het protocol, afhankelijk van de vorm van de objecten en het niveau van clustering, zelfs als tot op heden geen universeel algoritme succes in de volledige segmentatie van sterk geclusterde objecten. Het segmentatieproces wordt voornamelijk beperkt door de bepaling van de juiste parameters die een deel van de objecten succesvol kunnen segmenteren, maar leiden tot onder- of oversegmentatie van een ander onderdeel. De gebruiker zou verschillende runs met verschillende parameters moeten uitvoeren om een definitieve correcte segmentatie te krijgen, vooral voor geclusterde objecten die heterogene en niet-bolle vormen presenteren.

Dit protocol wordt meestal beperkt door de segmentatiestap, die zeer tijdrovend kan zijn en krachtige computerconfiguratie nodig heeft voor de meest complexe gevallen. Meer specifiek, hoe talrijker of complexer de afbeeldingen zijn (geclusterde objecten om te segmenteren, een groot aantal pixels in de afbeeldingen), hoe meer willekeurig toegangsgeheugen (RAM) de gebruiker nodig heeft. Wereldwijd, voor een problematisch, zal de gebruiker het protocol op een 64 bits Java Runtime Environment (vrij beschikbaar op Java-website) moeten uitvoeren en een 64 bits besturingssysteem (OS) moeten gebruiken om het beschikbare geheugen te verhogen dat door Icy wordt gebruikt (het geheugen is beperkt tot 1300 MB voor 32 bits JRE). Vanwege het script werkt het protocol niet correct op een Mac-computer. Bovendien neemt het aantal parameters toe met de complexiteit van het probleem en vereist het meer kennis in beeldanalyse. Wat de functionaliteitscriteria betreft, is dit protocol nog niet aangepast voor de analyse van gestapelde afbeeldingen (tijdstacks, z-stacks) zelfs als Icy efficiënt analyses uitvoert op dit soort gegevens.

Toekomstige updates zullen worden gerealiseerd, met name om de segmentatie van complexe geclusterde objecten te verbeteren. Extra blokken zullen worden ontwikkeld om de segmentatie aan te passen aan geclusterde cellulaire structuren met onregelmatige niet-bolle vormen. We zullen ook de workflow aanpassen voor de analyse van tijd en z-stacks (voor live imaging en 3D-gegevens).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free	Thermo Fisher Scientific	28908	to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-11008	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21425	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A34055	fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA)	euromedex	04-100-812-E
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796-500ml	cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040-5ML	mounting medium
Human: HeLa S3 cells	IGBMC, Strasbourg, France		cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)	Sigma-Aldrich	H1009-100ml	used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668-019	transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin	abcam	ab11822	Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope	Nikon		epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	transfection medium
PBS pH 7.4 (10x)	gibco	70011-036	to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1	Thermo Fisher Scientific	PA1-16565	53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4	Sigma-Aldrich	SAB4200114	EDC4-specific antibody
Triton X-100	Roth	6683	to permeabilize the cells