Bioengineering

サブ構造アナライザー:蛍光顕微鏡画像における細胞体の迅速な探査と正確な分析のためのユーザフレンドリーなワークフロー

Published: July 15, 2020 doi: 10.3791/60990

Géraud Heckler¹, Christelle Aigueperse¹, Liza Hettal¹, Quentin Thuillier¹, Fabrice de Chaumont², Stéphane Dallongeville², Isabelle Behm-Ansmant¹

¹Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, ²Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

Summary

蛍光顕微鏡画像で特定の細胞区画内の細胞体を迅速に探査し、正確に分析するために構築された自由に利用可能なワークフローを提示します。このユーザーフレンドリーなワークフローはオープンソースソフトウェアのIcy上で設計され、また、ImageJの機能を使用しています。パイプラインは、画像解析に関する知識なしに手頃な価格です。

Abstract

過去10年間は、空間分解能の向上だけでなく、ライブセルイメージングおよびハイスループット顕微鏡技術においても示された蛍光顕微鏡技術のブレークスルーによって特徴付けられています。これにより、1回の実験での顕微鏡データの量と複雑さが一定に増加しました。顕微鏡データの手動分析は非常に時間がかかり、主観的で、定量的な分析が禁止されているため、バイオイメージ解析の自動化はほとんどやむを得なくなっています。蛍光顕微鏡によるバイオイメージのシグナル解析を完全に自動化するサブストラクチャアナライザと呼ばれる情報学ワークフローを構築しました。このワークフローは、ユーザーフレンドリーなオープンソースプラットフォームIcy上で開発され、ImageJの機能によって完了されます。信号対雑音比を改善するための画像の前処理、細胞の個別のセグメンテーション(細胞境界の検出)、特定の細胞コンパートメントに富んだ細胞体の検出/定量化が含まれます。このワークフローの主な利点は、ユーザーフレンドリーなインターフェースを介して、画像解析の専門知識を持たないユーザーに複雑なバイオイメージング機能を提案することです。さらに、それは非常にモジュール化され、異なる細胞のサブ構造の異なる細胞体の比較分析に核/細胞質転位の特徴付けからいくつかの問題に適応する。このワークフローの機能は酸化ストレス(OS)条件下でのカハル(コイル状)体の研究を通して示される。蛍光顕微鏡のデータは、ヒト細胞におけるその完全性がOSの誘導の数時間後に影響を受けることを示している。この効果は、コイリンの核分裂が特徴カジャール体に減少し、小さな病巣の増加にコイリンの核内再分配に関連することを特徴とする。CB成分と周囲核内核形成との交換におけるコイリンの中心的な役割は、OSによるコイリンの再分配がカハル体の組成および機能に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。

Introduction

光顕微鏡、そしてより具体的には、蛍光顕微鏡は、生物科学で一般的に使用される堅牢で汎用性の高い技術です。タンパク質やRNAなどの様々な生体分子の特異的蛍光標識を通じて、正確に局在化できます。過去10年間は、超解決蛍光顕微鏡(SRFM)^の開発のためにエリック・ベッツィヒ、ステファン・W・ヘル、ウィリアム・E・モアナーを受賞した2014年のノーベル化学賞によって証明された顕微鏡および画像技術の急速な進歩によって特徴付けられています。SFRMは、従来の光学顕微鏡の回折限界をバイパスしてナノ次元に持ち込みます。ライブイメージングやハイスループットスクリーニングアプローチなどの技術の改善は、各実験で扱うデータの量と複雑度も増加します。ほとんどの場合、研究者は細胞の高い不均一な集団に直面しており、単一細胞レベルでの発現型の分析を望んでいます。

当初、病巣計数などの分析は目で行われ、カウントプロセスを完全に視覚的に制御できるため、一部の研究者が好む。しかし、このようなデータの手動分析は時間がかかりすぎて、観察者間の変動を招き、より複雑な機能にアクセスすることは不可能であり、コンピュータ支援アプローチが広く使用されるようになり、ほとんどやむを得ない^2。バイオイメージ情報学的手法は、データ分析の効率を大幅に向上させ、手動計数解析の不可避的なオペレータの主観性と潜在的バイアスを含まない。この分野での需要の増加とコンピュータのパワーの向上は、多数の画像解析プラットフォームの開発につながりました。一部は自由に利用でき、パーソナルコンピュータで分析を行うための様々なツールにアクセスできます。オープンアクセスツールの分類は最近確立されています³そして、使いやすさと機能を組み合わせた強力なソフトウェアとしてIcy⁴を提示.さらに、アイシーはImageJと通信する利点があります。

サブ構造アナライザーパイプラインは図 1に示されています。まず、指定されたフォルダに含まれるすべての画像が事前処理され、信号とノイズの比率が向上します。この手順により、次の手順の効率が向上し、実行時間が短縮されます。次に、蛍光シグナルが検出されるべき画像領域に対応する対象領域(ROI)を特定し、セグメント化する。最後に蛍光シグナルを分析し、その結果をタブ区切りのワークシートにエクスポートします。

オブジェクトのセグメンテーション(境界の検出)は、画像解析の中で最も困難なステップであり、その効率によって得られる細胞測定の精度が決まります。画像内で最初に同定された物体(主体物体と呼ばれる)は、しばしばDNA染色画像(DAPIまたはHoechst染色)からの核であるが、主な物体は細胞全体、ビーズ、斑点、腫瘍、または染色された物体である可能性もある。ほとんどの生物学的画像では、細胞または核が互いに接触したり、重なり合ったりして、単純で速いアルゴリズムが失敗します。現在までに、ユニバーサルアルゴリズムは、すべてのオブジェクトの完全なセグメンテーションを実行することはできません。⁵一般的に顕微鏡ソフトウェア(分子デバイス⁶によるMetaMorphイメージングソフトウェア、ニコン⁷によるNIS-Elements Advances Researchソフトウェアなど)で配布されるセグメンテーションツールは、一般的に相関マッチング、閾値、形態演算などの標準的な手法に基づいています。基本的なシステムでは効率的ですが、これらの一般化された方法は、より困難で特定のコンテキストで使用すると、急速に限界を提示します。実際、セグメンテーションは、細胞タイプ、細胞密度、バイオマーカーなどの実験パラメータに対して高感度であり、大きなデータセットに対して繰り返し調整を必要とする場合が多い。Substructure Analyzerワークフローは、シンプルで洗練されたアルゴリズムの両方を統合し、画像の複雑さとユーザーのニーズに合わせたさまざまな選択肢を提案します。特に、高度にクラスター化されたオブジェクトに対するマーカーベースの流域アルゴリズム⁸を提案しています。このセグメンテーション方法の効率は、各オブジェクトの個々のマーカーの選択に依存します。これらのマーカーは、ほとんどの場合、ユーザーが多数のオブジェクトに直面する場合に非常に時間がかかる、完全なセグメンテーションのための正しいパラメータを取得するために手動で選択されます。サブストラクチャアナライザは、これらのマーカーの自動検出を提案し、高効率のセグメンテーションプロセスを提供します。セグメンテーションは、ほとんどの場合、画像解析の制限ステップであり、画像の解像度、画像あたりのオブジェクト数、およびオブジェクトのクラスタリングのレベルに応じて処理時間を大幅に変更できます。標準的なパイプラインでは、標準のデスクトップコンピューターでイメージあたり数秒から 5 分を必要とします。より複雑な画像の解析には、より強力なコンピュータと画像解析の基本的な知識が必要になる場合があります。

このワークフローの柔軟性と機能性は、代表的な結果にさまざまな例を示しています。このワークフローの利点は、酸化ストレス(OS)条件下での核下構造の研究を通じて顕著に表示されます。OSは酸化剤を支持する酸化還元恒常性の不均衡に対応し、高レベルの活性酸素種(ROS)に関連付けられている。ROSはシグナル伝達分子として作用するので、それらの濃度および細胞内局在の変化は、シグナル伝達、修復機構、遺伝子発現、細胞死、増殖を含む生理機能を調節する無数の経路およびネットワークにプラスまたは負の影響を及⁹^,^ぼす。OSは、様々な病理(神経変性、心血管疾患、癌、糖尿病など)に直接関与するが、細胞老化にも関与している。したがって、ヒト細胞の組織と機能に及ぼすOSの結果を解読することは、ヒト病理の発症および発達におけるOSの役割を理解する上で重要なステップとなる。OSは、いくつかの転写因子(p53、Nrf2、FOXO3A)11を介して転写を調節することによって遺伝子発現を調節することが確立されている¹¹が、また^{、RNA12、13、14}^,¹³^,¹⁴の代替スプライシング(AS)などのいくつかの共転写および転写後プロセスの調節に影響を与えることによっても確立されている。一次符号化および非コード転写物の代替スプライシングは、トランスクリプトアイソフォームを産生することによってゲノムのコード容量を増加させる不可欠なメカニズムである。ASは、スプライセオソームと呼ばれる巨大なリボヌクレオタンパク質複合体によって行われ、ほぼ300個のタンパク質および5つのUリッチ¹⁵な小型核RNA(UsnRNA)15を含む。スプライセオソームアセンブリとASは細胞内で厳しく制御されており、スプライセサム成熟のいくつかのステップは、カハルボディと名付けられた膜のない核コンパートメント内で起こる。これらの核下構造は、その構造の動的性質とそれらの組成によって特徴付けられるもので、主にそれらのRNAとタンパク質成分とコイリンタンパク質との多価相互作用によって行われる。Substructure Analyzerワークフローを使用して何千ものセルを分析すると、CAJALボディに対するOSの影響を説明したことがないという特徴付けが可能になりました。実際、得られたデータは、OSがカハル体の核形成を変え、コイリンタンパク質の核内再分配を多数の小さな核病巣に誘導することを示唆している。カハルボディの構造のこのような変化は、スプライセソームの成熟に影響を与え、OSによるAS変調に参加する可能性があります。

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Protocol

注:ユーザーフレンドリーなチュートリアルは、Icyのウェブサイトhttp://icy.bioimageanalysis.orgで入手できます。

1. 氷とサブ構造アナライザプロトコルをダウンロード

Icy の Web サイト (http://icy.bioimageanalysis.org/download)から Icy をダウンロードし、サブ構造アナライザープロトコルhttp://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latestをダウンロードします。
注: 64 ビット OS を使用する場合は、必ず 64 ビットバージョンの Java を使用してください。このバージョンでは、ICYに割り当てられたメモリを増やすことができます (環境設定 |一般 |最大メモリ)。

2. プロトコルを開く

[ICY] を開き、リボンメニューの[ツール] をクリックします。
[プロトコル] をクリックして、[プロトコルエディタ]インターフェイスを開きます。
[読み込み] をクリックし、プロトコルのサブ構造アナライザを開きます。プロトコルの読み込みには数秒かかることがあります。プロトコルを使用する前に、プロトコルのオープンが完了していることを確認してください。
注: ワークフローは、図 2aに示す 13 個の一般ブロックで構成されています。各ブロックは、特定のサブタスクを実行する複数のボックスで構成されるパイプラインとして機能します。

3. Icy 上のワークフローとの対話

注: 各ブロックまたはボックスには番号が付けられており、ワークフロー内の特定のランクが付けられます (図 2b)。この番号をクリックすると、最初のブロック/ボックスに最も近い位置が割り当てられ、他のブロック/ボックスの位置が再編成されます。ワークフローを準備する際には、ブロックの正しい順序を尊重します。たとえば、スポットディテクターブロックには、スポットディテクターブロックの前にセグメンテーションブロックを実行する必要があるため、事前に定義された ROI が必要です。ボックスの位置を変更しないでください。画像名に "." を使用しないでください。

左上隅のアイコンをクリックすると、ブロックを折りたたんだり、展開したり、拡大したり、狭めたり、削除したりします(図2b)。
ワークフローの各パイプラインは、入力と出力を介して接続されたボックスのネットワークによって特徴付けられます(図 2b)。接続を作成するには、[出力]をクリックし、カーソルが入力に到達するまで維持します。接続は、Outputタグをクリックして削除できます。

4. 画像のチャンネルの結合

[チャネルのマージ]ブロックを使用して、マージされたイメージを生成します。必要に応じて、マージするシーケンスの名前に、同じ名前の接頭辞の後に別の区切り文字が付くようにファイル名を変更します。たとえば、イメージ A の個々のチャネルのシーケンスには、ImageA_red、ImageA_blueという名前が付けられます。
注: 区切り記号については、イメージ名に既に含まれる文字を使用しないでください。
同じフォルダに、マージするチャネルごとに 1 つの新しいフォルダを作成します。たとえば、赤、緑、青のチャンネルを結合するには、3 つのフォルダを作成し、対応するシーケンスをこれらのフォルダに保存します。
[マージチャネル] ブロックのみを使用し、他のブロックを削除し、プロトコルを[チャネルのマージ]として保存します。
1. パラメータを設定するには、ボックスにアクセスします。各チャネルについて、チャネル番号 X (ボックス 1、5、または 9)、フォルダーチャネル番号 X (ボックス 2、6、または 10)、区切りチャネル番号 X (ボックス 3、7、または 11)、カラーマップチャネル nb X (ボックス 4、8、12) をそれぞれ入力します。
  注: これらのボックスは、同じチャネルに対応する各行を 4 つ分ずつ横にグループ化しています。各行には、対応するチャンネルのシーケンスを直接可視化するためのディスプレイ(ボックス23、24、または25)も利用できます。
  1. [チャンネル番号 X]ボックスで、抽出するチャンネルを選択します (クラシック RGB 画像では、0 =赤、1 = 緑、2=青)。「シーケンス」タブの「Icy」インスペクタ・ウィンドウ内の画像のさまざまなチャンネルに、ユーザーがすばやくアクセスします。
  2. [フォルダチャネル番号 X]ボックスに、チャンネル X のイメージを含むフォルダの \Name を入力します。
  3. [区切りチャネル番号 X]ボックスに、イメージの名前に使用する区切り記号を入力します (前の例では、"_red"、"_green"、"_blue" を入力します)。
  4. [カラーマップチャネル nb X]ボックスで、対応するチャネルを Icy で視覚化するために使用するカラーマップモデルを数値で示します。使用可能なカラーマップは、「インスペクタ」ウィンドウの「シーケンス」タブに表示されます。
  5. [マージされたイメージの形式] ボックス (ボックス 28) に、マージされたイメージを保存する拡張子を書き込みます。
    注: 2 つのチャンネルのみをマージするには、3 番目のチャネルに対応する 4 つのボックスを埋めないでください。
2. [チャンネルの結合] ブロックの左上隅にある [フォルダ] の右にあるリンクをクリックします。表示される [開く] ダイアログボックスで、[フォルダチャネル番号 1 (ボックス 2) で定義されている最初のチャネルのシーケンスを含むフォルダーをダブルクリックします。次に、[開く] をクリックします。
3. [チャネルのマージ] ブロックの左上隅にある黒い矢印をクリックして、プロトコルを実行します (詳細については、パート 7 を参照してください)。マージされた画像は、個々のチャンネルのフォルダと同じディレクトリのMergeフォルダに保存されます。

5. 関心領域のセグメンテーション

注: Substructure Analyzer は、シンプルで洗練されたアルゴリズムを統合し、画像の複雑さとユーザーのニーズに合わせたさまざまな選択肢を提案します。

適合ブロックを選択します。
1. オブジェクトが互いに接触しない場合、またはユーザーがクラスタ化されたオブジェクトを個別に区別する必要がない場合は、ブロックセグメンテーション A: 非クラスタ化オブジェクトを使用します。
2. オブジェクトが互いに接触せず、オブジェクトの一部が近い場合は、ブロックセグメンテーション B: クラスタ化が不十分なオブジェクトを使用します。
3. 高いクラスタ化レベルと凸形状のオブジェクトの場合は、ブロックセグメンテーション C: 凸形状のクラスタ化オブジェクトを使用します。
4. オブジェクトが高いクラスタレベルを持ち、不規則な形状を持つ場合は、ブロックセグメンテーション D: 不規則な形状を持つクラスタ化オブジェクトを使用します。
5. ブロックセグメンテーションE:クラスター化された細胞質を使用して、セグメント化された核をマーカーとして使用して個別に触れるサイトプラズムをセグメント化します。このブロックは、処理するためにセグメント化された核を必要とします。
  注: 一次オブジェクトセグメンテーションプロセスに個別に適合したブロックは、複数のブロックを同じ実行で使用して、特定のサブ構造の効率を比較したり、異なるタイプのサブ構造をセグメント化したりできるようにします。同じイメージセット内でクラスタリングレベルが異種である場合は、適合ブロック内で小さくて高度にクラスタ化されたオブジェクトを別々に処理します。
ブロックのoutput0 (ファイル)を[フォルダを選択]を、選択したセグメンテーションブロックのフォルダ入力にリンクします。
選択したセグメンテーションブロックのパラメータを設定します。
1. セグメンテーション A: 非クラスタ化オブジェクトとセグメンテーション C: 凸形状を持つクラスタ化オブジェクト
  1. ボックスチャネル信号(ボックス1)で、オブジェクトのチャンネルをセグメントに設定します。
  2. オプションとして、ボックスガウスフィルタ(ボックス2)で、オブジェクト内の信号が不均一な場合は、XおよびYシグマの値を増やします。ガウスフィルタは、テクスチャを滑らかにして、より均一な領域を得て、核のセグメンテーションの速度と効率を向上させます。オブジェクトが小さいほど、シグマ値は低くなります。高いシグマ値は避けてください。既定値を 0 に設定します。
  3. ボックスHK-Means (ボックス 3)で、[強度クラス] パラメーターと、検出するオブジェクトの最小サイズと最大サイズ (ピクセル単位) を設定します。
    注: 強度クラスの場合、値 2 は、背景と前景の 2 つのクラスのピクセルを分類します。このように、オブジェクトと背景のコントラストが高い場合に適応されます。前景オブジェクトの強度が異なる場合や、背景とのコントラストが低い場合は、クラス数を増やします。デフォルト設定は 2 です。対象のオブジェクトの周囲に手動で ROI を描画することで、オブジェクトのサイズを簡単に評価できます。ROI のサイズ (ピクセル単位) は、カーソルでイメージをポイントすると画像に直接表示されるか、ROI 統計情報ウィンドウでアクセスできます(検索バーから開きます)。最適パラメータは、各前景オブジェクトを単一のROIで検出します。これらは、ICY (検出と追跡 |HK-Means)。
  4. [アクティブコンター ](ボックス 4)で、オブジェクトの境界線の検出を最適化します。このプラグインの包括的なドキュメントはオンラインで入手できます: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours.正しいパラメータは、Icy (検出とトラッキング |アクティブな輪郭。
  5. このプロセス中に、セグメント化されたオブジェクトのイメージを保存するフォルダが自動的に作成されます。テキスト (ボックス6) ボックスに、このフォルダー (例: セグメント化された核) に名前を付けます。セグメント化されたオブジェクトのイメージ (Tiff、Gif、Jpeg、BMP、PNG) の保存形式を設定するには、セグメント化されたオブジェクトのイメージのボックス形式を入力します。マージされたイメージを含むフォルダにフォルダが作成されます。
  6. ワークフローを実行します (詳細については、パート 7 を参照してください)。
2. セグメンテーション B: クラスター化が不十分なオブジェクト
  1. 5.3.1 と同じ手順で、セグメント化されたオブジェクトとテキストを保存するための、ボックスチャネル信号、HK-平均、アクティブコンター、拡張のパラメータを設定します (ボックスのランクはステップ 5.3.1 と同じではありません)。
  2. 「IJ プラグインを呼び出す」(ボックス 4)のボックスで、バックグラウンド減算を制御するRollingパラメーターを設定します。このパラメーターは、背景の一部ではない最大のオブジェクトのサイズを少なくとも設定します。この値を小さくすると、バックグラウンドの削除が増加しますが、フォアグラウンド信号の損失を引き起こす可能性もあります。
  3. [アダプティブヒストグラムイコライゼーション]ボックス(ボックス 6)で、前景オブジェクトと背景のコントラストを改善します。傾斜を大きくすると、より対照的なシーケンスが表示されます。
  4. ワークフローを実行します (詳細については、パート 7 を参照してください)。
3. セグメンテーション D: 不規則な形状を持つクラスタ化されたオブジェクト
  注: セグメンテーションの 3 つの異なる方法は、各イメージに適用されます: まず、HK 平均クラスタリングと組み合わさアクティブコンター法が適用されます。次に、古典的な流域アルゴリズム(ユークリッド距離マップを使用して) は、以前に誤ってセグメント化されたオブジェクトに適用されます。最後に、マーカーベースの流域アルゴリズムが使用されます。ユーザーの介入が必要なのは、HK 平均法とマーカーベースの流域メソッドだけです。どちらの方法でも、すべての画像に同じパラメータを適用することも(完全に自動化されたバージョン)、または各画像に対して変更することもできます(半自動バージョン)。ユーザーがこれらのセグメンテーション方法でトレーニングを受けていない場合は、半自動処理を強くお勧めします。このブロックの処理中は、手動による介入が必要です。セグメンテーションメソッドが終了したら、ユーザーは次のセグメンテーションメソッドの開始前に、誤ったセグメント化されたオブジェクトを手動で削除する必要があります。正常にセグメント化されたオブジェクトは保存され、次のステップでは考慮されません。このブロックはブロックと接続する必要があります[クラスタ化/異種図形] プライマリオブジェクトの [セグメント化] ダイアログボックスをクリックして正しく動作します。
  1. https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releasesで ImageJ コレクション MorphoLibJをダウンロードします。このプロトコルでは、MorphoLibJ 1.4.0 バージョンが使用されています。ファイルをMorphoLibJ_-1.4.0.jarフォルダー icy/ij/plugins に配置します。このコレクションのコンテンツの詳細については、https://imagej.net/MorphoLibJを参照してください。
  2. ステップ 5.3.1 と同じ手順に従って、セグメント化されたオブジェクトと Text を保存するための、チャネル信号、ガウスフィルタ、アクティブコンター、拡張のパラメータを設定します。ボックスのランクは、ステップ 5.3.1 とは同じではありません。
  3. [適応型ヒストグラムイコライゼーション]ボックスのパラメータを設定します(ステップ5.3.2.3を参照)。
  4. [背景を減算] をアクティブにするには、[減算背景を適用しますか?] (ボックス 5) に「はい」と入力します。それ以外の場合は、いいえを書き込みます。プラグインがアクティブになっている場合は、ローリングパラメータ(ステップ 5.3.2 を参照)を設定し、ボックスの背景パラメータを減算(ボックス 7) で。
  5. HK手段の自動化:すべてのイメージに同じパラメータを適用するには(完全に自動化された処理)、クラスのNb(ボックス11)、最小サイズ(ボックス12)、最大サイズ(box13)を設定します(ステップ5.3.1を参照)。これらのパラメータは、最大前景ピクセルを選択し、前景オブジェクトの個別化を最適化するために設定する必要があります。半自動処理バージョンでは、介入は必要ありません。
  6. マーカー抽出の自動化:完全自動化バージョンの場合は、「内部マーカー抽出(ボックス 27)」ボックスを展開し、スクリプトの 13 行目に「動的」パラメーターの値を設定します。半自動処理バージョンでは、介入は必要ありません。
    注: マーカーは、「動的」パラメータによって制御される入力イメージに拡張ミニマ変換を適用することによって抽出されます。マーカーベースの流域アルゴリズムでは、これらのマーカーからのフラッディングがシミュレートされ、オブジェクトのセグメンテーションが実行されます。前景オブジェクトのセグメンテーションが成功するためには、フォアグラウンドオブジェクトごとに1つのマーカーを抽出する必要があります。最適なマーカー抽出のための「動的」パラメータの設定は、主に画像の解像度に依存します。したがって、このパラメータに慣れていない場合は、半自動化バージョンを使用してください。
  7. ワークフローを実行します (詳細については、パート 7 を参照してください)。
  8. 処理の開始時に、ダイアログボックスHK 平均パラメータとマーカーベースの集水域が連続して開きます。すべてのイメージに同じパラメータを適用するには(完全に自動化されたバージョン)、[はい]をクリックします。それ以外の場合は、[いいえ] をクリックします。「HK-Meansプラグインで最適なROIを決定し、画像を閉じる」ことを求める情報ボックスが開きます。OKをクリックして、手動でHK-Meansプラグインを適用します (検出とトラッキング|HK-平均)が自動的に開きます。HK-Means プラグインボックスで「ROIをエクスポート」オプションを選択します。最大前景ピクセルを含む ROI を持ち、フォアグラウンドオブジェクトの個別化を最適化するには、最適なパラメータを適用します。最適な ROI が見つかったら、画像を直接閉じます。
  9. 最初のセグメンテーション方法の最後に、情報ボックスが開き、「不要なROIを削除して画像を閉じる」と尋ねられます。これらの ROI は、セグメント化されたオブジェクトの境界に対応します。[OK]を選択し、イメージ内の誤ったセグメントオブジェクトの ROI を削除すると、自動的に開きます。ROI は、その境界線上にカーソルを置いて、キーボードの「削除」ボタンを使用して簡単に削除できます。画像を閉じます。2 番目のセグメンテーションステップが完了した後も同じ手順を繰り返します。
  10. この段階で、マーカーベースの流域アルゴリズムのフルオートマタイズに YES ボタンが選択されている場合、以前に設定したパラメータがすべての画像に適用されます。
  11. NOボタンを選択すると、情報ボックスが開き、「内部マーカーを決定して調整する」ことを求める。OKをクリックし、IcyのImageJインターフェイス内で、プラグインに移動|モーフォリブJ |ミニマとマキシマ|拡張最小と最大.[操作] で、[拡張ミニマ] を選択します。
  12. [プレビュー]を選択すると、自動的に開かれた画像に変換結果が事前に表示されます。最適なマーカーが観察されるまで、ダイナミックを移動します。マーカーは、値が 255 (必ずしも白いピクセルではない) のピクセルのグループです。最適なパラメータは、オブジェクトごとに1つのマーカーにつながります。前の 2 つのセグメンテーションメソッドで適切にセグメント化されていない残りのオブジェクトに注目します。
  13. 必要に応じて、「開く」や「閉じる」などの追加の形態学的操作を適用してマーカーを改善する(プラグイン|モーフォリブJ |形態素フィルター)。マーカーの最終的な画像を取得する場合は、それを開いたままにして、拡張ミニマ操作の入力として最初に使用された画像で終わる他のすべての画像を閉じます。ImageJ ボックスで、このイメージに変更を保存するように求める場合は、[いいえ] をクリックします。
  14. 情報ボックス (ボックス 14)を持つ画像のボックス Nbで、情報ボックスを持つ画像の数を決定します。
4. セグメンテーション E: クラスター化細胞質
  注: このブロックは、以前にセグメント化された核を個別のマーカーとして使用して、細胞質セグメンテーションを開始します。核セグメントのブロックが使用する前に処理されていることを確認してください。
  1. ボックスチャネル細胞質(ボックス1)で、細胞質信号のチャネルを設定します。
  2. [拡張セグメント化された核](ボックス 2)に、セグメント化された核のイメージを保存するために使用される形式を書き込みます(tif、jpeg、bmp、png)。デフォルトのフォーマットは tif です。
  3. テキスト(ボックス 3) ボックスに、セグメント化された核を含むフォルダーの \Name を書き込みます。
  4. [セグメント化されたサイトプラクムのイメージの形式] ボックス (ボックス 4) で、セグメント化されたオブジェクトのイメージ (Tiff、GIF、Jpeg、BMP、PNG) の保存に使用する形式を設定します。
  5. このプロセス中に、セグメント化されたサイトプラズムのイメージを保存するフォルダが自動的に作成されます。テキスト(ボックス 5) ボックスに、このフォルダーに名前を付けます (例: セグメント化サイトプラズム)。マージされたイメージを含むフォルダにフォルダが作成されます。
  6. ステップ 5.3.1 と同じ手順に従って、ボックスのガウスフィルタとアクティブコンターのパラメータを設定します (ボックスのランクは手順 5.3.1 と同じではありません)。
  7. ワークフローを実行します (詳細については、パート 7 を参照してください)。

6. 蛍光シグナル検出と分析

適合ブロックを選択します。
1. ブロック蛍光分析A:1チャネルで、1つのタイプのセグメント化されたオブジェクトの中の1つのチャネルでの病巣の検出および分析を行う:核内のコイリン病巣(赤チャネル)の検出。
2. ブロック蛍光分析B:同じコンパートメント内の2チャンネルで、1つのタイプのセグメント化されたオブジェクトの中の2つのチャネルでのフォチの検出と分析を行う:核内のコイリン(赤チャネル)および53BP1(緑チャネル)病巣の検出。
3. ブロック蛍光分析C:2つのコンパートメント内の2つのチャネルは、核内の特異的に1つまたは2つのチャネルで、核内の特異的な検出および対応する細胞質(赤チャネル)の両方のコイリン病巣(赤チャネル)の検出、または対応する細胞質内のコイリン病巣(赤チャネル)の検出および対応する細胞内のコイリン病巣(緑色チャネル)の検出を行う。
4. ブロック蛍光分析D:グローバル転位で、2つのセルラーコンパートメント(aとb)の1つのチャネルからの信号の割合を計算します。例えば、細胞質/核転座アッセイでは、最終的な「結果」スプレッドシートの各画像に対して、計算された核信号と細胞質信号の割合をエクスポートします。核信号の割合を計算するために使用される式を以下に示します。このブロックは、任意の細胞内区画に使用できます。
5. ブロック蛍光分析 E: 個々の細胞転位で、各セルの 2 つのセルラーコンパートメント内の 1 つのチャネルからの信号の割合を計算します。このブロックは単一細胞レベルの核/細胞質転座アッセイのために特別に最適化される。
  注:ブロック蛍光分析E:個々の細胞転位は単一細胞レベルで分析を行うので、核と細胞質の効率的なセグメンテーションが必要です。
ブロック選択フォルダ(ブロック1)のoutput0(ファイル)を、選択したブロックのフォルダ入力(黒丸の白い矢印)にリンクします。
選択したブロックのパラメータを設定します。
1. 蛍光分析A:1チャネル、蛍光分析B:同じコンパートメント内の2チャンネルと蛍光分析C:2つのコンパートメント内の2チャンネル
  1. [フォルダイメージの ROI] ボックスに、円記号が付いたセグメント化されたオブジェクトのイメージを含むフォルダの名前を入力します。(例: \セグメント化された核)。
  2. セグメント化されたオブジェクトのイメージのフォーマット(ボックス 2) に、セグメント化されたオブジェクトのイメージを保存するために使用する形式 (tif、jpeg、bmp、png) を書き込みます。デフォルトのフォーマットは tif です。
  3. [罫線を殺す]ボックスに [はい] と入力して、枠線オブジェクトを削除します。それ以外の場合は、Noと書き込みます。この関数を使用するには、ImageJ の MorphoLibJ コレクションのインストールが必要です (ステップ 5.3.3 を参照)。
  4. ボックスのチャンネルスポット信号で、スポットを検出する必要があるチャンネルを設定します。従来の RGB イメージでは、0 =赤、1 =緑、および 2=青。
  5. [局所的な分子の名前] ボックスに、スポットに局所化する分子の名前を書きます。入力するフィールドの数は、分子の数によって異なります。
  6. ボックスで、ウェーブレットスポット検出器ブロックで、各チャンネルのスポット検出パラメータを設定します。スケール(スポットサイズと呼ばれる)と検出の感度を設定します(感度が小さいほど検出されたスポットの数が減少し、デフォルト値は100、最小値は0)。このプラグインの包括的なドキュメントはオンラインで入手できます: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector.パラメータは、ICY (検出とトラッキング |スポット検出器)。
  7. オプションとして、[サイズで ROI をフィルター]ボックスで、サイズの間隔を設定して、スポットが検出されるセグメント化されたオブジェクトをフィルター処理します (ピクセル単位)。この手順は、セグメントが少ないオブジェクトやセグメント分割されていないオブジェクトを削除する場合に特に便利です。オブジェクトのサイズを手動で見積もる方法については、ステップ 5.3.1 を参照してください。デフォルトのパラメータには、ROI のサイズによるフィルタリングは含まれません。2つのコンパートメントのブロック2チャンネルには、サイズ別フィルター核(ボックス19)とフィルター細胞質(ボックス46)の2つのボックスが含まれています。
  8. 必要に応じて、[サイズでフィルター]ボックスで、検出されたスポットをサイズ (ピクセル単位) に従ってフィルター処理し、不要なアーティファクトを削除します。スポットサイズを手動で推定するには、[検出と追跡]をクリックしてスポット検出プラグインを開きます。[出力オプション] で、[ROI にエクスポート]を選択します。既定のパラメータには、サイズによるスポットのフィルタリングが含まれていないこと、およびフィルタリングされたスポットが解析に考慮されないことに注意してください。入力するフィールドの数は、チャネルの数によって異なります。
  9. 必要に応じて、[フィルタースポット] ボックスで、検出されたスポットに追加のフィルター (コントラスト、均質性、境界、丸み) を適用します。デフォルトのパラメータにはスポットフィルタリングが含まれず、フィルタリングされたスポットは解析に考慮されないことに注意してください。入力するフィールドの数は、チャネルの数によって異なります。
  10. 必要に応じて、[スポットサイズのしきい値] ボックスで、分析されたスポットの領域 (ピクセル単位) のしきい値を設定します。このしきい値を下回る数としきい値を超えるカウントされたスポットの数は、最終結果スプレッドシートにエクスポートされます。通知されるボックスの数は、チャネルの数によって異なります。
  11. ワークフローを実行します (詳細については、パート 7 を参照してください)。データは、マージされたイメージを含むフォルダに保存された結果スプレッドシートにエクスポートされます。
2. 蛍光分析D:グローバル転位・蛍光分析E:個々の細胞転位:
  1. [フォルダイメージ](ボックス 1 および 2)に、セグメント化されたオブジェクトのイメージを含むフォルダの \Name を入力します。「蛍光分析 D: グローバル転位」では、ROI の 2 つのタイプが ROI a および ROI b と識別されます。ブロック蛍光分析 E: 個々のセルの転位のフォルダー画像セグメント化された核とフォルダー画像セグメント化されたサイトプラズムボックスで、それぞれセグメント化された核とサイトプラズムを含むフォルダーの名前を書きます。
  2. ボックスチャンネル信号(ボックス3)に、信号のチャンネルを入力します。
  3. セグメント化されたオブジェクトのイメージのフォーマット(ボックス 4) に、セグメント化されたオブジェクトのイメージを保存するために使用する形式 (tif、jpeg、bmp、png) を書き込みます。デフォルトのフォーマットは tif です。[境界を強制終了]オプションは、境界オブジェクトを削除するためにも使用できます(ステップ6.3.1を参照)。
  4. 必要に応じて、[サイズで ROI をフィルター]ボックスで、サイズの間隔を設定してセグメント化されたオブジェクトをフィルター処理します (ピクセル単位)。この手順は、セグメントが少ないオブジェクトやセグメント分割されていないオブジェクトを削除する場合に役立ちます。オブジェクトサイズを手動で見積もる方法については、ステップ 5.3.1 を参照してください。入力するフィールドは 2 つあり、チャネルごとに 1 つ。デフォルトのパラメータには、サイズによる ROI フィルタリングは含まれません。
  5. ワークフローを実行します (詳細については、パート 7 を参照してください)。スプレッドシート内のデータをエクスポート結果は、マージされた画像を含むフォルダーに保存されます。

7. プロトコルを実行する

実行で 1 つのブロックを処理するには、選択したブロックとブロックの間の接続を削除します。1stランクに指名手配ブロックを^st配置します。目的のブロックの左上隅にあるフォルダの右にあるリンクをクリックします。表示される [開く] ダイアログボックスで、結合したイメージを含むフォルダをダブルクリックします。次に、[開く] をクリックします。[実行] をクリックしてワークフローを開始します。処理は、停止ボタンをクリックして停止することができます。
実行で異なるブロックを処理するには、選択したブロックの接続をブロックの[フォルダを選択](ブロック1)に保持します。ランクがワークフローの良好な処理を許可していることを確認します。たとえば、特定のブロックでセグメント化されたオブジェクトを処理する必要がある場合は、セグメント化ブロックが処理される前に必ず行ってください。ワークフローを実行する前に、使用されていないブロックを削除し、新しいプロトコルを別の名前で保存します。
[実行] をクリックしてワークフローを開始します。[開く] ダイアログボックスが表示されたら、結合したイメージを含むフォルダをダブルクリックします。次に、[開く] をクリックします。ワークフローが自動的に実行されます。必要に応じて、停止ボタンをクリックして処理を停止します。
処理の最後に、ワークフロー実行のメッセージが右下隅に表示され、すべてのブロックに緑色のフラグが付いているかどうかを確認します(図2b)。見えない場合は、エラー記号を示すブロックと内側のボックスが、修正する要素を示します (図 2b)。
注: ワークフローが正常に実行された後、新しい実行を直接開始することはできず、ワークフローを再度処理するには、少なくとも 1 つのブロックに「処理準備完了」というフラグが付く必要があります。ブロックの状態を変更するには、このブロック内の 2 つのボックス間のリンクを削除して再作成するか、プロトコルを閉じて再度開きます。処理中にエラーが発生した場合は、新しい実行を直接開始できます。新しい実行中に、パイプラインの一部に緑色の記号が付いている場合でも、パイプラインのすべてのブロックが処理されます。

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Representative Results

説明されたすべての分析は、Javaの64ビットバージョンで動作する標準ラップトップ(2.80 GHzの64ビットクアッドコアプロセッサと16 GBのランダムアクセスメモリ(RAM))で実行されています。ランダムアクセスメモリは、分析する画像の量と解像度に応じて考慮すべき重要なパラメーターです。32 ビットバージョンの Java を使用すると、メモリは約 1300 MB に制限されますが、これはビッグデータ分析には適さない可能性がありますが、64 ビットバージョンでは Icy に割り当てられたメモリを増やすことができます。図 3 は、さまざまな種類のイメージと解像度のセグメント化に必要な時間を示しています。これは、高解像度が主オブジェクトのセグメンテーションの時間を大幅に増加することを確認します。

次の段落で示されるデータは、Substructure Analyzerワークフローを使用して、細胞生物学および分子生物学(細胞数、病巣カウントおよび分析、転座解析)で遭遇する一般的な問題のほとんどを解決できることを示しています。

特定のコンパートメント内に濃縮された分子の正確な割合の多数の細胞での測定や、細胞内領域間の局在化の変化は、特に手動で行う場合には、非常に面倒でエラーが発生しやすい作業です。図4は、TNFα刺激に応答して転写因子NFκBの原子転移を迅速かつ正確に定量するワークフローの能力を示す。分析に使用された画像は、イリャ・ラヴキン(http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm)によって優雅にコンパイルされ、ブロードバイオイメージベンチマークコレクション¹⁶で一般に公開されています。このセットには、TNFα濃度を上げると処理したMCF7およびA549細胞株の画像が含まれています。MCF7細胞株から40,000以上のセルと96の画像(各チャンネルの48画像)に対して分析が行われました(図4a)。(画像のインポートからデータ保存まで)全体の分析は26分かかりました。各画像は、特定のTNFα濃度に対応しています。NFκBの核/細胞質比率は、所定の画像に対してすべての細胞にわたって均質であった。このため、各画像について、NFκBの核および細胞質の割合を計算するために全ての核または細胞質のピクセルの値を合計し、それらの分割中に核/細胞質に触れるの個別化は必要とされなかった。DAPI画像はセグメンテーションC:凸形状ブロックを持つクラスター化されたオブジェクトをセグメント核に処理し、緑色のチャネルを使用してセグメンテーションE:クラスター化細胞質ブロックを使用してサイトプラズムを線引した(図4b)。蛍光分析D:グローバル転位ブロックは、核と細胞質のピクセル値の合計をエクスポートするために使用されました。得られたデータを用量応答曲線(図4c)で表し、TNFαの濃度を増加させて刺激後のNFκB核比率の増加を示す。

ワークフローは、異なるサブセルラーコンパートメント内のグローバル強度信号を分析するだけでなく、病巣を検出し、その特徴に関する特定の情報を抽出するためにも使用できます。図5aは、mRNAデカッピング4(EDC4)タンパク質のエンハンサーを局部化して個々の細胞におけるP体の検出を示す。セグメンテーションA:非クラスター化物体ブロックは、低レベルのクラスタリングを示す核をセグメント化するために使用され、セグメンテーションE:細胞質分析C:EDC4病巣を検出するための2つのコンパートメント内の2つのチャネルを示すクラスター化E:クラスター化細胞質ブロック。セグメント化されたオブジェクトが識別され(セグメント化されたnuclei_0、セグメント化されたcytoplasms_0)、EDC4平均強度や各ROI内の検出されたボディの数/サイズ(図5b)のように、対応するワークシート(セグメント化された核情報とセグメント化されたサイトプラズム情報)に複数の情報が収集されます。分析される前に、検出された体は、その領域に応じて予備的にフィルタリングすることができ、顕微鏡の解像度の下の物体を除外するのに役立ちます。保存されたオブジェクトのサイズを推定するために、追加の領域しきい値を導入できます。検出されたすべてのボディの領域は、専用のワークシート(セグメント化されたnuclei_Distribution病のサイズ、セグメント化されたcytoplasms_Distribution病巣サイズ)で報告されます。この例では、細胞質EDC4病巣が検出された2つの細胞(セグメント化されたnuclei_0 and_1およびセグメント化されたcytoplasm_0 and_1)の分析を強調しています。なお、EDC4タンパク質のシグナルは核および細胞質コンパートメントの両方で検出されるが、細胞質病巣のみがP体に相当する。核信号は、免疫蛍光実験を行うために使用される抗体の交差反応性から生じる可能性が最も高い。各病巣のサイズ (ピクセル単位) が与えられます。

そして、カジャール体に対する酸化ストレス(OS)の効果はまだ不明であったため、時間運動中に研究するワークフローの汎用性を利用した(500μM_H2O2でOS誘導後2〜20時間) (図6)。₂カハル体は、転写速度や細胞周期進行のような特定のパラメータの制御下で核形成内で核形成および溶解する動的構造である。カハルボディは、主な構造および機能成分であるコイリンタンパク質を局所化することによって視覚化された。カジャル体の数と大きさに関する情報は、DAPI(青)、53BP1(緑)およびコイリン(赤)の3つのチャネルを含む高解像度画像(3840X3072)から2300個の個々の細胞を研究することによって収集された(図6a)。完全な処理は 1 時間未満でした。核は凸形状を提示し、そのうちのいくつかはクラスタ化されたため、セグメント化を実行するために、ブロックセグメンテーションC:凸形状のクラスター化されたオブジェクトが選択されました。OSはDNA二本鎖切断(DDSB)を誘導することが知られているので、DNA損傷シグナル伝達経路の必須エフェクターとして知られているp53結合タンパク質1(53BP1)を、ストレス細胞と非ストレス細胞を区別するためのマーカーとして使用した。実際、DNA損傷がない場合、53BP1は核内に均質に分布し、DNA損傷後はDDSBに集中し、顕微鏡で容易に識別可能な病巣を形成する。各セルにおける53BP1とコイリン核病巣の数と大きさを、同じ区画内のブロック蛍光分析B:2チャネルを用いて分析した。まず、53BP1データの分析は、キネティクスの各時点について、ストレス状態に応じて細胞を分類するのに最適な閾値を決定するのに役立った。全体の運動論の中で、OSはOSの誘導後2、4、および8時間で11倍の増加を伴う53BP1病巣数の有意な増加を誘導する(図S1)。この効果は、非ストレス細胞のDSBの初期レベルが高いため、6時間(6.5倍)ではあまり顕著ではありません。20時間後でも、持続的な増加(ほぼ6倍)が残る。これらのデータは、OSを誘導し、顕微鏡における早期および後期の両方の観察のための効率的なストレスマーカーとして53BP1を確立するための治療の効率を反映しています。一方、DDSBの低レベルのストレス細胞のごく一部は、運動の各時点で観察され、細胞が均一にストレスを受けないことを示唆し、ストレス実験でストレスマーカーを使用することの重要性を強制する。ROC分析に基づいて、17 53BP1病巣の全体的な閾値を選択し、運動全体でストレスを受けた細胞とストレスを受けていない細胞を区別する(図S1)。

次に、コイリンの核病巣の数と大きさを細胞のストレス状態に応じて分析した。ストレス誘導後2,4,6時間の有意な増加が認められた(図6b)。最も持続的な効果は2時間で観察され、10以上の病巣を有する細胞の数は、ストレスを受けていない細胞の0%からストレス細胞では75%に増加する。さらに、その時点のストレス細胞の25%以上が20以上のコイリン病巣を持っていた。この効果は8時間まで徐々に減少する。20時間で、第1および第3四分位のわずかな増加が観察されるが、データはまた、非ストレスおよびストレス細胞に存在する細胞の84%および80%がそれぞれ8病巣未満であることを示している。これらのデータは、OSがカハルボディの核生成を制御するパラメータにも後期効果があることを示しています。興味深いことに、コイリン核病巣の特徴を注意深く分析すると、コイリン病巣の数が増加し、そのサイズが減少することが明らかになった(図6c)。例えば、OS誘導後2時間、0.2μm2未満の面積を有するコイリン病²巣の割合は26%から64%に増加する。この効果は8時間まで減少するが、カハル体の数とは異なり、20時間で有意な変化は認められない。これは、カハル体の初期および後期の核内核細胞再分配が異なる事象であることを反映している可能性がある。

これらのデータは、OSがカハル体の核形成力を変化させること、核内再分配を多数の小さな核病巣に誘導することを強く示唆している。カハルボディの核形成はタンパク質およびRNA成分によって駆動されるため、OS効果がカハルボディの組成を変化させる可能性があることを示唆している。カハル体内では、コイリンタンパク質は、SMN複合体およびSmタンパク質の成分などのいくつかの異なるタンパク質パートナーと相互作用します。これらの相互作用は、しばしばコイリンのホスホドメインを含み、カハル体の構造の改変がコイリンのリン酸化状態の変化に関連していると想像できる。さらに、最近の研究は、カハル体が核内にランダムに局在せず、特定の遺伝子遺伝子loci¹⁷との近接関連を通じて遺伝子発現に影響を及ぼす可能性があることを実証した。これらすべての事実を考えると、カハル体の機能性に影響が彼らの構造の変化を伴うならば、それは驚くべきことではありません。これらの結果から、このようなカハルボディの改造がOSの受動的な結果であるか、または例えば特定の遺伝子遺伝子遺伝子座と相互作用することによって応答に参加しているかどうかを尋ねることもできます。

コイリン発現の変化がカハル体の局在化を変え、核形成を変える可能性があるかどうかを調べ、外因性GFP-コイリン融合タンパク質を過剰発現した。核はクラスタ化されていないので、セグメント化はブロックセグメンテーション A: 非クラスタ化オブジェクトで実行されました。そして、GFP-コイリン(緑色信号、チャネル2)過発現のレベルに従ってコイリン病巣の数及びサイズを正確に定量するために、ブロック蛍光分析B:2チャネルを同じコンパートメントに用いた。GFP-コイリンのレベルは、個々の核におけるGFPシグナルの平均強度によって反映された(図7a)。中レベルまたは高レベルのGFP-コイリン過剰発現(GFP強度が10より高い)を有する細胞では、核当たりのカハル体数は、最大21個の病巣を示す核と共に有意に増加する(図7b)。また、カハルボディの明るさ(平均強度)は、強度飽和につながる過剰発現レベルと並行してかなり増加することにも気づいた。このような飽和領域は、したがって、より小さく、かすかな病巣の存在を隠す可能性があります。中程度または高レベルのGFP-コイリンを過剰発現する細胞では、カハル体のサイズも大きく、中央値が1~2μm2に上昇²する(図7c)。さらに、GFP-コイリン発現レベルの高い細胞の25%以上が2.5μm²を超える領域を有する病巣を有する一方、非トランスフェクション細胞では0.8μm2を超えることはありません。²結論として、GFP-コイリン過剰発現はカハル体の数とサイズの両方の有意な増加をもたらす。OSはカハルボディの数を増やすが、そのサイズを小さくするので、これらのデータは、カハルボディの構造に対するOSの影響が、おそらくコイリンの細胞量に対する影響ではなく、その組成の変化によって引き起こされることを反映している可能性がある。

図 1:サブ構造アナライザーパイプライン
このワークフローは、バイオイメージ情報学のオープンコミュニティプラットフォームであるIcyで開発され、複数の蛍光顕微鏡画像の自動分析を行います。まず、マルチチャンネル画像はプロトコル内に自動的にロードされ、必要に応じて信号対ノイズ比を改善し、イメージングアーティファクトを除去するために事前処理されます。次に、画像セグメンテーションは、対象領域(ROI)を背景から分離します。クラスタリングのレベルと対象オブジェクトの性質に応じて、セグメンテーションの方法をいくつか使用できます。セグメント化されたオブジェクトは、特定の記述子 (たとえば、image name_Nucleus_1) とともに特定のフォルダーに保存され、後続の分析に使用/再利用できます。スポットなどの蛍光信号をROI内で解析し、複数の特徴(位置、大きさ、形状、強度、テクスチャ、スポット番号、サイズ)を自動的に作成したスプレッドシートにエクスポートします。検出されたスポットの数など、測定されたすべてのフィーチャが、対応する ROI の記述子に報告されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: Icy ワークフローのグラフィカルインターフェイス
(aa ) ワークフローは 13 の一般的なブロックで構成され、一般的な機能に従ってグループ化できます。[チャンネルの結合](ブロック2)は、画像の異なるチャンネルをマージするために使用されます。ブロック 3 から 8 はオブジェクトのセグメンテーション専用で、それぞれが特定のコンテキストに適合しています:セグメンテーション A: 非クラスター化オブジェクト、セグメンテーション B: クラスター化オブジェクトが不十分なクラスター化オブジェクト、セグメンテーション C: 凸型シェイプを持つクラスター化オブジェクト、不規則な形状のクラスター化オブジェクト(ブロック 7、ブロック 6 に関連付けて動作)、セグメンテーション E: クラスター化されたサイトプラクムシ.ブロック9〜11は、細胞内区画内の病巣をカウント/分析するために使用される:蛍光分析A:1チャネル、蛍光分析B:同じコンパートメント内の2チャネルおよび蛍光分析C:2つのコンパートメント内の2チャネル。ブロック12および13は転座イベントの分析に適応される:蛍光分析D:グローバル転位および蛍光分析E:個々の細胞転位。(b) ブロックアーキテクチャのグローバルなプレゼンテーション。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: 画像解像度とオブジェクトのクラスタリングレベルの関数としてのセグメンテーションに必要な時間
(a) 画像の解像度とクラスタリングレベルに応じてセグメンテーションを実行するのに必要な時間をグラフィカルに示します。セグメンテーション A (非クラスタ化オブジェクトの場合) とセグメンテーション D (不規則な形状のクラスタ化オブジェクトの場合) の 2 つの異なるセグメンテーションブロックがテストされました。処理時間 (イメージごとの秒数) は、画像解像度 (ピクセル数) の関数としてプロットされます。(b)セグメンテーション Aブロックまたはセグメンテーション Dブロックを使用して分析した画像の例。DAPI染色およびセグメント化された核が示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:TNFα刺激に対するNFκB核転座アッセイのワークフロー解析
(a)BBBC014画像セットからTNFαで処理したヒトMCF7細胞(ヒト乳房腺癌細胞株)の画像の例(ブロードバイオイメージベンチマークコレクション^)12。a転写因子NFκBの局在化は、TNFαの12の増加濃度(0から^10-7g/mL)で処理された細胞において研究されている。各濃度について、4つの複製が行われた。DAPI画像(青チャネル)は、セグメンテーションC:凸形状ブロックを持つクラスター化された物体をセグメント核に処理し、FITC(緑色チャネル)によるNFκB染色を使用してセグメンテーションE:クラスター化細胞質ブロックで細胞質を線引いた。蛍光分析D:グローバル転位ブロックは、核と細胞質のピクセル値の合計をエクスポートするために使用されました。(b)セグメント化された核(灰色)およびサイトプラズム(白色)は、各区画におけるNFκB蛍光シグナルの全強度を決定するために使用される。(c)データ分析から得られた用量応答曲線は、TNFα濃度が増加するにつれてNFκB核比率の増加を示す。イメージは 8 ビット BMP 形式で、イメージサイズは 1360 x 1024 ピクセルです。濃度ごとに、4つの反復の標準偏差が計算され、誤差範囲として示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:細胞内の細胞質内のEDC4病巣(P体)の定量化
(a)DAPI(ブルーチャネル)とファロイジン(赤色チャネル)による共染色により、細胞核とF-アクチンのセグメンテーションと同定が可能になります。EDC4タンパク質(緑色チャネル)は、細胞質のみであることが知られているP体の検出のためのマーカーとして使用される。スケールバー、10 μm(b)Fociがカウントされ、いくつかの機能(ここではピクセル単位での面積)が、複数のシートで構成された結果スプレッドシートにエクスポートされます。b2枚のシートは、核の分析に専念し、2つはサイトプラズムの分析に専念しています。各生は特定の ROI の情報を埋め込みます。Nucleus/Cytoplasm情報シートでは、セグメント化されたオブジェクトの特性(ROI ID、サイズ、平均強度)がエクスポートされ、その後に各ROI内で検出された病巣の数が続きます。必要に応じて、サイズのしきい値 (この例では 100 ピクセル) を追加し、このしきい値より下および上の病巣の数は、最後の 2 つの列に報告されます。病巣サイズシートのnucleus/Cytoplasm_Distributionでは、検出されたすべての病巣の面積(ピクセル単位)が対応するROIの生で報告されます。この例では、細胞質EDC4病巣が検出された2つの細胞(セグメント化されたcytoplasm_0 and_1)の分析を強調しています。各病巣のピクセル単位のサイズも与えられます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:酸化ストレス後のコイリンおよび53BP1核内分布の運動論
病巣の数と大きさの分析は、3つの独立した運動薬から各時点の110個以上の個々の細胞に基づいた。(a) 500 μM H 2_O2を用いた治療用キネティクス全体のHeLa S3細胞におけるコイリンおよび₂53BP1病巣の蛍光検出。53BP1はDNA二重鎖破断部位に集中し、各細胞の処置の効率を評価するために使用される。コイリンはカハルボディで濃縮されています。細胞は酸化ストレス誘導後2、4、6、8、および20時間を固定し、抗コイリン(赤色チャネル)および抗53BP1(緑色チャネル)抗体と共染色した。スケールバー、10μm(b)酸化ストレス後のコイリン核病巣数。結果は箱ひげ図として表示され、中央マークは中央値、ボックスの下端と上端は25^番目と75^番目のパーセンタイルです。_H2O2で処理した₂細胞では、コイリン病巣の数の有意な増加が検出され、2時間及び4時間の治療後に最大である。ウィルコクソン - マンホイットニー試験分析は、未処理と_H2O2処理細胞の間に有意な差を示している(*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001)。₂(c)コイリン病巣領域の機能における細胞の割合(μm²⁾ほとんどの病巣は、コントロールと比較して2時間および4時間の時点で小さい領域を有する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7 GFP-コイリン融合タンパク質を過剰発現する細胞におけるカハル体の核形成に関する研究
(a)HeLa S3細胞は、メーカーの推奨に従って標準的な手順を使用してGFP-コイリン融合タンパク質を発現するプラスミドの500 ngを有する生物学的三重体中で一過性にトランスフェクトされた。48時間後、細胞を固定し、コイリンに対する抗体で染色した。DAPI (ブルーチャネル) は、核をセグメント化することができます。これらの解析では、100以上の細胞を分析した。GFPシグナルは異所性のコイリンGFPタンパク質(グリーンチャネル)局在を反映し、一方、コイリン信号(赤チャネル)は内因性タンパク質および外因性タンパク質の局在化の両方に対応します。各核について、GFP信号の平均強度は、コイリン発現のレベルを反映する。このパラメータによれば、コイリン病巣の特徴は、同じコンパートメント内のブロック蛍光分析B:2チャネルを用いて分析された。スケールバー、10μm(b)コイリン病巣の数と核あたりの平均GFP強度の関係。結果は箱ひげ図として表示され、中央マークは中央値、ボックスの下端と上端は25^番目と75^番目のパーセンタイルです。ウィルコクソン - マン・ホイットニーのテスト分析は、GFP強度>10(*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001) の病巣数の有意な増加を示しています。(c)コイリン病巣の面積と核あたりのGFP強度の関係結果は箱ひげ図として表示され、中央マークは中央値、ボックスの下端と上端は25^番目と75^番目のパーセンタイルです。ウィルコクソン - マンホイットニー試験分析は、GFP強度>10(*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001)に対するコイリン病巣の面積の有意な増加を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図S1:酸化ストレス後の53BP1核内分布の運動学
(a)未治療の53BP1核病巣の定量化または異なる培養時間後の_H2O2処理細胞。₂結果は箱ひげ図として表示され、中央マークは中央値、ボックスの下端と上端は25^番目と75^番目のパーセンタイルです。ウィルコクソン - マンホイットニー試験分析は、未処理と_H2O2処理細胞の間に有意な差を示している(*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001)。₂(b) 運動の各時点について、ストレスを受けた細胞とストレスを受けていない細胞を判別するための最良の閾値を決定するために ROC(受信機動作特性)曲線が確立された。各検定のパラメータは、表に報告されています(感度、特異性、TP:真陽性、TN:真陽性、FP:偽陽性、FN:偽陰性)。これらのデータから、17 53BP1病巣の世界的な閾値は、運動を通じてストレスを受けた非ストレス細胞からストレスを区別することを決定した。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

蛍光細胞画像の解析には、ますます多くのフリーソフトウェアツールが利用できます。ユーザーは、問題の複雑さ、画像処理の知識、および分析に費やす時間に応じて適切なソフトウェアを正しく選択する必要があります。アイシー、セルプロファイル、または ImageJ/フィジーは、ユーザビリティと機能性の両方を組み合わせた強力なツール^{です 3}.Icy は、明確なグラフィカルユーザーインターフェイス (GUI) を表示するスタンドアロンツールであり、特にワークフローを簡単に設計または操作できるインターフェイスをクリック^します。このソフトウェアの機能は、ImageJプラグインをサポートし、利用することによって強化され、多くのドキュメントは、ユーザーの大規模なコミュニティのおかげで利用可能です。この強い使いやすさとアイシーソフトウェアの機能性を組み合わせて、Substructure Analyzerのワークフローを開発しました。その主な目的は、複数の画像から細胞蛍光シグナルの完全な分析を行う自動化されたソリューションを提案することです。この解析には、画像の前処理、オブジェクトセグメンテーション、蛍光シグナル分析が含まれます。

いくつかのプロトコルは、Icyのウェブサイト上で感謝して共有され、細胞病巣のような蛍光シグナルを検出し、分析するためにアイシー機能を使用することを提案しています。ただし、これらのプロトコルの中には、1 回の実行で 1 つのイメージしか処理しないものもあれば、特定のファイルに結果をエクスポートしたり、単一のチャネルを分析したりしないものもあります。他の人は、関心領域(ROI)を決定するための予備的なセグメンテーションを含んでいないか、高度にクラスタ化されたオブジェクトのセグメンテーションに適していない「HK手段」のような単純なアルゴリズムを提案します。サブストラクチャアナライザは、画像の前処理から物体のセグメンテーション、蛍光シグナルの検出/分析まで、画像解析のすべてのステップを自動化します。プロトコルはまた、オブジェクトのセグメンテーションとデータのエクスポート(セグメント化されたオブジェクトの名前、病巣分析)の単純またはより複雑な方法を提案し、問題に適応した最適化された出力で実現される。CellProfiler は機能をカプセル化するモジュールで構成される強力なパイプラインも^,^{提案しています}^。利用可能なパイプラインは、特定の問題にうまく適応しています。"氷のワークフロー" は、それぞれ特定のタスクを実行するさまざまなボックスのネットワークです。「プロトコル」インターフェイスを介して、ネットワークを構成するボックスは直感的で操作が容易です。サブ構造アナライザーは、チャネルの単純な結合、2つの細胞内区画間の蛍光シグナル分布の定量化、個々の細胞内の1つまたは2つの細胞区画からの1つまたは複数のチャネルにおける病巣の分析のようないくつかの文脈に適合する。複数のディスプレイを使用すると、各実行中の中間結果を視覚化して処理を制御できます。さらに、Icy はトピックごとにメソッドをグループ化するアイコンバーを表示し、ワークフローで見つかった機能を個別に操作して、イメージセット全体で使用する前に、一部の画像の特定のパラメーターを手動でテストすることができます。

バイオイメージ解析分野と同様に、このプロトコルの最も重要なステップはオブジェクトのセグメンテーションです。このプロトコルは、主オブジェクトのセグメンテーションを提案しますが、これはほとんどの時間セル核であり、また、セル内の第2タイプのオブジェクトをセグメント化するタスクを含む別のブロックも含まれています。核のセグメント化は、オブジェクトが互いに接触または重なるように高度にクラスタ化されている場合に困難になる場合があります。プライマリオブジェクトのセグメンテーションに関するさまざまな選択肢は、高度にクラスタ化されたオブジェクトの完全なセグメンテーションでユニバーサルアルゴリズムが成功していない場合でも、オブジェクトの形状とクラスタリングのレベルに応じて、プロトコルに含まれています。セグメンテーションプロセスは、オブジェクトの一部を正常にセグメント化できるが、別の部分の過小または過剰セグメンテーションにつながる正しいパラメータの決定によって主に制限されます。ユーザーは、異種形状と非凸形状を表すクラスター化されたオブジェクトの場合に特に、最終的な正しいセグメンテーションを得るために、異なるパラメータを使用して異なる実行を実行する必要があります。

このプロトコルは、ほとんどの場合、非常に時間がかかり、最も複雑な場合には強力なコンピュータの構成を必要とするセグメント化手順によって制限されます。より具体的には、より多くのまたは複雑な画像(セグメントへのオブジェクト、画像内のピクセル数が多い)が多いほど、ユーザーが必要とするランダムアクセスメモリ(RAM)が多くなります。グローバルに、問題のある場合は、64ビットのJavaランタイム環境(Java Webサイトで自由に利用できる)でプロトコルを実行し、64ビットオペレーティングシステム(OS)を使用してIcyが使用する利用可能なメモリを増やす必要があります(メモリは32ビットJREの1300 MBに制限されています)。スクリプトが原因で、Mac コンピューター上でプロトコルが正しく動作しません。さらに、問題の複雑化に伴ってパラメータの数が増加し、画像解析でより多くの知識が必要になります。機能基準に関しては、このプロトコルは、Icy がこのタイプのデータを効率的に解析する場合でも、スタック画像(タイムスタック、zスタック)の分析にまだ適応されていません。

今後の更新は、複雑なクラスタ化オブジェクトのセグメンテーションを改善するために特に実現される予定です。不規則な非凸形状を持つクラスター化された細胞構造にセグメンテーションを適応させるために、追加のブロックが開発されます。また、時間とZスタックの解析(ライブイメージングと3Dデータ)のワークフローを適応させます。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

G.H.は、ミニステール・デレジェ・ア・ラ・レシェルシュ・エ・オ・テクノロジーズの大学院フェローシップによって支えられていました。L.H.はロレーヌ研究所(ICL)の大学院フェローシップによって支えられましたが、Q.T.は第2回「投資ダベニール」プログラムFIGHT-HF(参照:ANR-15-RHU457000)の一環としてフランス国家研究庁(ANR)が監督する公的助成金によって支援されました。この作品は、CNRSとロレーヌ大学(UMR 7365)によって資金提供されました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free	Thermo Fisher Scientific	28908	to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-11008	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21425	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A34055	fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA)	euromedex	04-100-812-E
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796-500ml	cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040-5ML	mounting medium
Human: HeLa S3 cells	IGBMC, Strasbourg, France		cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	H1009-100ml	used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668-019	transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin	abcam	ab11822	Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope	Nikon		epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	transfection medium
PBS pH 7.4 (10x)	gibco	70011-036	to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1	Thermo Fisher Scientific	PA1-16565	53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4	Sigma-Aldrich	SAB4200114	EDC4-specific antibody
Triton X-100	Roth	6683	to permeabilize the cells

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References

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Bioengineering

サブ構造アナライザー:蛍光顕微鏡画像における細胞体の迅速な探査と正確な分析のためのユーザフレンドリーなワークフロー

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Protocol

Representative Results

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Acknowledgments

Materials

References

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