Анализатор подструктуры: удобный для пользователя рабочий процесс для быстрого исследования и точного анализа клеточных тел в флуоресценции Микроскопия изображения

Summary

Мы представляем свободно доступный рабочий процесс, построенный для быстрого исследования и точного анализа клеточных тел в конкретных клеточных отсеках в изображениях флуоресценции микроскопии. Этот удобный рабочий процесс разработан на программном обеспечении с открытым исходным кодом Icy, а также использует функции ImageJ. Трубопровод доступен без знания в анализе изображений.

Abstract

Последнее десятилетие характеризовалось прорывами в методах флуоресценции микроскопии, иллюстрируемых улучшением пространственного разрешения, а также в методах визуализации живых клеток и высокопроизводительной микроскопии. Это привело к постоянному увеличению количества и сложности данных микроскопии для одного эксперимента. Поскольку ручной анализ данных микроскопии занимает очень много времени, субъективен и запрещает количественный анализ, автоматизация анализа биоизображений становится почти неизбежной. Мы создали информационный рабочий процесс под названием Substructure Analyzer, чтобы полностью автоматизировать анализ сигналов в биоизображениях из флуоресцентной микроскопии. Этот рабочий процесс разработан на удобной для пользователя платформе с открытым исходным кодом Icy и завершается функциональными работами от ImageJ. Она включает в себя предварительную обработку изображений для улучшения соотношения сигнала к шуму, индивидуальную сегментацию клеток (обнаружение границ клеток) и обнаружение/количественное число тел клеток, обогащенных определенными отсеками клеток. Основным преимуществом этого рабочего процесса является предложение сложных функций биовизионства пользователям без опыта анализа изображений через удобный интерфейс. Кроме того, он является высоко модульным и адаптирован к нескольким вопросам от характеристики ядерного/цитоплазмического транслокации до сравнительного анализа различных клеточных тел в различных клеточных подструктурах. Функциональность этого рабочего процесса иллюстрируется в ходе изучения Cajal (спиральный) органов в условиях окислительного стресса (ОС). Данные флуоресценции микроскопии показывают, что их целостность в клетках человека влияет через несколько часов после индукции ОС. Этот эффект характеризуется уменьшением ядра катина в характерные Каджаальные тела, связанное с нуклеоплазматическим перераспределением катина в увеличенное число меньших очагов. Центральная роль катушкина в обмене между компонентами CB и окружающей нуклеоплазмой предполагает, что индуцированное распространение катушки может повлиять на состав и функциональность Cajal Bodies.

Introduction

Легкая микроскопия и, в частности, флуоресценция микроскопии являются надежными и универсальными методами, обычно используемыми в биологических науках. Они дают доступ к точной локализации различных биомолекул, таких как белки или РНК, через их специфическую флуоресцентную маркировку. Последнее десятилетие характеризовалось быстрыми достижениями в области микроскопии и технологий визуализации, о чем свидетельствует Нобелевская премия по химии 2014 года, присужденная Эрику Бетцигу, Стефану У. Аду и Уильяму Е. Мёрнеру за разработку суперрешенной флуоресценции микроскопии (SRFM)¹. SFRM обходит предел дифракции традиционной оптической микроскопии, чтобы привести его в наноимень. Улучшение таких методов, как live-imaging или подходы к скринингу высокой пропускной способности, также увеличивает количество и сложность данных для лечения каждого эксперимента. Большую часть времени исследователи сталкиваются с высокой неоднородной популяции клеток и хотят анализировать фенотипы на одноклеточном уровне.

Первоначально, анализы, такие как подсчет очагов были выполнены глазом, который предпочитается некоторыми исследователями, поскольку он обеспечивает полный визуальный контроль над процессом подсчета. Тем не менее, ручной анализ таких данных является слишком трудоемким, приводит к изменчивости между наблюдателями, и не дает доступа к более сложным функциям, так что компьютерные подходы становятся широко используемыми и почти^{неизбежными 2}. Методы информатизации bioimage существенно повышают эффективность анализа данных и свободны от неизбежной субъективности оператора и потенциальной предвзятости ручного анализа подсчета. Повышенный спрос в этой области и совершенствование вычислительной мощности привели к разработке большого количества платформ анализа изображений. Некоторые из них находятся в свободном доступе и предоставляют доступ к различным инструментам для проведения анализа с помощью персональных компьютеров. Классификация инструментов открытого доступа была недавно создана³ и представляет Icy⁴ как мощное программное обеспечение, сочетающее удобство использования и функциональность. Кроме того, Icy имеет преимущество общения с ImageJ.

Для пользователей без экспертизы анализа изображений, основные препятствия, чтобы выбрать соответствующий инструмент в соответствии с проблематичным и правильно настроить параметры, которые часто не очень хорошо понимают. Кроме того, время установки часто длинные. Icy предлагает удобный интерфейс «Протоколы» для разработки рабочего процесса, объединив некоторые плагины, найденные в исчерпывающей коллекции^4. Гибкая модульная конструкция и интерфейс точки и щелчка делают настройку анализа возможной для непрограммистов. Здесь мы представляем рабочий процесс под названием Substructure Analyzer,разработанный в интерфейсе Icy, функция которого заключается в анализе флуоресцентных сигналов в конкретных сотовых отсеках и измерении различных функций, таких как яркость, число очагов, размер очагов и пространственное распределение. Этот рабочий процесс решает несколько вопросов, таких как количественная оценка транслокации сигнала, анализ трансфицированных клеток, выражающих флуоресцентный репортер, или анализ очагов из различных клеточных подструктур в отдельных клетках. Это позволяет одновременно обрабатывать несколько изображений, а результаты вывода экспортируются в таблицу, делимитированную в вкладке, которая может быть открыта в часто используемых программах электронных таблиц.

Конвейер Substructure Analyzer представлен на рисунке 1. Во-первых, все изображения, содержащиеся в указанной папке, предварительно обработаны для улучшения их соотношения сигнала к шуму. Этот шаг повышает эффективность следующих шагов и уменьшает время работы. Затем идентифицируются и сегментируются регионы интересов (ROIs), соответствующие области изображения, где должен быть обнаружен флуоресцентный сигнал. Наконец, анализируется флуоресцентный сигнал, и результаты экспортируются в таблицу, делимитированную в вкладке.

Сегментация объектов (обнаружение границ) является наиболее сложным шагом в анализе изображений, и его эффективность определяет точность полученных измерений клеток. Первые объекты, идентифицированные на изображении (так называемые первичные объекты), часто являются ядрами из изображений, окрашенных ДНК (DAPI или Hoechst окрашивания), хотя основными объектами также могут быть целые клетки, бусы, пятнышки, опухоли, или любой другой окрашенных объектов. В большинстве биологических изображений клетки или ядра прикасаются друг к другу или перекрываются, вызывая сбой простых и быстрых алгоритмов. На сегодняшний день ни один универсальный алгоритм не может выполнить идеальную сегментацию всех объектов, в основном потому, что их характеристики (размер, форма или текстура) модулируют эффективность сегментации^5. Инструменты сегментации, широко распространяемые с помощью программного обеспечения микроскопии (например, программное обеспечение MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices⁶, или NIS-Elements Advances Research Software от Nikon^7),как правило, основаны на стандартных методах, таких как корреляция, пороговые или морфологические операции. Хотя эти методы чрезмерно обобщенных методов эффективны в своих основных системах, они быстро обувкут ограничения при использовании в более сложных и специфических условиях. Действительно, сегментация очень чувствительна к экспериментальным параметрам, таким как тип клеток, плотность клеток или биомаркеры, и часто требует повторной корректировки для большого набора данных. Рабочий процесс Substructure Analyzer интегрирует как простые, так и более сложные алгоритмы, чтобы предложить различные альтернативы, адаптированные к сложности изображения и потребностям пользователей. Он, в частности, предлагает маркер основе водораздела алгоритм⁸ для высокогруппиборированных объектов. Эффективность этого метода сегментации зависит от выбора отдельных маркеров на каждом объекте. Эти маркеры вручную выбираются большую часть времени, чтобы получить правильные параметры для полной сегментации, что очень много времени, когда пользователи сталкиваются с большим количеством объектов. Подструктурный анализатор предлагает автоматическое обнаружение этих маркеров, обеспечивая высокоэффективный процесс сегментации. Сегментация в большинстве случаев является ограничивающим этапом анализа изображений и может значительно изменять время обработки в зависимости от разрешения изображения, количества объектов на изображение и уровня кластеризации объектов. Типичные трубопроводы требуют от нескольких секунд до 5 минут на изображение на стандартном настольном компьютере. Анализ более сложных изображений может потребовать более мощного компьютера и некоторых базовых знаний в анализе изображений.

Гибкость и функциональность этого рабочего процесса иллюстрируются различными примерами в репрезентативных результатах. Преимущества этого рабочего процесса особенно проявляются в изучении ядерных подструктур в условиях окислительного стресса (ОС). ОС соответствует дисбалансу редокса гомеостаза в пользу окислителей и связана с высоким уровнем реактивных видов кислорода (ROS). Так как ROS выступает в качестве сигнальных молекул, изменения в их концентрации и субклеточной локализации влияют положительно или отрицательно множество путей и сетей, которые регулируют физиологические функции, в том числе трансдукции сигнала, механизмы ремонта, экспрессия генов, гибель клеток, и пролиферация^9,10. Таким образом, ОС непосредственно участвует в различных патологиях (нейродегенеративных и сердечно-сосудистых заболеваний, рака, диабета и т.д.), но и клеточного старения. Поэтому расшифровка последствий ОС для организации и функции человеческой клетки представляет собой важнейший шаг в понимании роли ОС в наступлении и развитии патологий человека. Установлено, что ОС регулирует экспрессию генов, модулируя транскрипцию через несколько транскрипционных факторов (p53, Nrf2, FOXO3A)^11,но также, влияя на регулирование нескольких со-и пост-транскрипционных процессов, таких как альтернативное сплайсирование (AS) предварительно РНК^12,,13,,14. Альтернативное сращивание первичных кодирования и некодирующих стенограмм является важным механизмом, который увеличивает способность кодирования геномов, производя трансформы транскрипта. AS выполняется огромный комплекс рибонуклеопротеинов называется сплайсесома, содержащий почти 300 белков и 5 U-богатых малых ядерных РНК (UsnRNAs)¹⁵. Спласиосомная сборка и AS жестко контролируются в клетках, и некоторые этапы созревания сплайсесомы происходят в мембранных менее ядерных отсеках под названием Cajal Bodies. Эти ядерные подструктуры характеризуются динамическим характером их структуры и их составом, которые в основном проводятся многовалентными взаимодействиями их РНК и белковых компонентов с белком катушкина. Анализ тысяч клеток с помощью рабочего процесса Substructure Analyzer позволил охарактеризовать никогда не описанные эффекты ОС на телах Cajal. Действительно, полученные данные свидетельствуют о том, что ОС изменяет нуклеацию Cajal органов, вызывая нуклеоплазмического перераспределения белка coilin в многочисленных небольших ядерных очагов. Такое изменение структуры Cajal органов может повлиять на созревание сращивания и участвовать в модуляции AS ОС.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Удобные для пользователя учебники доступны на веб-сайте Icy http://icy.bioimageanalysis.org.

1. Скачать icy и протокол анализа подструктур

1. Скачать Icy с сайта Icy(http://icy.bioimageanalysis.org/download) и скачать протокол Подструктуры Анализатор: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании 64-разрядной ОС, не забудьте использовать 64-битную версию Java. Эта версия позволяет увеличить память, выделенную icy(Предпочтения Общие Макс памяти).

2. Открытие протокола

1. Откройте Icy и нажмите на инструменты в меню Ленты.
2. Нажмите на Протоколы, чтобы открыть интерфейс редактора протоколов.
3. Нажмите на нагрузку и откройте протокол Анализатор подструктуры. Загрузка протокола может занять несколько секунд. Убедитесь, что открытие протокола завершено перед его использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс состоит из 13 общих блоков, представленных на рисунке 2a. Каждый блок работает как конвейер, состоящий из нескольких коробок, выполняющих определенные подзадаки.

3. Взаимодействие с рабочим процессом на icy

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый блок или поле пронумерованы и имеет определенный ранг в рабочем процессе(рисунок 2b). При нажатии на этот номер, ближайшее возможное положение к первому присваивается выбранному блоку/коробке, затем повторно организовано положение других блоков/коробок. Уважайте правильный порядок блоков при подготовке рабочего процесса. Например, блоку Spot Detector нужны заранее определенные РОЛИ, чтобы блоки сегментации должны были работать до блоков Spot Detector. Не изменяйте положение коробок. Не используйте "." в названии изображения.

1. Нажав на верхний левый значок угла, обрушиться, расширить, увеличить, сузить, или удалить блок (Рисунок 2b).
2. Каждый конвейер рабочего процесса характеризуется сетью коробок, соединенных через их вход и выход(рисунок 2b). Чтобы создать соединение, нажмите на выход и поддерживайте до тех пор, пока курсор не достигнет ввода. Соединения могут быть удалены, нажав на тег выход.

4. Слияние каналов изображения

1. Используйте каналы слияния блока для создания объединенных изображений. При необходимости переименуйтесь в файлы таким образом, чтобы последовательности, которые должны быть объединены, имели один и тот же приставку с именем, за которой следовал отдельный сепаратор. Например, называются последовательности отдельных каналов из изображения А: ImageA_red, ImageA_blue.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для сепаратора не используйте символы, уже присутствующие в названии изображения.
2. В той же папке создайте одну новую папку для слияния. Например, чтобы объединить красные, зеленые и синие каналы, создать 3 папки и хранить соответствующие последовательности в этих папках.
3. Используйте только каналы слиянияблока, удалите другие блоки и сохраните протокол как каналы слияния.
   1. Доступ к ящикам для установки параметров. Для каждого канала заполните коробки Номер X (коробки 1, 5 или 9), Folder номер канала X (коробки 2, 6 или 10), сепараторный номер канала X (коробки 3, 7 или 11) и Colormap канал nb X (коробки 4, 8 и 12) соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти коробки горизонтально сгруппированы по четыре, каждая строка соответствует тому же каналу. В каждой строке также доступен дисплей (коробки 23, 24 или 25) для непосредственной визуализации последовательности соответствующего канала.
      1. В поле Номер канала X, выберите, какой канал извлечь (в классических изображениях RGB, 0'Red, 1'Зеленый, 2'Синий). Пользователь быстро получает доступ к различным каналам изображения в окне инспектора Icy, во вкладке Sequence. Напишите значение наименьшего канала в верхней линии и наивысшее в нижней строке.
      2. В коробке Folder номер канала X, напишите «Имя папки, содержащей изображения канала X.
      3. В поле Separator номер канала X,напишите сепаратор, используемый для имени изображения (в предыдущем примере: "_red", "_green" и "_blue").
      4. В коробке Colormap канал nb X, указать с числом, какие colormap модель использовать для визуализации соответствующего канала в icy. Доступные цветные карты видны во вкладке Sequence из окна "Инспектор".
      5. В поле Формат объединенных изображений (коробка 28) напишите расширение для сохранения объединенных изображений: .tif, .gif, .jpg, .bmp или .png.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы объединить только 2 канала, не заполняйте четыре коробки, соответствующие третьему каналу.
   2. В левом верхнем углу блока Merge Channels нажмите на ссылку прямо справа от Folder. В открытом диалоговом окне, которое появляется, дважды нажмите на папку, содержащую последовательности первого канала, которые были определены в поле Folder канал номер 1 (коробка 2). Затем нажмите на Open.
   3. Выполнить протокол, нажав на черную стрелку в левом верхнем углу блока Merge Channels (подробнее см. часть 7). Слитые изображения сохраняются в папке Слияние в том же каталоге, что и папки отдельных каналов.

5. Сегментация регионов, представляющих интерес

ПРИМЕЧАНИЕ: Подструктурный анализатор интегрирует как простые, так и более сложные алгоритмы, чтобы предложить различные альтернативы, адаптированные к сложности изображения и потребностям пользователей.

1. Выберите адаптированный блок.
   1. Если объекты не касаются друг друга, или пользователю не нужно дифференцировать кластерные объекты индивидуально, используйте блок сегментации A: Нерасгруппированные объекты.
   2. Когда объекты не касаются друг друга, но некоторые из них близки, используйте блок Сегментации B: Плохо сгруппированные объекты.
   3. Для объектов с высоким уровнем кластеризации и выпуклой формой используйте блок Сегментации C: Кластерные объекты с выпуклыми формами.
   4. Если объекты представляют высокий уровень кластеризации и имеют нерегулярные формы, используйте блок Сегментации D: Кластерные объекты с нерегулярными формами.
   5. Используйте блок сегментации E: кластерная цитоплазма для сегмента касаясь цитоплазм индивидуально, используя сегментированные ядра в качестве маркеров. Этот блок необходимо сегментированных ядер для обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Блоки, адаптированные для процесса сегментации первичных объектов независимо, так что несколько блоков могут быть использованы в одном и том же запуске для сравнения их эффективности для определенной подструктуры или сегментации различных типов подструктур. Если уровень кластеризации неоднороден в одном наборе изображений, то обработайте небольшие и сильно сгруппированные объекты отдельно в адаптированных блоках.
2. Свяжите выходной0 (файл) блока Select Folder с вводом папок выбранного блока сегментации.
3. Установите параметры выбранного блока сегментации.
   1. Сегментация A: Негруппиугольные объекты и сегментация C: Кластерные объекты с выпуклыми формами
      1. В коробке канал сигнала (коробка 1), установите канал объектов к сегменту.
      2. В качестве опции, в коробке Гауссианский фильтр (коробка 2), увеличить X и Y сигма значения, если сигнал внутри объектов является неоднородным. Гауссианский фильтр сглаживает текстуры для получения более однородных областей и повышает скорость и эффективность сегментации ядер. Чем меньше объекты, тем ниже значение сигмы. Избегайте высоких значений сигмы. Установите значения по умолчанию до 0.
      3. В коробке HK-Means (коробка 3) установлен параметр классов интенсивности и приблизительные минимальные и максимальные размеры (в пикселях) объектов, которые необходимо обнаружить.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для классов интенсивности значение 2 классифицирует пиксели в 2 классах: фон и передний план. Таким образом, он адаптируется, когда контраст между объектами и фоном высок. Если объекты переднего плана имеют различную интенсивность или если контраст с фоном низок, увеличьте количество классов. Параметр по умолчанию 2. Размер объекта можно быстро оценить, вручную нарисовав рентабельность инвестиций вокруг объекта, представляющий интерес. Размер рентабельности инвестиций (Interior in pixels) отображается непосредственно на изображении при указании на курсор или может быть доступ к нему в окне статистики рентабельности инвестиций (откройте его из панели поиска). Оптимальные параметры определяют каждый объект переднего плана в одном рентабельностиинвестиций. Они могут быть определены вручную в Icy(Обнаружение и отслеживание | HK-Means).
      4. В коробке Active Contours (коробка 4) оптимизируют обнаружение границ объектов. Исчерпывающая документация для этого плагина доступна в Интернете: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. Правильные параметры также могут быть определены вручную в Icy(Обнаружение и отслеживание | Активные контуры).
      5. Во время процесса автоматически создается папка для сохранения изображений сегментированных объектов. В поле Текст (коробка 6), назовите эту папку (на имя: Сегментированные ядра). Чтобы установить формат для сохранения изображений сегментированных объектов (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG), заполните формат коробки изображений сегментированных объектов. Папка создается в папке, содержащей объединенные изображения.
      6. Запустите рабочий процесс (для получения подробной информации см. часть 7).
   2. Сегментация B: Плохо сгруппированные объекты
      1. Следуйте тем же шагам, что и в 5.3.1, чтобы установить параметры коробок сигнала канала, HK-Means, Активные Контуры,Расширение для сохранения сегментированных объектов и текст (боксы не такие, как в шаге 5.3.1).
      2. В коробке Call IJ плагин (коробка 4), установите параметр Rolling для управления фоновой вычитания. Установите этот параметр, по крайней мере, размер самого большого объекта, который не является частью фона. Снижение этого значения увеличивает удаление фона, но может также вызвать потерю сигнала переднего плана.
      3. В коробке Адаптивная гистограмма выравнивания (коробка 6), улучшить контрасты между объектами переднего плана и фоном. Увеличение наклона дает более контрастные последовательности.
      4. Запустите рабочий процесс (для получения подробной информации см. часть 7).
   3. Сегментация D: Кластерные объекты с нерегулярными формами
      ПРИМЕЧАНИЕ: К каждому изображению применяются три различных метода сегментации: во-первых,кластеризация HK-средствв сочетании сМетод активных контуровприменяется. Затемклассический алгоритм водораздела(с помощью карты расстояния Евклидов) применяется к ранее неправильно сегментированных объектов. Наконец,маркер основе водораздела алгоритмиспользуется. Только HK-средства и методы водораздела на основе маркеров нуждаются в вмешательстве пользователей. Для обоих методов одинаковые параметры могут быть применены ко всем изображениям (полностью автоматизированная версия) или изменены для каждого изображения (полуавтоматизированная версия). Если пользователь не обучен этим методам сегментации, рекомендуется полуавтоматическая обработка. При обработке этого блока требуется ручное вмешательство. Когда метод сегментации завершен, пользователь должен вручную удалить неправильно сегментированные объекты до начала следующего метода сегментации. Успешно сегментированные объекты сохраняются и не учитываются на следующем этапе. Этот блок должен быть подключен к блокуКластерные/неоднородные формы первичных объектов сегментации Dialog Boxправильно работать.
      1. Скачать коллекцию ImageJ MorphoLibJ на https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. В этом протоколе используется версия MorphoLibJ 1.4.0. Поместите файл MorphoLibJ_-1.4.0.jar в папку ледяной / ij /plugins. Более подробная информация о содержании этой коллекции доступна на https://imagej.net/MorphoLibJ.
      2. Следуйте тем же шагам, что и в шаге 5.3.1, чтобы установить параметры коробок сигнала канала, гауссианского фильтра, Активных Контуров, Расширения для сохранения сегментированных объектов и текста. Боксы не такие, как в шаге 5.3.1.
      3. Установить параметры выравнивания адаптивной гистограммы коробки (см. шаг 5.3.2.3).
      4. Чтобы активировать вычитаемый фон, напишите да в Apply Subtract Background? (коробка 5). В противном случае, написать Нет. Если плагин активирован, установите скользящий параметр (см. шаг 5.3.2), в поле Вычесть фоновый параметр (коробка 7).
      5. Автоматизация HK-средств: Для применения одинаковых параметров для всех изображений (полностью автоматизированная обработка) установите Nb классов (коробка 11), минимальный размер (коробка 12) и максимальный размер (box13) (см. шаг 5.3.1). Эти параметры должны быть установлены для выбора максимум пикселей переднего плана и оптимизации индивидуализации объектов переднего плана. Для полуавтоматической версии обработки вмешательство не требуется.
      6. Автоматизация извлечения маркеров: для полностью автоматизированной версии расширьте коробку извлечения внутренних маркеров (коробка 27) и установите значение «динамического» параметра в строке 13 скрипта. Для полуавтоматической версии обработки вмешательство не требуется.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Маркеры извлекаются путем применения трансформации расширенного минимы на входном изображении, контролируемом "динамическим" параметром. В алгоритме водораздела на основе маркеров для сегментации объектов моделируется затопление этих маркеров. Для успешной сегментации объектов переднего плана необходимо извлечь один маркер на один объект переднего плана. Установка «динамического» параметра для извлечения оптимальных маркеров зависит в основном от разрешения изображений. Таким образом, если не знаком с этим параметром, используйте полуавтоматическую версию.
      7. Запустите рабочий процесс (для получения подробной информации см. часть 7).
      8. В начале обработки, диалоговые окна HK-означает параметры и маркер основе водораздела последовательно открыты. Чтобы применить одинаковые параметры для всех изображений (полностью автоматизированная версия), нажмите на ДА. В противном случае, нажмите на НЕТ. Открывается информационный ящик с просьбой "Определить оптимальные РОВ с помощью плагина HK-Means и закрыть изображение". Нажмите на OK и вручную применить плагин HK-Means(Обнаружение и отслеживание| HK-Средства) на изображении, которое автоматически открывается. Выберите опцию Export ROIs в коробке плагина HK-Means. Примените лучшие параметры, чтобы иметь РОУ, содержащий максимум пикселей переднего плана, и оптимизировать индивидуализацию объектов переднего плана. При обнаружении оптимального ПИС непосредственно закройте изображение.
      9. В конце первого метода сегментации открывается информационный ящик, который просит "удалить нежелательные РОЛИ и закрыть изображение". Эти ROIs соответствуют границам сегментированных объектов. Выберите OK и удалите RO-Образ неправильно сегментированные объекты на изображении, которое автоматически открывается. Рентабельность инвестиций может быть легко удалена, разместив курсор на своей границе и используя кнопку "Удалить" клавиатуры. Закройте изображение. Повторите ту же процедуру после завершения второго шага сегментации.
      10. На этом этапе, если кнопка ДА была выбрана для полной автоматизации алгоритма водораздела на основе маркера, ранее установленные параметры будут применяться ко всем изображениям.
      11. Если кнопка NO была выбрана, открывается информационный ящик с просьбой "определить и настроить внутренние маркеры". Нажмите на OK и в интерфейсе ImageJ Icy, перейдите на Plugins | МорфоЛибДж Минима и Максима| Расширенный Мин и Макс. В операции выберите Extended Minima.
      12. Выберите Предварительный просмотр для предварительной визуализации на автоматически открытом изображении в результате преобразования. Перемещение динамической до тех пор, пока не будут наблюдаться оптимальные маркеры. Маркеры представляют собой группы пикселей значением 255 (не обязательно белые пиксели). Оптимальные параметры приводят к одному маркеру на каждый объект. Сосредоточьтесь на остальных объектах, которые не были хорошо сегментированы двумя предыдущими методами сегментации.
      13. При необходимости улучшайте маркеры, применяя дополнительные морфологические операции, такие как "Открытие" или "Закрытие"(Plugins) | МорфоЛибДж Морфологические фильтры). При получении окончательного изображения маркеров, держать его открытым и закрыть все другие изображения, заканчивающиеся с изображением, первоначально используемым в качестве ввода для расширенной операции Minima. Нажмите на кнопку "Нет", если поле ImageJ просит сохранить изменения на этом изображении.
      14. В поле Nb изображений с информационным ящиком (коробка 14), определить, сколько изображений с информационными ящиками должно появиться.
   4. Сегментация E: Кластерная цитоплазма
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот блок использует ранее сегментированные ядра в качестве индивидуальных маркеров для инициирования сегментации цитоплазмы. Убедитесь, что блок сегментации ядер обработал перед его использованием.
      1. В коробке канала цитоплазмы (коробка 1), установить канал цитоплазмического сигнала.
      2. В коробке Расширение сегментированных ядер (коробка 2), напишите формат, используемый для сохранения изображений сегментированных ядер (tif, jpeg, bmp, png). Формат по умолчанию является tif.
      3. В поле Текст (box3), напишите «Имя папки, содержащей сегментированные ядра.
      4. В коробке Формат изображений сегментированных цитоплазм (коробка 4) устанавливает формат использования для сохранения сегментированных объектов изображений (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG).
      5. Во время процесса автоматически создается папка для сохранения изображений сегментированных цитоплазм. В поле Текст (коробка 5), назовите эту папку (на имя: Сегментированные цитоплазмы). Папка создается в папке, содержащей объединенные изображения.
      6. Следуйте тем же шагам, что и в шаге 5.3.1, чтобы установить параметры коробок гауссианского фильтра и активных контуров (Будьте осторожны, ряды коробок не такие, как в шаге 5.3.1).
      7. Запустите рабочий процесс (для получения подробной информации см. часть 7).

6. Обнаружение и анализ флуоресцентных сигналов

1. Выберите адаптированный блок.
   1. В блоке Флуоресценция Анализ A: 1 канал, выполнять обнаружение и анализ очагов в одном канале внутри одного типа сегментированного объекта: обнаружение катина foci (красный канал) в ядре.
   2. В блоке Флуоресценция Анализ B: 2 каналы в том же отсеке, выполнять обнаружение и анализ очагов в двух каналах внутри одного типа сегментированного объекта: обнаружение coilin (красный канал) и 53BP1 (зеленый канал) foci в ядре.
   3. В блоке Флуоресценция Анализ C: 2 каналы в двух отсеках, выполнить обнаружение и анализ очагов в одном или двух каналах, в частности внутри ядер и их соответствующих цитоплазмы: обнаружение Coilin foci (красный канал) как внутри ядра и его соответствующей цитоплазмы или обнаружения Coilin foci (красный канал) в пределах ядра и G3BP foci (зеленый канал) в пределах соответствующего цитоplasm.
   4. В блоке Флуоресценция Анализ D: Глобальная транслокация, рассчитать процент сигнала от одного канала в двух сотовых отсеках (a и b). Например, в анализе транслокации цитоплазмы/ядра экспорт рассчитывает проценты ядерных и цитоплазматических сигналов для каждого изображения в окончательной таблице "Результаты". Формула, используемая для расчета процента ядерного сигнала, показана ниже. Этот блок может быть использован для любого подклеточного отсека:
      
   5. В блоке Флуоресценция Анализ E: Индивидуальная транслокация клеток, рассчитать процент сигнала от одного канала в двух сотовых отсеков для каждой клетки. Этот блок специально оптимизирован для анализа транслокации ядра/цитоплазмы на одноклеточном уровне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку блок флуоресценции Анализ E: Индивидуальная транслокация клеток выполняет анализ на одноклеточном уровне, необходима эффективная сегментация ядра и цитоплазмы.
2. Свяжите выходной0 (файл) блока Select Folder (блок 1) с вводом папок (белые стрелки в черных кругах) выбранного блока.
3. Установите параметры выбранного блока.
   1. Анализ флуоресценции A: 1 канал, анализ флуоресценции B: 2 канала в одном отсеке и анализ флуоресценции C: 2 канала в 2 отсеках
      1. В коробке Folder изображения ROI, написать название папки, содержащей изображения сегментированных объектов, предшествующих backslash. (Например: «Сегментированные ядра» (сегментированные ядра).
      2. В поле Формат изображений сегментированных объектов (коробка 2), напишите формат, используемый для сохранения изображений сегментированных объектов (tif, jpeg, bmp, png). Формат по умолчанию является tif.
      3. В коробке Kill Borders?, напишите Да, чтобы удалить пограничные объекты. В противном случае, написать Нет. Для использования этой функции требуется установка коллекции MorphoLibJ ImageJ (см. шаг 5.3.3).
      4. В поле (es) канал пятна сигнала,установить канал, где пятна должны быть обнаружены. В классических изображениях RGB, 0'Red, 1'Зеленый, и 2'Синий.
      5. В коробках Название локализованной молекулы,напишите название молекулы локализации в пятна. Количество полей для ввода зависит от количества молекул.
      6. В поле (es) Блок детектора Wavelet Spot,установите параметры обнаружения места для каждого канала. Установите шкалу (ы) (относится к размеру пятна) и чувствительность обнаружения (меньшая чувствительность уменьшает количество обнаруженных пятен, значение по умолчанию 100 и минимальное значение 0). Исчерпывающая документация этого плагина доступна в Интернете: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. Параметры также могут быть определены вручную в Icy(Обнаружение и отслеживание | Точечный детектор).
      7. В качестве опции в коробке фильтр ROI по размеруфильтр отфильтровы к фильтруют сегментированные объекты, где обнаруживаются пятна, устанавливая интервал размера (в пикселях). Этот шаг особенно полезен для удаления под-или чрезмерно сегментированных объектов. Чтобы вручную оценить размер объектов, см. шаг 5.3.1. Параметры по умолчанию не включают фильтрацию ROIs по размеру. Блок 2 каналов в двух отсеках содержит две коробки: ядра фильтра по размеру (коробка 19) и цитоплазма фильтра по размеру (коробка 46).
      8. Дополнительно, в коробке Фильтр пятна по размеру, фильтруют обнаруженные пятна в зависимости от их размера (в пикселях) для удаления нежелательных артефактов. Чтобы вручную оценить размер места, нажмите на обнаружение и отслеживание и откройте плагин детектора Spot. В вариантах вывода выберите Export to ROI. Будьте осторожны, чтобы параметры по умолчанию не включали фильтрацию пятен по размеру и чтобы фильтрованные пятна не учитывались при анализе. Количество полей для ввода зависит от количества каналов.
      9. Дополнительно, в коробке фильтр пятна,нанесите дополнительный фильтр (контраст, однородность, периметр, округлость) на обнаруженных пятен. Будьте осторожны, чтобы параметры по умолчанию не включали фильтрацию точек и чтобы фильтрованные пятна не учитывались при анализе. Количество полей для ввода зависит от количества каналов.
      10. Дополнительно, в коробках Spot порог размера,установить порог для области (в пикселях) анализируемых пятен. Количество подсчитанных пятен ниже и выше этого порога экспортируется в таблице окончательных результатов. Количество ящиков, которые должны быть информированы зависит от количества каналов.
      11. Запустите рабочий процесс (для получения подробной информации см. часть 7). Данные экспортируются в таблицу Результаты, сохраненную в папке, содержащей объединенные изображения.
   2. Анализ флуоресценции D: Глобальный транслокационный и флуоресценционный анализ E: Индивидуальная транслокация клеток:
      1. В коробках Folder изображения (коробки 1 и 2), написать "Имя папки, содержащей изображения сегментированных объектов. В блоке Флуоресценция Анализ D: Глобальная транслокация, два типа рентабельности инвестиций определяются как рентабельность инвестиций и рентабельность инвестиций b. Для блока Флуоресценция Анализ E: Индивидуальная транслокация клеток, в Folder изображения сегментированных ядер и Folder изображения сегментированных цитоплазм коробки, написать название папки, содержащей сегментированные ядра и цитоплазмы, соответственно.
      2. В поле канал сигнала (коробка 3), введите канал сигнала.
      3. В поле Формат изображений сегментированных объектов (коробка 4), напишите формат, используемый для сохранения изображений сегментированных объектов (tif, jpeg, bmp, png). Формат по умолчанию является tif. Опция Kill Borders также доступна для удаления пограничных объектов (см. шаг 6.3.1).
      4. Дополнительно, в коробках фильтр ROI по размеру,фильтровать сегментированные объекты, установив интервал размера (в пикселях). Этот шаг может быть полезен для удаления объектов с под-или чрезмерно сегментированной. Чтобы вручную оценить размер объекта, см. шаг 5.3.1. Есть два поля для входа, по одному на канал. Параметры по умолчанию не включают фильтрацию рентабельности инвестиций по размеру.
      5. Запустите рабочий процесс (для получения подробной информации см. часть 7). Экспортные данные в электронной таблице Результаты сохранены в папке, содержащей объединенные изображения.

7. Выполнить протокол

1. Чтобы обработать один блок в запуске, удалите соединение между выбранным блоком и блоком Select Folder. Поместите разыскиваемый блок на^1-й ранг. В левом верхнем углу разыскиваемого блока нажмите на ссылку прямо справа от папки. В открытом диалоговом окне, которое появляется, дважды нажмите на папку, содержащую объединенные изображения. Затем нажмите на Open. Нажмите на Run, чтобы начать рабочий процесс. Обработка может быть остановлена, нажав на кнопку "Стоп".
2. Чтобы обработать различные блоки в перспективе, сохраняйте соединения выбранных блоков с блоком Select Folder (блок 1). Убедитесь, что их ранг позволяет хорошую обработку рабочего процесса. Например, если конкретному блоку нужны сегментированные объекты для обработки, убедитесь, что блок сегментации обрабатывается ранее. Перед запуском рабочего процесса удалите неиспользованные блоки и сохраните новый протокол с другим именем.
3. Нажмите на Run, чтобы начать рабочий процесс. Когда появляется открытое диалоговое окно, дважды нажмите на папку, содержащую объединенные изображения. Затем нажмите на Open. Рабочий процесс выполняется автоматически. При необходимости прекратите обработку, нажав на кнопку Stop.
4. В конце обработки проверьте, что сообщение Рабочий процесс успешно появился в нижнем правом углу и что все блоки помечены зеленым знаком(рисунок 2b). Если нет, блок и внутренняя коробка, представляющая знак ошибки, указывают на элемент для исправления(рисунок 2b).
   ПРИМЕЧАНИЕ: После успешного выполнения рабочего процесса новый запуск не может быть запущен напрямую, и для повторной обработки рабочего процесса, по крайней мере один блок должен быть помечен знаком "готов к обработке". Чтобы изменить состояние блока, либо удалите и воссоздайте связь между двумя коробками внутри этого блока, либо просто закройте и вновь откройте протокол. Если ошибка происходит во время обработки, можно начать новый запуск. Во время нового запуска все блоки конвейера обрабатываются, даже если некоторые из них помечены зеленым знаком.

Representative Results

Все описанные анализы были выполнены на стандартном ноутбуке (64-разрядный четырехъядерный процессор на 2,80 ГГц с 16 ГБ памяти случайного доступа (RAM)), работающей с 64-битной версией Java. Память случайного доступа является важным параметром для рассмотрения, в зависимости от количества и разрешения изображений для анализа. Использование 32-битной версии Java ограничивает память примерно 1300 МБ, что может быть непригодено для анализа больших данных, в то время как 64-битная версия позволяет увеличить память, выделенную Icy. На рисунке 3 сообщается о времени, необходимом для сегментации различных типов изображений и различных разрешений. Это подтверждает, что высокое разрешение существенно увеличивает время сегментации основных объектов.

Данные, представленные в следующих абзацах, показывают, что рабочий процесс Substructure Analyzer может быть использован для решения большинства распространенных проблем, возникающих в клеточной и молекулярной биологии (подсчет клеток, подсчет и анализ очагов, анализ транслокации).

Измерение в многочисленных клетках точной доли молекул, сосредоточенных в данном отсеке, или изменение локализации в субклеточных доменах может быть очень громоздкой и подверженной ошибкам задачей, особенно когда она выполняется вручную. Рисунок 4 иллюстрирует способность рабочего процесса быстро и точно количественно оценить хорошо описанную ядерную транслокацию транскрипцио-фактора НФЗБ в ответ на стимуляцию ТНФЗ. Изображения, используемые для анализа были любезно составлены Ильей Равкиным(http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm)и находятся в открытом доступе в коллекции Broad Bioimage Benchmark Collection¹⁶. Этот набор содержит изображения линий клеток MCF7 и A549, обработанных с возрастающей концентрацией TNF. Анализ был выполнен на более чем 40000 ячеек и 96 изображений (48 изображений для каждого канала) от линии клетки MCF7 (Рисунок 4a). Весь анализ (от импорта изображений до сохранения данных) занял 26 минут. Каждое изображение соответствует определенной концентрации TNF. Ядерные/цитоплазматические пропорции НДФЛ были однородными во всех клетках для данного изображения. По этой причине для каждого изображения значения всех ядерных или цитоплазматических пикселей суммировались для расчета ядерных и цитоплазматических пропорций НФБ, а индивидуализация касающихся ядер/цитоплазм во время их сегментации не требовалась. DAPI изображения были обработаны в сегментации C: Кластерные объекты с выпуклыми формами блок сегментировать к сегменту ядер и зеленый канал был использован для разграничения цитоплазм с сегментации E: Кластерный блок цитоплазмы (Рисунок 4b). Анализ флуоресценции D: Глобальный транслокационный блок использовался для экспорта суммы ядерных и цитоплазматических значений пикселей. Полученные данные представлены в кривой дозы-ответной реакции(рисунок 4c)и иллюстрируют увеличение ядерной пропорции НФЗБ после стимуляции с увеличением концентрации ТНФЗ.

Рабочий процесс не только анализирует сигнал глобальной интенсивности в различных подклеточных отсеках, но также может быть использован для обнаружения очагов и извлечения конкретной информации об их особенностях. Рисунок 5a иллюстрирует обнаружение P-тел в отдельных клетках путем локализации усилителя белка мРНК 4 (EDC4). Блок сегментации A: Non clustered объектов был использован для сегментирования ядер, которые представляют низкий уровень кластеризации, сегментации E: Кластерный блок цитоплазмы для разграничения цитоплазм и анализа флуоресценции C: 2 канала в двух отсеках для обнаружения очагов EDC4. Сегментированные объекты идентифицируются (сегментированные nuclei_0, сегментированные cytoplasms_0), и в соответствующий лист собирается несколько данных (Сегментированная информация о ядрах и сегментированная цитоплазма), например средняя интенсивность EDC4 или количество/размер обнаруженных тел в каждом рентабельности инвестиций(рисунок 5b). Перед анализом обнаруженные тела могут быть предварительно отфильтрованы в зависимости от их области, что может быть полезно для исключения объектов ниже разрешения мощности микроскопа. Для оценки размера сохраненных объектов может быть введен дополнительный порог площади. Области всех обнаруженных тел сообщаются в специальных листах (сегментированные nuclei_Distribution размер очага, сегментированные cytoplasms_Distribution размер очагов). В этом примере мы выделяем анализ двух ячеек (сегментированных nuclei_0 and_1 и сегментированных cytoplasm_0 and_1), где обнаружены очаги цитоплазмы EDC4. Обратите внимание, что, хотя сигнал белка EDC4 обнаружен как в ядерном, так и в цитоплазмическом отсеках, только цитоплазматические очаги соответствуют P-телам. Ядерный сигнал, скорее всего, является результатом перекрестной реактивности антитела, используемого для проведения экспериментов иммунофлуоресценции. Определяется размер пикселей каждого из очагов.

Затем, как влияние окислительного стресса (ОС) на Cajal органов по-прежнему неизвестно, мы воспользовались универсальность рабочего процесса для изучения его во время кинетики (2 до 20 часов после индукции ОС с 500 м Ч₂O₂) (Рисунок 6). Cajal тела динамических структур nucleating и растворения в пределах нуклеоплазмы под контролем конкретных параметров, таких как скорость транскрипции или прогрессирование клеточного цикла. Органы каджаля были визуализированы путем локализации их основного структурного и функционального компонента, белка катина. Информация о количестве и размере тел Cajal была собрана путем изучения 2300 отдельных клеток из изображений высокого разрешения (3840X3072), содержащих 3 канала: DAPI (синий), 53BP1 (зеленый) и coilin (красный)(рисунок 6a). Полная обработка заняла менее 1 ч. Поскольку ядра представляли выпуклую форму и некоторые из них были сгруппированы, для выполнения сегментации был выбран блок сегментации C: Кластерные объекты с выпуклыми формами. Как ОС, как известно, вызывают ДНК двойной пряди перерывов (DDSBs), p53-связывающий белок 1 (53BP1), как известно, является важным эффектом повреждения ДНК сигнализации путей, был использован в качестве маркера для дискриминации между подчеркнул и не-напряженных клеток. Действительно, при отсутствии повреждений ДНК 53BP1 однородно распределяется в нуклеоплазме, в то время как после повреждения ДНК он концентрируется на DDSBs, которые образуют легко различимые очаги в микроскопии. Количество и размер как 53BP1 и coilin ядерных очагов в каждой клетке были проанализированы с помощью блока Флуоресценция Анализ B: 2 каналы в том же отсеке. Во-первых, анализ 53BP1 данных помог определить для каждой точки времени кинетики наилучший порог для классификации клеток в соответствии с их стрессовым статусом. Среди всей кинетики, ОС вызывает значительное увеличение числа 53BP1 очагов с 11-кратным увеличением на 2, 4 и 8 ч после индукции ОС (Рисунок S1). Этот эффект менее выражен при 6 ч (6,5 раза) из-за более высокого начального уровня DSB в неотчивных клетках. Даже после 20 ч, устойчивый рост остается (почти в 6 раз). Эти данные отражают эффективность лечения для индуцирования ОС и установить 53BP1 в качестве эффективного стресс-маркера как для ранних, так и поздних наблюдений в микроскопии. С другой стороны, небольшая доля напряженных клеток с низким уровнем DDSBs наблюдалась в каждой точке времени кинетики, что свидетельствует о том, что клетки не однородно подчеркнул, что обеспечивает важность использования маркера стресса в стрессовых экспериментах. На основе анализа РПЦ, общий порог 17 53BP1 foci был выбран для дискриминации между подчеркнул и не подчеркнул клеток по всей кинетики (Рисунок S1).

Затем количество и размер ядерного очага катушкина были проанализированы в соответствии со стрессовым статусом клетки. Значительное увеличение числа очагов наблюдалось 2, 4 и 6 ч после индукции стресса(рисунок 6b). Наиболее устойчивый эффект наблюдается на 2 ч, количество клеток, имеющих более 10 очагов увеличивается с 0% в не подчеркнул клеток до 75% в подчеркнул клеток. Кроме того, более 25% подчеркнул клетки того времени было более 20 катвинового очага. Этот эффект постепенно уменьшается до 8 ч. На 20 ч, небольшое увеличение первого и третьего квартили наблюдается, но данные также показывают, что 84% и 80% клеток присутствуют менее 8 очагов в не-напряженных и подчеркнул клеток, соответственно. Эти данные показывают, что ОС также имеет поздние эффекты на параметры, контролирующие нуклеацию тел Cajal, которые могут отличаться от ранних эффектов. Интересно, что тщательный анализ особенностей coilin ядерного очага показали, что наблюдается увеличение числа катвиновых очагов ассоциируется с уменьшением их размера(рисунок 6c). Например, 2 ч после индукции ОС, доля катвинового фочи с площадью ниже 0,2 мкм² увеличивается с 26% до 64%. Этот эффект уменьшается до 8 ч, но, в отличие от числа Cajal органов, никаких существенных изменений не наблюдается на 20 ч. Это может отражать, что раннее и позднее нуклеоплазмическое перераспределение Каялских Тел являются различными событиями.

Altogether эти данные сильно предлагают что OS изменяет силу ядра Cajal тел, вызывая нуклеоплазмическое перераспределение в многочисленнNp более малые ядерные foci. Поскольку нуклеация Cajal органов определяется их белков и РНК компонентов, это предполагает, что эффект ОС может изменить состав Cajal органов. В Cajal органов, белок coilin взаимодействует с несколькими различными партнерами белка, таких как компоненты комплекса SMN и Sm белков. Эти взаимодействия часто участвуют фосфодомейны coilin, и можно себе представить, что изменение структуры Cajal органов может быть связано с изменениями в статусе фосфорилирования катушкина. Кроме того, последние работы показали, что Cajal органов не случайно локализованы в ядре, и может повлиять на экспрессию генов через проксимальную связь с конкретными генами локусов¹⁷. Учитывая все эти факты, неудивительно, что влияние на функциональность органов Cajal будет сопровождать изменения в их структуре. Из этих результатов, мы также можем спросить, если такие Cajal органов 'ремоделирование является пассивным следствием ОС или участвует в ответе, взаимодействуя с конкретными генами локусов, например.

Чтобы проверить, может ли изменение экспрессии катина изменить его локализацию и изменить нуклеацию тел Cajal, мы переэкспрессии экзогенного белка синтеза GFP-coilin. Ядра не были сгруппированы, поэтому сегментация была выполнена с блок-сегментации A: Нерасгруппированные объекты. Затем, чтобы точно количественно количество и размер катвинового очага (красный сигнал, канал 1) в зависимости от уровня GFP-coilin (зеленый сигнал, канал 2) переэкспрессия, блок Флуоресценция Анализ B: 2 каналы в том же отсеке был использован. Уровень GFP-coilin был отражен средней интенсивностью сигнала GFP в отдельномядре (рисунок 7a). В клетках со средним или высоким уровнем переэкспрессии GFP-coilin (интенсивность GFP выше 10), количество Cajal органов на ядро значительно увеличивается с некоторыми ядрами отображения до 21 foci (Рисунок 7b). Мы также заметили, что яркость (средняя интенсивность) Cajal органов значительно увеличивается параллельно с уровнем переэкспрессии, что приводит к насыщенности интенсивности. Таким образом, такие насыщенные области могут замаскировать наличие более мелких и слабых очагов. В клетках, переэкспрессионных средний или высокий уровень GFP-coilin, размер Cajal органов также значительно увеличивается, медианные значения растет от 1 до 2 мкм² (Рисунок 7c). Кроме того, более 25% клеток с высоким уровнем экспрессии GFP-coilin присутствуют очаги с площадью более 2,5 мкм^2,в то время как в нетрансинфицированных клетках он никогда не превышает 0,8 мкм^2. В заключение, переэкспрессия GFP-Coilin приводит к значительному увеличению как количества, так и размера органов Каджала. Поскольку ОС увеличивает количество Cajal органов, но уменьшает их размер, эти данные могут отражать, что влияние ОС на структуру Cajal органов, скорее всего, вызвано изменением их состава, а не влияние на клеточное количество coilin.

Рисунок 1: Конвейер анализатора подструктуры
Рабочий процесс разработан в Icy, открытой платформе сообщества для биоизображения информатики, и выполняет автоматический анализ нескольких изображений флуоресценции микроскопии. Во-первых, многоканальноязычные изображения автоматически загружаются в протокол и предварительно обрабатываются для улучшения, при необходимости, соотношения сигнала к шуму и удаления артефактов изображений. Затем сегментация изображения изолирует интересующие регионы (ROIs) из фона. В зависимости от уровня кластеризации и характера интересующих объектов имеется несколько методов сегментации. Сегментированные объекты сохраняются с помощью определенного дескриптора (например, Изображения name_Nucleus_1) в определенной папке и могут использоваться/повторно использоваться для последующего анализа. Флуоресцентные сигналы, такие как пятна, затем анализируются в рамках ROIs, а несколько функций (местоположение, размер, форма, интенсивность, текстура, точечное число и размер) экспортируются в автоматически созданную таблицу. Все измеренные объекты, такие как количество обнаруженных пятен, сообщаются дескриптору соответствующей рентабельности инвестиций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Графический интерфейс рабочего процесса Icy
(a) Рабочийпроцесс состоит из 13 общих блоков, которые могут быть сгруппированы в соответствии с их общей функцией: Select Folder (блок 1) позволяют доступ к изображениям; Каналы слияния (блок 2) используются для слияния различных каналов изображений. Блоки от 3 до 8 предназначены для сегментации объектов, каждый из которых адаптируется для определенного контекста: Сегментация A: Нерасгруппированные объекты, Сегментация B: Плохо кластерные объекты, Сегментация C: Кластерные объекты с выпуклыми формами, сегментация D: Кластерные объекты с нерегулярными формами (блок 7, работает в связи с блоком 6), Сегментация E: Кластерные цитоплазмы. Блоки от 9 до 11 используются для подсчета/анализа очагов в подклеточных отсеках: Анализ флуоресценции A: 1 канал, анализ флуоресценции B: 2 канала в одном отсеке и анализ флуоресценции C: 2 канала в двух отсеках. Блоки 12 и 13 адаптированы для анализа транслокациоционных событий: Анализ флуоресценции D: Глобальный транслокации и флуоресценции анализ E: Индивидуальная транслокация клеток. bb) Глобальная презентация архитектуры блока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Время, необходимое для сегментации в качестве функции разрешения изображения и уровня кластеризации объектов
()Графическая иллюстрация времени, необходимого для выполнения сегментации в зависимости от разрешения изображения и уровня кластеризации. Были протестированы два различных блока сегментации: сегментация А (для нескопировенных объектов) и сегментация D (для кластерных объектов с нерегулярными формами). Время обработки (в секундах на изображение) замышляется как функция разрешения изображения (количество пикселей). bb) Пример изображений, проанализированных с блоком сегментации A или сегментации D. DaPI окрашивания и сегментированных ядер показаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Анализ рабочего процесса анализа ядерного транслокации НФЗБ в ответ на стимуляцию ТНФЗ
( ) Примеризображенийчеловеческих клеток MCF7 (человеческая линия аденокарциномы груди) обработаны с TNF из набора изображений BBBC014 (Широкая коллекция бенчмарка Bioimage)¹². Локализация транскрипционного фактора НФЗБ была изучена в клетках, обработанных с 12 увеличивающейся концентрацией ТНФЗ (от 0 до 10^-7г/мЛ). Для каждой концентрации было сделано 4 репликации. ИЗОБРАЖЕНИЯ DAPI (синий канал) были обработаны в сегментации C: Кластерные объекты с блоком выпуклых форм для сегментных ядер, а затем для окрашивания NF'B FITC (зеленый канал) использовался для разграничения цитоплазм с сегментацией E: Кластерный блок цитоплазмы. Анализ флуоресценции D: Глобальный транслокационный блок использовался для экспорта суммы ядерных и цитоплазматических значений пикселей. bb) Для определения общей интенсивности флуоресцентного сигнала NF-B в каждом отсеке используются сегментированные ядра (серые) и цитоплазмы (белые). c)Кривая реакции дозы, полученная в результате анализа данных, иллюстрирует увеличение ядерной доли НЗБ по мере увеличения концентрации ТНФЗ. Изображения в 8-битом формате BMP, а размер изображения составляет 1360 х 1024 пикселей. Для каждой концентрации стандартное отклонение между 4 репликациями вычисляется и иллюстрируется как бары ошибок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Количественная оценка очагов EDC4 (P-тел) в цитоплазме в отдельных клетках
() Совместноеокрашивание с DAPI (синий канал) и Фаллоидин (красный канал) позволяет сегментации и идентификации ядер клеток и F-актин, соответственно. Белок EDC4 (зеленый канал) используется в качестве маркера для обнаружения P-тел, известных исключительно цитоплазмическим. Масштабная планка, 10 мкм (b) Фочи подсчитываются, и несколько функций (здесь их область в пикселях) экспортируются в таблицу Результаты, структурированную в нескольких листах. Два листа посвящены анализу ядер и два - анализу цитоплазм. Каждое сырье встраивает информацию о конкретной рентабельности инвестиций. В информационных листах Nucleus/Cytoplasm, характеристики сегментированных объектов экспортируются (ROI ID, размер и средняя интенсивность), а затем количество обнаруженных очагов в пределах каждой рентабельности инвестиций. При необходимости можно добавить порог размера (100 пикселей в данном примере), а в двух последних столбцах сообщается о количестве очагов ниже и выше этого порога. В Nucleus/Cytoplasm_Distribution листов размером foci область (в пикселях) всех обнаруженных очагов сообщается в сыром соответствующем рентабельности инвестиций. В этом примере мы выделяем анализ двух клеток (сегментированных cytoplasm_0 and_1), где были обнаружены цитоплазматические очаги EDC4. Размер в пикселях каждого из очагов также дается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: Кинетика катина и 53BP1 нуклеоплазмического распределения после окислительного стресса
Анализ количества и размера очагов был основан на более чем 110 отдельных клетках для каждого пункта времени от 3 независимых кинетики. (a) Иммунофлуоресценция обнаружения coilin и 53BP1 очагов в клетках HeLa S3 во время лечения кинетики с 500 м Ч_{М 2}O₂. 53BP1 концентрируется на ДНК Double-Strand Break сайтов и используется для оценки эффективности лечения на каждой клетке. Coilin обогащается в телах Cajal. Клетки были зафиксированы 2, 4, 6, 8 и 20 ч после окислительного стресса индукции и co-stained с анти-катина (красный канал) и анти-53BP1 (зеленый канал) антитела. Масштабная планка, 10 мкм . (б) Количество катина ядерного очага после окислительного стресса. Результаты показаны как коробочный участок, где центральной меткой является медиана, нижние и верхние края коробки —^25-й и 75-й процентиля.^th В клетках, обработанных H₂O_2,обнаруживается значительное увеличение количества катуиных очагов и является максимальным после 2 и 4 ч лечения. Уилкосон - Манн Уитни тест-анализ демонстрирует существенную разницу между необработанными и H₂O₂ обработанных клеток (яп., p'lt;0.05; , p'lt;0.01; q, p'lt;0.001). cc) Доля клеток в функции области катиновых очагов (м^2). Большинство очагов имеют меньшую площадь на 2 ч и 4 ч точек времени по сравнению с контролем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: Изучение нуклеации Cajal органов в клетках overexpressing GFP-coilin фьюжн белка
(a) Клетки HeLa S3 были временно трансфицированы в биологических трипликатах с 500 нг плазмидной, выражающей белок синтеза GFP-Coilin с помощью стандартной процедуры в соответствии с рекомендациями производителя. После 48 ч, клетки были зафиксированы и окрашенные антитела против coilin. DAPI (синий канал) позволяет сегментировать ядра. Для этих анализов было проанализировано более 100 клеток. Сигнал GFP отражает эктопическую локализацию белка coilin-GFP (зеленый канал), в то время как сигнал катина (красный канал) соответствует как эндогенной, так и экзогенной локализации белка. Для каждого ядра средняя интенсивность сигнала GFP отражает уровень выражения катушкина. Согласно этому параметру, особенности Катин-фочи были проанализированы с помощью блока Флуоресценция Анализ B: 2 каналов в том же отсеке. Шкала бар, 10 мкм (б) Связь между числом катвинового очага и средней интенсивностью GFP на ядро. Результаты отображаются как коробочный участок, где центральной меткой является медиана, нижний и верхний края коробки —^25-й и 75-й процентиля.^th Уилкосон - Манн Уитни тест-анализ демонстрирует значительное увеличение числа очагов для интенсивности GFP (gt;10 (З, p'lt;0.05; , p'lt;0.01; з, p'lt;0.001). cc) Связь между областью катиновых очагов и средней интенсивностью GFP на ядро. Результаты отображаются как коробочный участок, где центральной меткой является медиана, нижний и верхний края коробки —^25-й и 75-й процентиля.^th Уилкосон - Манн Уитни тест-анализ демонстрирует значительное увеличение площади coilin foci для интенсивности GFP (gt;10 (З, p'lt;0.05; , p'lt;0.01; q, p'lt;0.01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок S1: Кинетика 53BP1 нуклеоплазмического распределения после окислительного стресса
()Количественная оценка 53BP1 ядерных очагов в необработанных или H₂O₂ обработанных клеток после различных инкубационных раз. Результаты отображаются как коробочный участок, где центральной меткой является медиана, нижний и верхний края коробки —^25-й и 75-й процентиля.^th Уилкосон - Манн Уитни тест-анализ демонстрирует существенную разницу между необработанными и H₂O₂ обработанных клеток (яп., p'lt;0.05; , p'lt;0.01; q, p'lt;0.001). (б)Для каждого времени точки кинетики, ROC (Приемник Операционная характеристика) кривая была создана для определения наилучшего порога для различаем между подчеркнул и не подчеркнул клеток. Параметры каждого теста сообщаются в таблице (Чувствительность, специфичность, TP: истинно положительный, TN: истинный минус, FP: ложноположитель, FN: ложный негатив). Из этих данных был установлен глобальный порог в 17 53BP1 для дискриминации подчеркнутых от неотясных клеток через кинетику. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Для анализа изображений флуоресценций клетки имеется все большее число свободных программных средств. Пользователи должны правильно выбирать адекватное программное обеспечение в соответствии со сложностью их проблематично, к их знаниям в обработке изображений, и к времени, которое они хотят потратить на их анализ. Icy, CellProfiler, или ImageJ/Fiji являются мощными инструментами, сочетая в себе удобство использования и функциональность³. Icy является автономным инструментом, который представляет собой четкий графический пользовательский интерфейс (GUI), и в частности его "Протоколы" точки и нажмите интерфейс, через который рабочие процессы могут быть легко разработаны или манипулировать⁴. Функциональность этого программного обеспечения повышается за счет поддержки и использования плагинов ImageJ, и много документации доступно благодаря своему большому сообществу пользователей. Мы использовали это сильное сочетание удобства использования и функциональности программного обеспечения Icy для разработки рабочего процесса Substructure Analyzer. Его основная цель заключается в предложении автоматизированного решения для выполнения полного анализа клеточного флуоресцентного сигнала от нескольких изображений. Анализ включает предварительную обработку изображений, сегментацию объектов и флуоресцентный анализ сигнала.

Несколько протоколов с благодарностью разделяют на сайте Icy и предлагают использовать функции icy для обнаружения и анализа флуоресцентных сигналов, таких как клеточные очаги. Однако некоторые из этих протоколов обрабатывают только одно изображение за один запуск, не экспортируют результаты в определенный файл или анализируют один канал. Другие не содержат предварительной сегментации для определения регионов, представляющих интерес (ROIs) или предлагают простые алгоритмы, такие как "HK-means", которые не подходят для сегментации высокогруппировенных объектов. Подструктурный анализатор автоматизирует все этапы анализа изображения от предварительной обработки изображений до сегментации объектов и обнаружения/анализа флуоресцентных сигналов. Протокол также предлагает простые или более сложные методы сегментации объектов и экспорта данных (названия сегментированных объектов, анализ очагов) реализуется в оптимизированных выводах, адаптированных к проблемным. CellProfiler также предлагает мощные трубопроводы, состоящие из модулей, которые инкапсулируют функционности^18,,19. Имеющиеся трубопроводы хорошо приспособлены к конкретным проблемам. Ледяные рабочие процессы представляют собой сеть различных коробок, каждый из которых выполняет конкретную задачу. Через интерфейс "Протоколы" коробки, составляющие сеть, интуитивно понятны и просты в использовании. Подструктурный анализатор адаптирован к нескольким контекстам, таким как простое слияние каналов, количественная оценка распределения флуоресцентных сигналов между двумя подклеточными отсеками, анализ очагов в одном или нескольких каналах из одного или двух сотовых отсеков в отдельных клетках. Несколько дисплеев позволяют визуализировать промежуточные результаты во время каждого запуска для управления обработкой. Кроме того, Icy представляет значки баров, которые группируют методы по теме и из которых функции, найденные в рабочем процессе, могут быть отдельно манипулированы, чтобы вручную проверить определенные параметры на некоторых изображениях, прежде чем использовать их на целом наборе изображений.

Как и в области анализа биоизображений, наиболее важным этапом этого протокола является сегментация объектов. Протокол предлагает сегментацию первичных объектов, которые большую часть времени ядра клеток, а также содержит еще один блок, задача которого состоит в сегменте второго типа объектов в ячейке. Сегментация ядер может быть затруднена, когда объекты сильно сгруппированы таким образом, чтобы они касались или пересекались. Различные альтернативы сегментации первичных объектов содержатся в протоколе в зависимости от формы объектов и уровня кластеризации, даже если на сегодняшний день нет универсального алгоритма успеха в полной сегментации высокогруппировных объектов. Процесс сегментации в основном ограничен определением правильных параметров, которые могли бы успешно сегментировать часть объектов, но привести к недоисированию или чрезмерной сегментации другой части. Пользователю придется выполнять различные запуски с различными параметрами, чтобы получить окончательную правильную сегментацию, особенно для кластерных объектов, представляющих неоднородные и несообщаемые формы.

Этот протокол в основном ограничен этапом сегментации, который может занять много времени и нуждаться в мощной компьютерной конфигурации для самых сложных случаев. В частности, чем более многочисленны или сложны изображения (кластерные объекты в сегмент, большое количество пикселей в изображениях), тем больше памяти случайного доступа (RAM) потребуется пользователю. Во всем мире для любой проблемной проблемы пользователю необходимо будет запустить протокол на 64-х битах Java Runtime Environment (свободно доступна на веб-сайте Java) и использовать операционную систему 64 бита (OS) для увеличения доступной памяти, используемой Icy (память ограничена 1300 МБ для 32 битов JRE). Из-за скрипта протокол не работает правильно на компьютере Mac. Кроме того, количество параметров увеличивается со сложностью проблемы и потребует больше знаний в анализе изображений. Что касается критериев функциональности, то этот протокол еще не был адаптирован для анализа сложенных изображений (временные стеки, z-stacks), даже если Icy эффективно выполняет анализ этого типа данных.

Будущие обновления будут реализованы, в частности, для улучшения сегментации сложных кластерных объектов. Дополнительные блоки будут разработаны для адаптации сегментации к кластерным клеточным структурам с нерегулярными несохлыми формами. Мы также адаптируем рабочий процесс для анализа времени и z-стеков (для живых изображений и 3D-данных).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free	Thermo Fisher Scientific	28908	to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-11008	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21425	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A34055	fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA)	euromedex	04-100-812-E
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796-500ml	cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040-5ML	mounting medium
Human: HeLa S3 cells	IGBMC, Strasbourg, France		cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)	Sigma-Aldrich	H1009-100ml	used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668-019	transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin	abcam	ab11822	Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope	Nikon		epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	transfection medium
PBS pH 7.4 (10x)	gibco	70011-036	to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1	Thermo Fisher Scientific	PA1-16565	53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4	Sigma-Aldrich	SAB4200114	EDC4-specific antibody
Triton X-100	Roth	6683	to permeabilize the cells