Bioengineering

محلل البنية الفرعية: سير عمل سهل الاستخدام للاستكشاف السريع والتحليل الدقيق للأجسام الخلوية في صور المجهر الفلوري

Published: July 15, 2020 doi: 10.3791/60990

Géraud Heckler¹, Christelle Aigueperse¹, Liza Hettal¹, Quentin Thuillier¹, Fabrice de Chaumont², Stéphane Dallongeville², Isabelle Behm-Ansmant¹

¹Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, ²Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

Summary

نقدم سير العمل المتوفرة مجانا بنيت لاستكشاف سريع وتحليل دقيق للأجسام الخلوية في مقصورات خلية محددة في الصور المجهرية الفلوريس. تم تصميم سير العمل سهل الاستخدام هذا على برنامج المصدر المفتوح Icy ويستخدم أيضًا وظائف ImageJ. خط الأنابيب بأسعار معقولة دون معرفة في تحليل الصور.

Abstract

وقد اتسم العقد الماضي باختراقات في تقنيات المجهر المفلورية التي يتضح منها تحسين الدقة المكانية ولكن أيضا في التصوير بالخلايا الحية وتقنيات المجهر عالية الإنتاجية. وأدى ذلك إلى زيادة مستمرة في كمية وتعقيد بيانات المجهر لتجربة واحدة. لأن التحليل اليدوي لبيانات المجهر يستغرق وقتا طويلا جدا، وذاتية، ويحظر التحليل الكمي، أتمتة تحليل الصورة الحيوية أصبح من المحتم تقريبا. لقد قمنا ببناء سير عمل معلوماتي يسمى محلل البنية الفرعية لأتمتة تحليل الإشارة بالكامل في الصور الحيوية من المجهر الفلورسنت. تم تطوير هذا العمل على منصة مفتوحة المصدر سهلة الاستخدام Icy ويتم إكمالها من قبل وظائف من ImageJ. ويشمل المعالجة المسبقة للصور لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وتجزئة الخلايا الفردية (الكشف عن حدود الخلايا) والكشف/القياس الكمي للأجسام الخلوية التي يتم إثراؤها في مقصورات خلايا محددة. وتتمثل الميزة الرئيسية لسير العمل هذا في اقتراح وظائف معقدة للتصوير الحيوي للمستخدمين الذين لا يتمتعون بخبرة في تحليل الصور من خلال واجهة سهلة الاستخدام. وعلاوة على ذلك، فهي وحدات معيارية بدرجة عالية ومتكيفة مع عدة مسائل من توصيف نقل التكنولوجيات النووية/السيتوبلازمية إلى التحليل المقارن لمختلف أجسام الخلايا في مختلف الهياكل الفرعية الخلوية. ويتضح من وظيفة هذا العمل من خلال دراسة الهيئات Cajal (ملفوف) في ظروف الإجهاد التأسدي (OS). تظهر البيانات المستقاة من المجهر المفلور أن سلامتها في الخلايا البشرية تتأثر بعد ساعات قليلة من تحريض نظام التشغيل. ويتميز هذا التأثير بانخفاض نوى اللفائف في الأجسام Cajal مميزة، المرتبطة إعادة توزيع نووكلوباسميك من الملف إلى عدد متزايد من بؤر أصغر. يشير الدور المركزي لللفائف في التبادل بين مكونات CB والنيوكلوباسم المحيطة به إلى أن نظام التشغيل المستحث بإعادة توزيع اللفائف يمكن أن يؤثر على تكوين ووظائف هيئات Cajal.

Introduction

المجهر الخفيف، وبشكل خاص، المجهر الفلوري هي تقنيات قوية ومتعددة الاستخدامات تستخدم عادة في العلوم البيولوجية. أنها تعطي الوصول إلى التعريب الدقيق للجزيئات الحيوية المختلفة مثل البروتينات أو الحمض النووي الريبي من خلال وضع العلامات الفلورية المحددة. وقد تميز العقد الماضي من التقدم السريع في تقنيات المجهر والتصوير كما يتضح من جائزة نوبل في الكيمياء 2014 منح اريك Betzig, ستيفان W. الجحيم ووليام E. Moerner لتطوير المجهر الفلورانس فائقة حل (SRFM)¹. تتجاوز SFRM حد الانعراج من المجهر البصري التقليدي لإدخاله في نانوديمينسين. كما أن تحسين تقنيات مثل التصوير الحي أو نهج الفرز عالي الإنتاجية يزيد من كمية البيانات التي يجب معالجتها لكل تجربة وتعقيدها. في معظم الأحيان، يواجه الباحثون مجموعات سكانية غير متجانسة عالية من الخلايا ويريدون تحليل الأنماط الظاهرية على مستوى الخلية الواحدة.

في البداية، تم إجراء تحليلات مثل عد البؤر بالعين، وهو ما يفضله بعض الباحثين لأنه يوفر تحكمًا بصريًا كاملًا في عملية العد. ومع ذلك ، فإن التحليل اليدوي لهذه البيانات يستغرق وقتا طويلا للغاية ، ويؤدي إلى التباين بين المراقبين ، ولا يتيح الوصول إلى ميزات أكثر تعقيدا بحيث أصبحت النهج بمساعدة الكمبيوتر تستخدم على نطاق واسع ولا يمكن تجنبها تقريبا². أساليب المعلوماتية الحيوية تزيد بشكل كبير من كفاءة تحليل البيانات وخالية من الذاتية المشغل لا يمكن تجنبها والتحيز المحتمل لتحليل العد اليدوي. أدى الطلب المتزايد في هذا المجال وتحسين قوة الكمبيوتر إلى تطوير عدد كبير من منصات تحليل الصور. وبعضها متاح مجاناً ويمنح إمكانية الوصول إلى أدوات مختلفة لإجراء التحليل باستخدام أجهزة الكمبيوتر الشخصية. وقد تم مؤخرا وضع تصنيف لأدوات الوصول المفتوح³ ويعرض Icy⁴ كبرمجيات قوية تجمع بين سهولة الاستخدام والوظائف. وعلاوة على ذلك ، فإن الجليدية لديها ميزة التواصل مع ImageJ.

بالنسبة للمستخدمين الذين لا يتمتعون بخبرة في تحليل الصور، فإن العقبات الرئيسية هي اختيار الأداة المناسبة وفقاً للمحددات الإشكالية والمتناغمة بشكل صحيح التي غالباً ما تكون غير مفهومة جيداً. وعلاوة على ذلك، غالباً ما تكون أوقات الإعداد طويلة. يقترح Icy واجهة نقطة وانقر سهلة الاستخدام تسمى "بروتوكولات" لتطوير سير العمل من خلال الجمع بين بعض الإضافات الموجودة ضمن مجموعة شاملة⁴. تصميم وحدات مرنة وواجهة نقطة وانقر جعل إعداد تحليل ممكن بالنسبة لغير المبرمجين. هنا نقدم سير العمل يسمى محلل الهيكل الفرعي، وضعت في واجهة الجليدية ، وظيفتها هي تحليل الإشارات الفلورية في مقصورات خلوية محددة وقياس ميزات مختلفة مثل السطوع ، وعدد بؤر ، وحجم بؤر ، والتوزيع المكاني. هذا سير العمل يعالج العديد من القضايا مثل الكم من نقل إشارة، وتحليل الخلايا المُصابة التي تعبر عن مراسل الفلورسنت، أو تحليل بؤر من الهياكل الفرعية الخلوية المختلفة في الخلايا الفردية. وهو يسمح بمعالجة صور متعددة في وقت واحد، ويتم تصدير نتائج المخرجات إلى ورقة عمل محددة بعلامات الجدولة يمكن فتحها في برامج جداول البيانات شائعة الاستخدام.

يتم عرض خط أنابيب محلل البنية الفرعية في الشكل 1. أولاً، يتم معالجة كافة الصور الموجودة في مجلد محدد مسبقًا لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. هذه الخطوة يزيد من كفاءة الخطوات التالية ويقلل من وقت التشغيل. ثم يتم تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) ، المقابلة لمناطق الصورة التي يجب اكتشاف إشارة الفلورسنت فيها ، وتقسيمها. وأخيراً، يتم تحليل إشارة الفلورسنت، ويتم تصدير النتائج إلى ورقة عمل محددة بعلامات الجدولة.

تجزئة الكائنات (الكشف عن الحدود) هي الخطوة الأكثر صعوبة في تحليل الصور، والكفاءة يحدد دقة القياسات الخلية الناتجة. الكائنات الأولى التي تم تحديدها في صورة (تسمى الكائنات الأولية) غالبا ما تكون نوية من الصور الملطخة بالحمض النووي (DAPI أو Hoechst تلطيخ)، على الرغم من أن الكائنات الأولية يمكن أن تكون أيضا خلايا كاملة، الخرز، البقع، الأورام، أو أيا كانت الكائنات الملطخة. في معظم الصور البيولوجية، الخلايا أو النوى لمس بعضها البعض أو التداخل مما تسبب في الخوارزميات البسيطة والسريعة للفشل. حتى الآن، لا يمكن لأي خوارزمية عالمية تنفيذ تجزئة مثالية لجميع الكائنات، ويرجع ذلك في الغالب إلى خصائصها (الحجم أو الشكل أو الملمس) تعدل كفاءة تجزئة⁵. تعتمد أدوات التقسيم التي يتم توزيعها عادةً مع برامج الفحص المجهري (مثل برنامج التصوير المتحول بواسطة الأجهزة الجزيئية⁶، أو برنامج أبحاث تقدمات NIS-Elements بواسطة Nikon⁷⁾بشكل عام على التقنيات القياسية مثل مطابقة الارتباط أو العتبة أو العمليات المورفولوجية. وعلى الرغم من كفاءة هذه الأساليب العامة في النظم الأساسية، فإن هذه الأساليب التي تتسم بالإفراط في التعميم تفرض بسرعة قيوداً عند استخدامها في سياقات أكثر صعوبة وتحديداً. في الواقع، تجزئة حساسة للغاية لالمعلمات التجريبية مثل نوع الخلية، وكثافة الخلية، أو المؤشرات الحيوية، وكثيراً ما يتطلب التعديل المتكرر لمجموعة بيانات كبيرة. يدمج سير عمل محلل الهيكل الفرعي كلاً من الخوارزميات البسيطة والأكثر تعقيدًا لاقتراح بدائل مختلفة تتكيف مع تعقيد الصورة واحتياجات المستخدم. ومن الجدير بالذكر أنه يقترح خوارزمية مستجمعات المياه القائمة على العلامة⁸ للكائنات متفاوتة المسافات العالية. تعتمد كفاءة أسلوب التجزئة هذا على تحديد علامات فردية على كل كائن. يتم اختيار هذه العلامات يدويا معظم الوقت للحصول على المعلمات الصحيحة لتقسيم كامل، والتي تستغرق وقتا طويلا للغاية عندما يواجه المستخدمون عددا كبيرا من الكائنات. محلل البنية الفرعية يقترح الكشف التلقائي لهذه العلامات، وتوفير عملية تجزئة عالية الكفاءة. تجزئة هو ، في معظم الأحيان ، والحد من خطوة تحليل الصور ويمكن أن تعديل بشكل كبير في وقت المعالجة اعتمادا على دقة الصورة ، وعدد الكائنات في الصورة الواحدة ، ومستوى التجمع من الكائنات. خطوط الأنابيب النموذجية تتطلب بضع ثوان إلى 5 دقائق لكل صورة على كمبيوتر سطح المكتب القياسية. تحليل الصور أكثر تعقيدا يمكن أن تتطلب جهاز كمبيوتر أكثر قوة وبعض المعرفة الأساسية في تحليل الصور.

ويتضح من مرونة هذا العمل ووظيفته مع مختلف الأمثلة في النتائج التمثيلية. وتظهر مزايا هذا العمل بشكل ملحوظ من خلال دراسة الهياكل الفرعية النووية في ظل ظروف الإجهاد التأسدي .( نظام التشغيل يتوافق مع اختلال التوازن في الأكسدة الحمراء لصالح المؤكد ويرتبط مع مستويات عالية من أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS). منذ ROS بمثابة جزيئات الإشارة، والتغيرات في تركيزها وتوطين الخلايا الفرعية تؤثر إيجابا أو سلبا على عدد لا يحصى من المسارات والشبكات التي تنظم الوظائف الفسيولوجية، بما في ذلك نقل الإشارة، وآليات الإصلاح، والتعبير الجيني، وموت الخلايا، وانتشار^9،^,¹⁰. وبالتالي فإن نظام التشغيل يشارك بشكل مباشر في مختلف الأمراض (أمراض الأعصاب والقلب والأوعية الدموية والسرطان والسكري، وما إلى ذلك)، ولكن أيضا الشيخوخة الخلوية. لذلك، فك نتائج نظام التشغيل على تنظيم الخلية البشرية ووظيفته يشكل خطوة حاسمة في فهم أدوار نظام التشغيل في بداية وتطور الأمراض البشرية. وقد ثبت أن نظام التشغيل ينظم التعبير الجيني عن طريق تعديل النسخ من خلال عدة عوامل النسخ (P53، Nrf2، FOXO3A)¹¹، ولكن أيضا عن طريق التأثير على تنظيم عدة عمليات المشاركة وما بعد النسخ مثل الربط البديل (AS) من ما قبل RNAs¹²^،¹³^،¹⁴. إن الربط البديل للنصوص الأولية للتشفير والنصوص غير البرمجةية هو آلية أساسية تزيد من قدرة الترميز على الجينوم عن طريق إنتاج أشكال متساوية. يتم تنفيذ AS بواسطة مجمع كبير ribonucleoprotein يسمى spliceosome ، يحتوي على ما يقرب من 300 بروتين و 5 U-الغنية RNAs النووية الصغيرة (UsnRNAs)¹⁵. يتم التحكم بإحكام في تجميع spliceosome و AS في الخلايا وتحدث بعض خطوات نضج الطمي داخل المقصورات النووية أقل غشاء اسمه الهيئات Cajal. وتتميز هذه الهياكل الفرعية النووية بالطبيعة الديناميكية لهيكلها وتكوينها، والتي تتم بشكل رئيسي من خلال التفاعلات متعددة التكافؤ لمكونات الحمض النووي الريبي والبروتين مع بروتين اللفائف. تحليل الآلاف من الخلايا مع سير عمل محلل الهيكل الفرعي سمح توصيف أبدا وصفها من آثار نظام التشغيل على الهيئات Cajal. في الواقع، تشير البيانات التي تم الحصول عليها إلى أن نظام التشغيل يعدل نووية الأجسام Cajal، مما يحفز إعادة توزيع نووكلوباسميك من بروتين اللفائف إلى العديد من بؤر النووية الصغيرة. مثل هذا التغيير في هيكل الهيئات Cajal قد تؤثر على نضوج spliceosome والمشاركة في تعديل AS بواسطة نظام التشغيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الدروس سهلة الاستخدام متوفرة على موقع أيسي http://icy.bioimageanalysis.org.

1. تحميل الجليدية وبروتوكول محلل تحت البنية

تحميل الجليدية من موقع على شبكة الإنترنت الجليدية (http://icy.bioimageanalysis.org/download) وتحميل بروتوكول محلل الهيكل الفرعي : http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
ملاحظة: إذا كان استخدام نظام تشغيل 64 بت، تأكد من استخدام إصدار 64 بت من Java. هذا الإصدار يسمح لزيادة الذاكرة المخصصة للCy (تفضيلات| عام | أقصى الذاكرة).

2- فتح البروتوكول

افتح Icy وانقر على أدوات في قائمة الشريط.
انقر فوق البروتوكولات لفتح واجهة محرر البروتوكولات.
انقر فوق تحميل وفتح بروتوكول محلل البنية الفرعية. يمكن أن يستغرق تحميل البروتوكول بضع ثوانٍ. تأكد من أن فتح البروتوكول قد اكتمل قبل استخدامه.
ملاحظة: يتكون سير العمل من 13 كتل عامة معروضة في الشكل 2a. يعمل كل كتلة كـ خط أنابيب يتكون من عدة مربعات تنفيذ المهام الفرعية معينة.

3. التفاعل مع سير العمل على الجليدية

ملاحظة: كل كتلة أو مربع هو ترقيم ولها رتبة محددة ضمن سير العمل(الشكل 2b). بالنقر على هذا الرقم، يتم تعيين أقرب موقف ممكن إلى الأول إلى كتلة / مربع المحدد ثم يتم إعادة تنظيم موقف كتل أخرى / مربعات. احترام الترتيب الصحيح للقوالب عند إعداد سير العمل. على سبيل المثال، كتلة Spot Detector تحتاج إلى ROIs محددة مسبقاً بحيث يجب تشغيل كتل التجزئة قبل كتل Spot Detector. لا تقم بتعديل موضع مربعات. لا تستخدم "." في اسم الصورة.

بالنقر على رمز الزاوية اليسرى العليا، طي، توسيع، تكبير، ضيق، أو إزالة كتلة(الشكل 2b).
يتميز كل خط أنابيب من سير العمل بشبكة من مربعات متصلة عن طريق المدخلات والمخرجات(الشكل 2b). لإنشاء اتصال، انقر فوق الإخراج والاحتفاظ بها حتى يصل المؤشر إلى إدخال. يمكن إزالة الاتصالات بالنقر على علامة الإخراج.

4. دمج قنوات صورة

استخدم كتلة "قنوات دمج" لإنشاء الصور المدمجة. إذا لزم الأمر، أعد تسمية الملفات بحيث يكون التسلسلات التي سيتم دمجها البادئة نفس الاسم متبوعاً بفاصل مميز. على سبيل المثال، يتم تسمية تسلسلات القنوات الفردية من الصورة A: ImageA_red، ImageA_blue.
ملاحظة: للفاصل، لا تستخدم الأحرف الموجودة مسبقاً في اسم الصورة.
في نفس المجلد، قم بإنشاء مجلد جديد واحد لكل قناة لدمج. على سبيل المثال، لدمج القنوات الحمراء والأخضرة والزرقاء، قم بإنشاء 3 مجلدات، ثم قم بتخزين التسلسلات المطابقة في هذه المجلدات.
استخدم فقط قنوات دمجالكتلة وإزالة الكتل الأخرى وحفظ البروتوكول كقنوات دمج.
1. الوصول إلى المربعات لتعيين المعلمات. لكل قناة، قم بتعبئة المربعات رقم القناة X (مربعات 1، 5 أو 9)، رقم قناة المجلد X (مربعات 2، 6 أو 10)، رقم قناة الفاصل X (مربعات 3، 7 أو 11) وقناة خريطة اللون 0 (مربعات 4 و 8 و 12) على التوالي.
  ملاحظة: يتم تجميع هذه المربعات أفقياً بواسطة أربعة، كل سطر المقابلة إلى نفس القناة. في كل سطر، يتوفر العرض أيضاً (مربعات 23 أو 24 أو 25) لتصور تسلسل القناة المقابلة بشكل مباشر.
  1. في المربع رقم القناة X، اختر القناة التي تريد استخراجها (في صور RGB الكلاسيكية، 0=الأحمر، 1=الأخضر، 2= أزرق). المستخدم بسرعة الوصول إلى قنوات مختلفة من صورة ضمن إطار المفتش من الجليدية، في علامة التبويب تسلسل. اكتب أصغر قيمة القناة في السطر العلوي وأعلى واحد في السطر السفلي.
  2. في المربع رقم قناة المجلد X، اكتب \Name المجلد الذي يحتوي على صور للقناة X.
  3. في المربع رقم قناة الفاصل س، اكتب الفاصل المستخدم لاسم الصورة (في المثال السابق: "_red" و "_green" و "_blue").
  4. في مربع قناة Colormap س ،تشير مع عدد نموذج colormap لاستخدامها لتصور القناة المقابلة في الجليدية. تكون ملفات الألوان المتوفرة مرئية في علامة التبويب تسلسل من نافذة المفتش.
  5. في مربع تنسيق الصور المدمجة (المربع 28)، اكتب الملحق لحفظ الصور المدمجة: .tif أو .gif أو .jpg أو .bmp أو .png.
    ملاحظة: لدمج قنوات 2 فقط، لا تقم بتعبئة المربعات الأربعة المطابقة للقناة الثالثة.
2. في الزاوية اليسرى العليا من كتلة دمج القنوات، انقر على الرابط مباشرة إلى يمين المجلد. في مربع الحوار فتح الذي يظهر، انقر نقراً مزدوجاً فوق المجلد الذي يحتوي على تسلسلات القناة الأولى التي تم تعريفها في المربع رقم قناة المجلد 1 (المربع 2). ثم، انقر على فتح.
3. تشغيل البروتوكول بالنقر فوق السهم الأسود في الزاوية اليسرى العليا من كتلة "قنوات دمج" (انظر الجزء 7 للحصول على مزيد من التفاصيل). يتم حفظ الصور المدمجة في مجلد دمج في نفس الدليل كمجلدات القنوات الفردية.

5- تجزئة المناطق ذات الأهمية

ملاحظة: محلل البنية الفرعية يدمج كلاً من الخوارزميات البسيطة والأكثر تطوراً لاقتراح بدائل مختلفة تتكيف مع تعقيد الصورة واحتياجات المستخدم.

حدد الكتلة المتكيفة.
1. إذا لم يتم لمس الكائنات بعضها البعض أو لا يحتاج المستخدم إلى تمييز الكائنات متفاوتة المسافات بشكل فردي، استخدم كتلة تجزئة A: كائنات متفاوتة المسافات.
2. عندما لا تلمس الكائنات بعضها البعض، ولكن بعضها قريب، استخدم كتلة تجزئة B: الكائنات متفاوتة المسافات.
3. للكائنات ذات مستوى التكتل العالي وشكل محدب، استخدم كتلة تجزئة C: كائنات متفاوتة المسافات ذات أشكال محدبة.
4. إذا كانت الكائنات تقدم مستوى تجميع عالي ولها أشكال غير منتظمة، استخدم كتلة التجزئة D: كائنات متفاوتة المسافات ذات أشكال غير منتظمة.
5. استخدام كتلة التجزئة E: السيتوبلازم متفاوت المسافات لشريحة لمس السيتوبلازم بشكل فردي باستخدام نوات مجزأة كعلامات. هذه الكتلة تحتاج حتما نوى مجزأة لمعالجة.
  ملاحظة: كتل تكييفها لعملية تجزئة الكائن الأساسي بشكل مستقل بحيث يمكن استخدام عدة كتل في نفس التشغيل لمقارنة كفاءتها لبنية فرعية معينة أو إلى تقسيم أنواع مختلفة من الهياكل الفرعية. إذا كان مستوى التجميع غير متجانس داخل نفس مجموعة الصور، ثم معالجة الكائنات الصغيرة و شديدة المسافات بشكل منفصل في كتل متكيفة.
ربط الإخراج0 (ملف) كتلة تحديد مجلد لإدخال المجلد من كتلة التجزئة المختارة.
تعيين معلمات كتلة التجزئة المختارة.
1. تجزئة A: كائنات غير متفاوتة المسافات و C تجزئة: كائنات متفاوتة المسافات مع أشكال محدبة
  1. في إشارة قناة مربع (المربع 1)، تعيين قناة الكائنات إلى قطعة.
  2. كخيار، في مربع مرشح غاوسي (المربع 2) ، زيادة قيم س و ص سيغما إذا كانت الإشارة داخل الكائنات غير متجانسة. ينعم مرشح الغاوسي القوام للحصول على مناطق أكثر تناسقًا ويزيد من سرعة وكفاءة تجزئة النوى. أصغر الكائنات، أقل قيمة سيجما. تجنب قيم سيغما عالية. تعيين القيم الافتراضية إلى 0.
  3. في المربع HK-Means (المربع 3) ، تعيين المعلمة فئات الكثافة والحد الأدنى التقريبي والحد الأقصى للأحجام (بالبكسل) من الكائنات التي سيتم الكشف عنها.
    ملاحظة: بالنسبة لفئات الكثافة، تصنّف قيمة 2 البيكسلات في فئتين: الخلفية والمقدمة. وهكذا يتم تكييفها عندما يكون التباين بين الكائنات والخلفية مرتفعًا. إذا كان الكائنات الأمامية لها كثافة مختلفة أو إذا كان التباين مع الخلفية منخفضًا، قم بزيادة عدد الفئات. الإعداد الافتراضي هو 2. يمكن تقييم حجم الكائن بسرعة عن طريق رسم عائد الاستثمار يدويا حول الكائن من الفائدة. حجم العائد على الاستثمار (الداخلية بالبكسل) يظهر مباشرة على الصورة عند الإشارة إليها مع المؤشر أو يمكن الوصول إليها في إطار إحصاءات ROI (فتحه من شريط البحث). معلمات الأمثل الكشف عن كل كائن المقدمة في عائد الاستثمارواحد. يمكن تعريفها يدويا في الجليدية(الكشف والتتبع | هونج كونج - الوسائل).
  4. في المربع "محيطات النشطة" (المربع 4) ، وتحسين الكشف عن حدود الكائن. وثائق شاملة لهذا البرنامج المساعد متاح على الانترنت: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. يمكن أيضاً تعريف المعلمات الصحيحة يدوياً في الجليدية(الكشف والتتبع | Active Contours).
  5. أثناء العملية، يتم إنشاء مجلد تلقائياً لحفظ صور الكائنات المجزأة. في المربع نص (المربع 6) ، اسم هذا المجلد (على: على شكل جزائح nuclei). لتعيين تنسيق لحفظ صور الكائنات المجزأة (Tiff، Gif، Jpeg، BMP، PNG)، قم بتعبئة تنسيق مربع صور الكائنات المجزأة. يتم إنشاء المجلد في المجلد الذي يحتوي على الصور المدمجة.
  6. تشغيل سير العمل (للحصول على التفاصيل، راجع الجزء 7).
2. تجزئة B: كائنات متفاوتة المسافات
  1. اتبع نفس الخطوات كما في 5.3.1 لتعيين معلمات مربعات إشارة قناة، HK-يعني، Active Contours، Extension لحفظ الكائنات المجزأة والنص (صفوف مربعات ليست هي نفسها كما في الخطوة 5.3.1).
  2. في المربع استدعاء IJ المساعد (المربع 4) ، تعيين المعلمة المتداول للتحكم في طرح الخلفية. تعيين هذه المعلمة على الأقل حجم الكائن الأكبر الذي ليس جزءاً من الخلفية. إن تقليل هذه القيمة يزيد من إزالة الخلفية ولكن يمكن أن يؤدي أيضاً إلى فقدان إشارة المقدمة.
  3. في المربع معادلة الرسم البياني التكيفي (المربع 6)، تحسين التباينات بين الكائنات الأمامية والخلفية. زيادة المنحدر يعطي تسلسلات أكثر تباينا.
  4. تشغيل سير العمل (للحصول على التفاصيل، راجع الجزء 7).
3. تجزئة D: كائنات متفاوتة المسافات ذات أشكال غير منتظمة
  ملاحظة: ثلاث طرق مختلفة للتجزئة تنطبق على كل صورة: أولاً،HK-يعني التجمعجنبا إلى جنب معأسلوب "الكنتوري" النشطيتم تطبيق. ثم،خوارزمية مستجمعات المياه الكلاسيكية(باستخدام مخطط المسافة الإقليديان) يتم تطبيقه على الكائنات التي تم تقسيمها بشكل خاطئ في السابق. وأخيراً،خوارزمية مستجمعات المياه القائمة على العلامةيتم استخدام. فقط وسائل HK- وطرق مستجمعات المياه القائمة على العلامات تحتاج إلى تدخل المستخدم. لكل من الأسلوبين، يمكن تطبيق نفس المعلمات على جميع الصور (النسخة المؤتمتة بالكامل) أو يمكن تغييرها لكل صورة (نسخة شبه آلية). إذا لم يتم تدريب المستخدم على أساليب التجزئة هذه، يوصى بشدة بمعالجة شبه تلقائية. وأثناء معالجة هذه الكتلة، هناك حاجة إلى التدخل اليدوي. عند الانتهاء من أسلوب تجزئة يجب على المستخدم إزالة الكائنات غير المجزأة يدوياً قبل بداية أسلوب التجزئة التالي. يتم حفظ الكائنات المجزأة بنجاح ولا يتم اعتبارها في الخطوة التالية(الخطوات). يجب أن تكون هذه الكتلة متصلة باللكتلكتلة/غير متجانسة الأشكال الأساسية الكائنات مربع الحوار تجزئةللعمل بشكل صحيح.
  1. تحميل مجموعة ImageJ MorphoLibJ على https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. يتم استخدام الإصدار 1.4.0 MorphoLibJ في هذا البروتوكول. وضع الملف MorphoLibJ_-1.4.0.jar في المجلد الجليدي / ij / الإضافات. يتوفر مزيد من المعلومات حول محتوى هذه المجموعة على https://imagej.net/MorphoLibJ.
  2. اتبع نفس الخطوات كما في الخطوة 5.3.1 لتعيين معلمات مربعات إشارة القناة، مرشح غاوسيان، Active Contours، Extension لحفظ الكائنات المجزأة والنص. صفوف مربعات ليست هي نفسها كما هو في الخطوة 5.3.1.
  3. تعيين معلمات مربع معادلة الرسم البياني التكيفي (راجع الخطوة 5.3.2.3).
  4. لتنشيط اطرح الخلفية، اكتب نعم في تطبيق طرح الخلفية؟ (المربع 5). وإلا، اكتب لا. إذا تم تنشيط المكون الإضافي، قم بتعيين المعلمة المتداولة (انظر الخطوة 5.3.2) في المربع اطرح المعلمة الخلفية (المربع 7).
  5. أتمتة من ال [هك-سّي]: لتطبيق نفس المعلمات لكافة الصور (معالجة مؤتمتة بالكامل) ، تعيين Nb من الفئات (المربع 11) ، الحد الأدنى للحجم (المربع 12) ، والحد الأقصى للحجم (box13) (انظر الخطوة 5.3.1). يجب تعيين هذه المعلمات لتحديد الحد أقصى من بكسل المقدمة وتحسين إضفاء الطابع الفردي للكائنات الأمامية. بالنسبة لإصدار المعالجة شبه المؤتمتة، لا يلزم التدخل.
  6. أتمتة عمليات استخراج العلامة: للنسخة المؤتمتة بالكامل، قم بتوسيع مربع استخراج علامات داخلية (المربع 27) وتعيين قيمة المعلمة "الديناميكية" في السطر 13 من البرنامج النصي. بالنسبة لإصدار المعالجة شبه المؤتمتة، لا يلزم التدخل.
    ملاحظة: يتم استخراج علامات بواسطة تطبيق تحويل minima الموسعة على صورة إدخال التي تسيطر عليها معلمة "ديناميكية". في خوارزمية مستجمعات المياه المستندة إلى العلامة، يتم محاكاة الفيضانات من هذه العلامات لتنفيذ تجزئة الكائن. لتجزئة ناجحة من الكائنات الأمامية، يجب استخراج علامة واحدة لكل كائن المقدمة. إعداد المعلمة "ديناميكية" لاستخراج علامات الأمثل يعتمد في الغالب على دقة الصور. وهكذا، إذا لم تكن مألوفة مع هذه المعلمة، استخدم النسخة شبه المؤتمتة.
  7. تشغيل سير العمل (للحصول على التفاصيل، راجع الجزء 7).
  8. في بداية المعالجة، مربعات الحوار المعلمات HK-يعني ومستجمعات المياه القائم على علامة فتح على التوالي. لتطبيق نفس المعلمات لجميع الصور (نسخة مؤتمتة بالكامل)، انقر على نعم. خلاف ذلك، انقر على NO. يفتح مربع المعلومات ، طالبا "تحديد أفضل ROIs مع HK -يعني البرنامج المساعد وصورة وثيقة". انقر على موافق وتطبيق يدويا HK-يعني البرنامج المساعد(الكشف والتتبع| HK-Means) على الصورة، التي تفتح تلقائيا. حدد الخيار تصدير ROIs في المربع البرنامج المساعد HK-Means. تطبيق أفضل المعلمات لجعل ROIs يحتوي على الحد أقصى من بكسل المقدمة وتحسين إضفاء الطابع الفردية للكائنات الأمامية. عندما يتم العثور على أفضل ROIs، أغلق الصورة مباشرة.
  9. في نهاية أسلوب التجزئة الأول، يفتح مربع معلومات ويطلب "إزالة ROIs غير المرغوب فيها وإغلاق الصورة". تتوافق هذه ROIs إلى حدود الكائنات المجزأة. حدد موافق وإزالة ROIs من الكائنات غير المجزأة في الصورة، والتي تفتح تلقائياً. يمكن إزالة عائد الاستثمار بسهولة عن طريق وضع المؤشر على حدوده واستخدام زر "حذف" من لوحة المفاتيح. أغلق الصورة. كرر نفس الإجراء بعد إكمال الخطوة تجزئة الثاني.
  10. في هذه المرحلة، إذا تم اختيار زر نعم لأتمتة الكامل من خوارزمية مستجمعات المياه القائمة على علامة، سيتم تطبيق المعلمات التي تم تعيينها سابقا على جميع الصور.
  11. إذا تم تحديد الزر NO، يتم فتح مربع معلومات، وطلب "تحديد العلامات الداخلية وضبطها". انقر على موافق وضمن واجهة ImageJ من الجليدية، انتقل إلى الإضافات | مورفورليبج | مينيما وماسمكا| الحد الأدنى والمُوسع. في العملية، حدد الموسع Minima.
  12. حدد معاينة لتصور مسبق على الصورة المفتوحة تلقائيًا نتيجة التحويل. نقل ديناميكية حتى يتم ملاحظة علامات الأمثل. العلامات هي مجموعات من وحدات البكسل بقيمة 255 (ليس بالضرورة بكسل أبيض). المعلمات المثلى تؤدي إلى علامة واحدة لكل كائن. التركيز على الكائنات المتبقية التي لم يتم تقسيم بشكل جيد مع أساليب التجزئة السابقتين.
  13. إذا لزم الأمر، تحسين علامات من خلال تطبيق عمليات مورفولوجية إضافية مثل "فتح" أو "إغلاق"(الإضافات | مورفورليبج | مرشحات مورفولوجية). عند الحصول على الصورة النهائية للعلامات ، والحفاظ على فتح وإغلاق جميع الصور الأخرى التي تنتهي مع الصورة المستخدمة في البداية كمدخل لعملية Minima الموسعة. انقر على لا إذا كان مربع ImageJ يطلب حفظ التغييرات على هذه الصورة.
  14. في المربع Nb الصور مع مربع المعلومات (المربع 14)، تحديد عدد الصور مع مربعات المعلومات يجب أن تظهر.
4. تجزئة E: السيتوبلازم المتجمع
  ملاحظة: تستخدم هذه الكتلة النوى المجزأة سابقاً كعلامات فردية لبدء تجزئة السيتوبلازم. تأكد من أن كتلة من تجزئة النوى قد تمت معالجتها قبل استخدامه.
  1. في مربع قناة السيتوبلازم (المربع 1)، تعيين قناة إشارة السيتوبلازمية.
  2. في المربع تمديد النوى مجزأة (مربع 2)، وكتابة الشكل المستخدم لحفظ الصور من النوى مجزأة (tif، jpeg، bmp، png). التنسيق الافتراضي هو tif.
  3. في المربع Text (box3) ، اكتب \Name المجلد الذي يحتوي على نُوى مجزأة.
  4. في مربع تنسيق الصور من السيتوبلازمات المجزأة (المربع 4)، تعيين تنسيق لاستخدامها لحفظ الكائنات مجزأة الصور (تيف، جيف، Jpeg، BMP، بابوا نيو غينيا).
  5. أثناء العملية، يتم إنشاء مجلد تلقائيا لحفظ الصور من السيتوبلازمات المجزأة. في المربع نص (المربع 5) ، اسم هذا المجلد (على: cytoplasms مجزأة). يتم إنشاء المجلد في المجلد الذي يحتوي على الصور المدمجة.
  6. اتبع نفس الخطوات كما في الخطوة 5.3.1 لتعيين معلمات مربعات تصفية جاوسي و Contours النشطة (كن حذراً، صفوف مربع ليست هي نفسها كما في الخطوة 5.3.1).
  7. تشغيل سير العمل (للحصول على التفاصيل، راجع الجزء 7).

6- الكشف عن الإشارات الفلورية وتحليلها

حدد الكتلة المتكيفة.
1. في كتلة تحليل Fluorescence A: 1 قناة، تنفيذ الكشف عن وتحليل بؤر في قناة واحدة داخل نوع واحد من كائن مجزأة: الكشف عن foci اللفائف (قناة حمراء) داخل النواة.
2. في كتلة التحليل Fluorescence B: 2 قنوات في نفس المقصورة،وإجراء الكشف وتحليل بؤر في قناتين داخل نوع واحد من كائن مجزأة: الكشف عن ملفين (قناة حمراء) و 53BP1 (القناة الخضراء) بؤر داخل النواة.
3. في كتلة التحليل Fluorescence C: 2 قنوات في مقصورتين، تنفيذ الكشف عن وتحليل البؤر في قناة واحدة أو قناتين ، وتحديدا داخل النوى والسيتوبلازم المقابلة لها : الكشف عن فوبين foci (القناة الحمراء) سواء داخل النواة وcytoplasm المقابلة لها أو الكشف عن foci Coilin (القناة الحمراء) داخل النواة وG3BPoci (القناة الخضراء) داخل cytoplasm المقابلة.
4. في الكتلة التحليل الفلوري D: النقل العالمي، حساب النسبة المئوية للإشارة من قناة واحدة في مقصورتين خلويتين (أ و ب). على سبيل المثال، في فحص نقل السيتوبلازم/النواة، يتم تصدير نسب مئوية محسوبة من الإشارات النووية والإشارات السيتوبلازمية لكل صورة في جدول البيانات النهائي "النتائج". وترد أدناه الصيغة المستخدمة لحساب النسبة المئوية للإشارة النووية. يمكن استخدام هذا الجزء لأي حجرة فرعية:
5. في الكتلة التحليل الفلوري E: نقل الخلية الفردية، حساب النسبة المئوية للإشارة من قناة واحدة في مقصورتين خلويتين لكل خلية. تم تحسين هذه الكتلة خصيصًا لم مقايسة نقل النواة/السيتوبلازم على مستوى الخلية الواحدة.
  ملاحظة: لأن كتلة تحليل Fluorescence E: فردي الخلية النقل ينفذ التحليل على مستوى خلية واحدة، وهناك حاجة إلى تجزئة فعالة من النواة والسيتوبلازم.
ربط الإخراج0 (ملف) من كتلة حدد مجلد (كتلة 1) لإدخال المجلد (الأسهم البيضاء في الدوائر السوداء) من كتلة المختارة.
تعيين معلمات الكتلة المختارة.
1. تحليل الفلوريسنس A: قناة واحدة، تحليل الفلوريسنس B: قناتان في نفس المقصورة وتحليل الفلوريسنس C: قناتان في مقصورتين
  1. في مربع مجلد صور ROI، اكتب اسم المجلد الذي يحتوي على صور الكائنات المجزأة مسبوقة مائلة. (على سبيل المثال: \جزئي النوى).
  2. في مربع تنسيق صور الكائنات المجزأة (المربع 2) ، اكتب التنسيق المستخدم لحفظ صور الكائنات المجزأة (tif ، jpeg ، bmp ، png). التنسيق الافتراضي هو tif.
  3. في المربع "قتل الحدود"؟، اكتب نعم لإزالة الكائنات الحدودية. وإلا، اكتب لا. مطلوب تثبيت مجموعة MorphoLibJ من ImageJ لاستخدام هذه الدالة (راجع الخطوة 5.3.3).
  4. في مربع (es) قناة البقع إشارة، تعيين القناة حيث يجب الكشف عن البقع. في صور RGB الكلاسيكية، 0=أحمر، 1= أخضر، و 2= أزرق.
  5. في المربعات اسم جزيء مترجمة، وكتابة اسم جزيء المترجمة إلى البقع. يعتمد عدد الحقول التي يجب إدخالها على عدد الجزيئات.
  6. في المربع (es) كتلة الكشف عن بقعة الموجي، تعيين معلمات الكشف عن بقعة لكل قناة. تعيين مقياس (ق) (المشار إليها إلى حجم بقعة)، وحساسية الكشف (حساسية أصغر يقلل عدد البقع المكتشفة، والقيمة الافتراضية هي 100 والحد الأدنى للقيمة يجري 0). وثائق شاملة من هذا البرنامج المساعد متاح على الانترنت: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. يمكن أيضا أن تكون المعلمات يدويا في تعريف الجليدية(الكشف والتتبع | بقعة كاشف).
  7. كخيار، في المربع تصفية العائد على الاستثمار حسب الحجم، تصفية الكائنات المجزأة حيث يتم الكشف عن البقع عن طريق تعيين فاصل زمني للحجم (بالبكسل). هذه الخطوة مفيدة بشكل خاص لإزالة الكائنات تحت أو أكثر من مجزأة. لتقدير حجم الكائنات يدوياً، راجع الخطوة 5.3.1. لا تتضمن المعلمات الافتراضية تصفية ROIs حسب الحجم. تحتوي القناتان 2 في مقصورتين على صندوقين: نُوَيّة الترشيح حسب الحجم (المربع 19) وتصفية السيتوبلازم حسب الحجم (الإطار 46).
  8. اختياريا، في مربع تصفية البقع حسب الحجم،تصفية البقع المكتشفة وفقا لحجمها (بالبكسل) لإزالة القطع الأثرية غير المرغوب فيها. لتقدير حجم البقعة يدويًا، انقر على الاكتشاف والتتبع وافتح المكوّن الإضافي للكشف عن Spot. في خيارات الإخراج، حدد تصدير إلى عائد الاستثمار . كن حذراً أن المعلمات الافتراضية لا تتضمن تصفية البقع حسب الحجم، وأن البقع المصفاة لا تؤخذ في الاعتبار للتحليل. يعتمد عدد الحقول التي يتم إدخالها على عدد القنوات.
  9. اختياريا، في المربع تصفية البقع،وتطبيق مرشح إضافي (التباين، التجانس، محيط، استدارة) على البقع الكشف عنها. كن حذراً أن المعلمات الافتراضية لا تتضمن تصفية بقعة وأن البقع المصفاة لا تؤخذ في الاعتبار للتحليل. يعتمد عدد الحقول التي يتم إدخالها على عدد القنوات.
  10. اختياريا، في المربعات عتبة حجم بقعة، تعيين عتبة للمنطقة (بالبكسل) من البقع المحللة. يتم تصدير عدد النقاط التي تم عدها أسفل هذه العتبة وفوقها في جدول بيانات النتائج النهائي. يعتمد عدد الصناديق التي سيتم إبلاغها على عدد القنوات.
  11. تشغيل سير العمل (للحصول على التفاصيل، راجع الجزء 7). يتم تصدير البيانات في جدول بيانات نتائج محفوظ في المجلد الذي يحتوي على صور مدمجة.
2. تحليل الفلورس D: النقل العالمي وتحليل الفلوريسين E: نقل الخلية الفردية:
  1. في المربعات صور المجلد (المربعين 1 و 2) ، اكتب \Name المجلد الذي يحتوي على صور الكائنات المجزأة. في الكتلة التحليل Fluorescence D: النقل العالمي، يتم تحديد نوعي عائد الاستثمار على أن عائد الاستثمار (ROI a) و ROI b. للكتلة تحليل Fluorescence E: نقل الخلية الفردية، في صور المجلدات ينجز نواة و مجلد صور cytoplasms صناديق مجزأة، وكتابة اسم المجلد الذي يحتوي على نوى مجزأة والسيتوبلازم، على التوالي.
  2. في مربع إشارة القناة (المربع 3)، أدخل قناة الإشارة.
  3. في مربع تنسيق الصور من الكائنات مجزأة (مربع 4) ، وكتابة تنسيق المستخدمة لحفظ الصور من الكائنات مجزأة (tif ، jpeg ، bmp ، بابوا غينيا الجديدة). التنسيق الافتراضي هو tif. يتوفر الخيار "حدود القتل" أيضاً لإزالة الكائنات حد (راجع الخطوة 6.3.1).
  4. اختياريا، في مربعات تصفية العائد على الاستثمار حسب الحجم، تصفية الكائنات مجزأة عن طريق تعيين فاصل زمني من الحجم (بالبكسل). قد تكون هذه الخطوة مفيدة لإزالة الكائنات تحت أو أكثر من تجزئة. لتقدير حجم الكائن يدوياً، راجع الخطوة 5.3.1. هناك حقلان للدخول، واحد لكل قناة. لا تتضمن المعلمات الافتراضية تصفية عائد الاستثمار حسب الحجم.
  5. تشغيل سير العمل (للحصول على التفاصيل، راجع الجزء 7). تصدير البيانات في جدول بيانات نتائج محفوظة في المجلد الذي يحتوي على الصور المدمجة.

7. تشغيل البروتوكول

لمعالجة كتلة واحدة في تشغيل، قم بإزالة الاتصال بين الكتلة المحددة و "مجلد تحديد الكتلة". ضع كتلة المطلوبين في رتبة 1^st. في الزاوية اليسرى العليا من كتلة المطلوبين، انقر على الرابط مباشرة إلى يمين المجلد. في مربع الحوار فتح الذي يظهر، انقر نقراً مزدوجاً فوق المجلد الذي يحتوي على الصور المدمجة. ثم، انقر على فتح. انقر فوق تشغيل لبدء سير العمل. يمكن إيقاف المعالجة بالنقر على الزر Stop.
لمعالجة كتل مختلفة في تشغيل، والحفاظ على اتصالات الكتل المختارة مع كتلة حدد مجلد (كتلة 1). تأكد من أن رتبتهم تسمح بمعالجة جيدة لسير العمل. على سبيل المثال، إذا احتاج كتلة معينة إلى كائنات مجزأة لمعالجة، تأكد من أن عمليات كتلة التجزئة قبل. قبل تشغيل سير العمل، قم بإزالة الكتل غير المستخدمة وحفظ البروتوكول الجديد باسم آخر.
انقر فوق تشغيل لبدء سير العمل. عند ظهور مربع الحوار المفتوح، انقر نقراً مزدوجاً فوق المجلد الذي يحتوي على الصور المدمجة. ثم، انقر على فتح. يتم تشغيل سير العمل تلقائيًا. إذا لزم الأمر، قم بإيقاف المعالجة بالنقر على الزر إيقاف.
في نهاية المعالجة، تحقق من أن الرسالة التي تم تنفيذها سير العمل بنجاح ظهرت في الزاوية اليمنى السفلى وأن يتم وضع علامة على كافة الكتل بعلامة خضراء(الشكل 2b). إذا لم يكن كذلك، كتلة وداخل مربع تقديم علامة الخطأ تشير إلى عنصر لتصحيح (الشكل 2b).
ملاحظة: بعد تنفيذ سير العمل بنجاح، لا يمكن بدء تشغيل جديد مباشرةً، ولمعالجة سير العمل مرة أخرى، يجب وضع علامة على كتلة واحدة على الأقل مع علامة "جاهز للمعالجة". لتغيير حالة كتلة حذف وإعادة إنشاء ارتباط بين مربعين داخل هذا الحظر أو ببساطة إغلاق ثم إعادة فتح البروتوكول. في حالة حدوث خطأ أثناء المعالجة، يمكن بدء تشغيل جديد مباشرة. أثناء تشغيل جديد، تتم معالجة كافة كتل خط الأنابيب، حتى إذا تم وضع علامة على بعضها مع علامة خضراء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تم تنفيذ جميع التحليلات الموصوفة على كمبيوتر محمول قياسي (معالج رباعي النواة 64 بت بسرعة 2.80 جيجاهرتز مع ذاكرة وصول عشوائي 16 جيجابايت (RAM)) يعمل مع إصدار 64 بت من Java. ذاكرة الوصول العشوائي هو معلمة هامة للنظر، اعتمادا على كمية ودقة الصور لتحليل. باستخدام نسخة 32 بت من جافا يحد من الذاكرة إلى حوالي 1300 ميغابايت، والتي يمكن أن تكون غير مناسبة لتحليل البيانات الضخمة، في حين أن إصدار 64 بت يسمح بزيادة الذاكرة المخصصة للCy. ويبين الشكل 3 الوقت اللازم لتجزئة أنواع مختلفة من الصور ومختلف القرارات. يؤكد أن دقة عالية زيادة كبيرة وقت تجزئة الكائن الأساسي.

توضح البيانات المعروضة في الفقرات التالية أنه يمكن استخدام سير عمل محلل الهيكل الفرعي لحل معظم المشاكل الشائعة التي تمت مواجهتها في البيولوجيا الخلوية والجزيئية (عد الخلايا، عد البؤر وتحليلها، تحليل النقل).

يمكن أن يكون القياس في العديد من الخلايا للنسبة الدقيقة للجزيئات التي تتركز داخل حجرة معينة أو تغيير التعريب عبر المجالات دون الخلوية مهمة مرهقة للغاية وعرضة للخطأ ، خاصة عندما يتم تنفيذها يدويًا. ويوضح الشكل 4 قدرة سير العمل على التحديد الدقيق والسريع لعملية النقل النووي الموصوفة جيداً لعامل النسخ NFκB استجابةً لتحفيز TNFα. تم تجميع الصور المستخدمة في التحليل بسخاء من قبل Ilya Ravkin (http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm) وهي متاحة للجمهور في مجموعة المعيار الحيوي العريض¹⁶. تحتوي هذه المجموعة على صور لخطوط الخلايا MCF7 و A549 المعالجة بتركيزات متزايدة من TNFα. وقد تم إجراء التحليل على أكثر من 40،000 خلية و 96 صورة (48 صورة لكل قناة) من خط الخلية MCF7(الشكل 4a). استغرق التحليل كله (من استيراد الصور إلى حفظ البيانات) 26 دقيقة. كل صورة يتوافق مع تركيز TNFα محددة. كانت الأبعاد النووية/السيتوبلازمية لـ NFκB متجانسة عبر جميع الخلايا للحصول على صورة معينة. لهذا السبب، لكل صورة، تم تلخيص قيم جميع البكسل النووي أو السيتوبلازمي لحساب النسب النووية والسيكتوبلازمية من NFκB، ولم يكن مطلوباً إضفاء الطابع الفردي على النيات اللمس/السيتوبلازمس أثناء تجزئة. تمت معالجة الصور DAPI في تجزئة C: كائنات متفاوتة المسافات مع كتلة الأشكال المحدبة إلى أجزاء nuclei واستخدمت القناة الخضراء لتحديد السيتوبلازمات مع تجزئة E: كتلة السيتوبلازم متفاوتة المسافات (الشكل 4b). تحليل Fluorescence D: تم استخدام كتلة النقل العالمي لتصدير مجموع قيم البكسل النووي والسيكتوبلازمي. والبيانات التي تم الحصول عليها ممثلة في منحنى الجرعة والاستجابة(الشكل 4 ج)وتوضح زيادة نسبة الطاقة النووية NFκB بعد التحفيز مع زيادة تركيزات TNFα.

لا يحلل سير العمل إشارة الكثافة العالمية في مختلف المقصورات الخلوية فحسب، بل يمكن استخدامه أيضًا للكشف عن البؤر واستخراج معلومات محددة حول ميزاتها. يوضح الشكل 5أ الكشف عن الأجسام P-ة في الخلايا الفردية عن طريق توطين محسن مرنا 4 (EDC4) البروتين. تم استخدام كتلة تجزئة A: كائنات غير متفاوتة المسافات لتجزئة النوى التي تقدم مستوى منخفض من التجمعات، وتجزئة E: كتلة السيتوبلازم متفاوت المسافات لتحديد السيتوبلازمس وتحليل Fluorescence C: 2 قنوات في مقصورتين للكشف عن بؤر EDC4. يتم تحديد الكائنات المجزأة (nuclei_0 المجزأة ، cytoplasms_0 المجزأة) ، ويتم جمع معلومات متعددة في ورقة العمل المقابلة (معلومات النوى المجزأة ومعلومات السيتوبلازمات المجزأة) مثل شدة الوسط EDC4 أو عدد / حجم الأجسام المكتشفة في كل عائد استثمار(الشكل 5b). قبل تحليلها، يمكن تصفية الأجسام المكتشفة بشكل أولي وفقًا لمجالها، والتي يمكن أن تكون مفيدة لاستبعاد الأجسام التي تقل قوة الدقة عن المجهر. لتقدير حجم الكائنات المحفوظة، يمكن إدخال عتبة مساحة إضافية. يتم الإبلاغ عن مناطق كافة الأجسام المكتشفة في أوراق عمل مخصصة (حجم nuclei_Distribution مجزّأة، حجم بؤري مجزأة cytoplasms_Distribution). في هذا المثال، نسلط الضوء على تحليل خليتين (nuclei_0 and_1 مجزأة cytoplasm_0 and_1)، حيث يتم الكشف عن بؤر EDC4 السيتوبلازمية. لاحظ أنه على الرغم من أن يتم الكشف عن إشارة من البروتين EDC4 في كل من مقصورات النووية والسيتوبلازم، إلا أن بؤر السيتوبلازمية تتوافق مع P-bodies. ورجحت أن تكون الإشارة النووية ناتجة عن التفاعلات المتبادلة للأجسام المضادة المستخدمة لإجراء تجارب الفلورس المناعية. يتم إعطاء حجم في بكسل من كل من بؤر.

ثم، كما أثر الأكسدة (OS) على الهيئات Cajal كان لا يزال غير معروف، ونحن الاستفادة من براعة سير العمل لدراستها خلال حركية الوقت (2 إلى 20 ساعة بعد نظام التشغيل التعريفي مع 500 μM H₂O₂)(الشكل 6). الأجسام Cajal هي هياكل ديناميكية nucleating وتذوب داخل nucleoplasm تحت سيطرة المعلمات محددة مثل معدل النسخ أو تطور دورة الخلية. تم تصور الهيئات Cajal عن طريق توطين المكون الهيكلي والوظيفي الرئيسي، والبروتين اللفائف. تم جمع معلومات حول عدد وحجم الأجسام Cajal من خلال دراسة 2300 خلية فردية من الصور عالية الدقة (3840X3072) تحتوي على 3 قنوات: DAPI (الأزرق)، 53BP1 (الأخضر) ولفائفين (أحمر)(الشكل 6a). استغرق المعالجة الكاملة أقل من 1 ساعة. لأن نوكلي قدم شكل محدب وبعضها كان متفاوتا، تم اختيار كتلة تجزئة C: تم اختيار الكائنات متفاوتة المسافات مع الأشكال المحدبة لتنفيذ تجزئة. كما هو معروف OS للحث على فواصل الحمض النووي حبلا مزدوجة (DDSBs), P53 ملزمة البروتين 1 (53BP1), المعروف أن يكون الأثر الأساسي لضرر الحمض النووي إشارات المسارات, واستخدمت كعلامة للتمييز بين الخلايا وشدد والخلايا غير وشدد. في الواقع ، في حالة عدم وجود أضرار الحمض النووي ، يتم توزيع 53BP1 بشكل متجانس داخل nucleoplasm ، في حين أنه بعد تلف الحمض النووي ، فإنه يركز على DDSBs ، والتي تشكل بؤرًا يسهل تمييزها في المجهر. تم تحليل عدد وحجم كل من 53BP1 وfoci في كل خلية النووية عن طريق استخدام كتلة تحليل Fluorescence B: 2 قنوات في نفس المقصورة. أولاً، ساعد تحليل بيانات 53BP1 على تحديد كل نقطة زمنية للحركيات أفضل عتبة لتصنيف الخلايا وفقًا لحالة الإجهاد الخاصة بها. بين الحركية كله، نظام التشغيل يدفع زيادة كبيرة من 53BP1 عدد بؤر مع زيادة 11 أضعاف في 2، 4، و 8 ح بعد تحريض نظام التشغيل (الشكل S1). هذا التأثير هو أقل وضوحا في 6 ح (6.5 أضعاف) بسبب ارتفاع مستوى الأولي من DSB في الخلايا غير وشدد. حتى بعد 20 ساعة، لا تزال هناك زيادة مستمرة (ما يقرب من 6 أضعاف). تعكس هذه البيانات كفاءة العلاج للحث على نظام التشغيل وإنشاء 53BP1 كعلامة ضغط فعالة لكل من الملاحظات المبكرة والمتأخرة في الفحص المجهري. من ناحية أخرى، لوحظت نسبة صغيرة من الخلايا المجهدة ذات مستوى منخفض من DDSBs في كل نقطة زمنية من الحركة، مما يشير إلى أن الخلايا ليست مؤكدة بشكل متجانس، مما يفرض أهمية استخدام علامة الإجهاد في تجارب الإجهاد. استنادا إلى تحليل ROC، تم اختيار عتبة إجمالية من 17 53BP1 بؤر للتمييز بين الخلايا وشدد و غير وشدد في جميع أنحاء الحركية (الشكل S1).

ثم تم تحليل عدد وحجم بؤر النووية من اللوين وفقا لحالة الإجهاد الخلية. لوحظت زيادة كبيرة في عدد البؤر 2 و 4 و 6 ح بعد الحث الإجهاد(الشكل 6b). ويلاحظ تأثير الأكثر استدامة في 2 ساعة, عدد الخلايا وجود أكثر من 10 بؤر زيادة من 0% في الخلايا غير مجهدة إلى 75% في الخلايا المجهدة. وعلاوة على ذلك، أكثر من 25٪ من الخلايا وشدد من تلك النقطة الزمنية كان أكثر من 20 فوبيين بؤر. هذا التأثير ينخفض تدريجيا حتى 8 ح. في 20 ح، لوحظ زيادة صغيرة من الربع الأول والثالث، ولكن البيانات تظهر أيضا أن 84٪ و 80٪ من الخلايا الحالية أقل من 8 بؤر في الخلايا غير وشدد وشدد، على التوالي. وتبين هذه البيانات أن نظام التشغيل أيضا آثار متأخرة على المعلمات التي تتحكم في نووية الأجسام Cajal، والتي قد تكون مختلفة عن الآثار المبكرة. ومن المثير للاهتمام، تحليل دقيق لملامح بؤرة الملف النووي كشف أن الزيادة الملحوظة في عدد من المنتسبين foci coilin مع انخفاض في حجمها (الشكل 6c). على سبيل المثال، 2 ح بعد نظام التشغيل التعريفي، ونسبة foci ملف مع منطقة أقل من 0.2 μm² يزيد من 26٪ إلى 64٪. هذا التأثير ينخفض حتى 8 ح، ولكن، على عكس عدد الهيئات Cajal'، لم يلاحظ أي تغيير كبير في 20 ساعة. وقد يعكس ذلك أن إعادة توزيع الأجسام التانية المبكرة والمتأخرة للهيئات الكاسلالية هي أحداث مختلفة.

بالإجمال يقترح هذا معطيات بقوّة أنّ [أوس] يغيّر القوة نواة من [كجل] أجسام, يُحفز إعادة توزيع نوويّة داخل يتعدّد بؤر صغيرة نوويّة. منذ نوى من الأجسام Cajal هو الدافع من البروتين والمكونات RNA، وهذا يشير إلى أن تأثير نظام التشغيل قد تغير تكوين الهيئات Cajal. داخل الأجسام Cajal، يتفاعل بروتين اللفائف مع العديد من شركاء البروتين المختلفة مثل مكونات مجمع SMN والبروتينات SM. هذه التفاعلات غالبا ما تنطوي على phosphodomains من اللفائف، ويمكن للمرء أن يتصور أن تعديل هيكل الهيئات Cajal يمكن ربطها إلى تغييرات في حالة الفسففور من الليفين. وعلاوة على ذلك، أظهرت الأعمال الحديثة أن الأجسام Cajal ليست موضعية بشكل عشوائي داخل النواة، ويمكن أن تؤثر على التعبير الجيني من خلال الارتباط القريب مع loci الجينات محددة¹⁷. وبالنظر إلى كل هذه الحقائق، لن يكون من المستغرب أن يصاحب تأثير على وظائف هيئات كاجل تغييرات في هيكلها. من هذه النتائج، يمكننا أيضا أن نسأل إذا كان مثل هذه Cajal الهيئات 'إعادة عرض نتيجة سلبية لنظام التشغيل أو يشارك في الاستجابة من خلال التفاعل مع loci الجينات محددة، على سبيل المثال.

لاختبار ما إذا كان تغيير في التعبير اللفائف يمكن أن يغير تعريبه وتغيير نواة الهيئات Cajal، ونحن overexed الخارجية GFP-ملفين البروتين الانصهار. لم يتم تجميع Nuclei، لذلك تم تنفيذ تجزئة مع كتلة تجزئة A: كائنات غير متفاوتة المسافات. ثم، لتحديد عدد وحجم بؤر اللولب (إشارة حمراء، القناة 1) وفقا لمستوى GFP-coilin (إشارة خضراء، قناة 2) overexpression، تم استخدام كتلة تحليل الفلوريسينس B: 2 قنوات في نفس المقصورة. وقد انعكس مستوى الملف GFP-coilin من خلال متوسط شدة إشارة GFP في النواة الفردية(الشكل 7a). في الخلايا ذات المستوى المتوسط أو العالي من GFP-coilin overexpression (كثافة GFP أعلى من 10)، وعدد الأجسام Cajal لكل نواة يزيد بشكل ملحوظ مع بعض النوى عرض ما يصل إلى 21 بؤر(الشكل 7b). لاحظنا أيضا أن سطوع (متوسط كثافة) من الأجسام Cajal يزيد بشكل كبير بالتوازي مع مستوى فرط التعبير مما يؤدي إلى كثافة التشبع. وهكذا فإن هذه المناطق المشبعة قد تخفي وجود بؤر أصغر حجماً وأكثر خفة. في الخلايا overexpressing مستوى متوسط أو مرتفع من GFP-coilin، وحجم الهيئات Cajal أيضا زيادات كبيرة، والقيم المتوسطة ترتفع من 1 إلى 2 μm² (الشكل 7c). وعلاوة على ذلك، أكثر من 25٪ من الخلايا ذات مستوى تعبير GFP-coilin عالية تقدم بؤر مع مساحة أكبر من 2.5 μm²، في حين أنها لا تتجاوز أبدا 0.8 μm² في الخلايا غير المُصابة. في الختام، GFP-Coilin فرط التعبير يؤدي إلى زيادة كبيرة في كل من عدد وحجم الهيئات Cajal. منذ نظام التشغيل يزيد من عدد الهيئات Cajal ولكن يقلل من حجمها، وهذه البيانات قد تعكس أن تأثير نظام التشغيل على هيكل الهيئات Cajal هو على الأرجح الناجمة عن تغيير تكوينها بدلا من تأثير على كمية الخلوية من اللفائف.

الشكل 1: خط أنابيب محلل البنية الفرعية
تم تطوير سير العمل في الجليدية، منصة المجتمع المفتوح للمعلوماتية الصورة الحيوية، ويقوم بإجراء تحليل تلقائي للصور المجهرية الفلورية متعددة. أولاً، يتم تحميل الصور متعددة القنوات تلقائيًا داخل البروتوكول ومعالجتها مسبقًا لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، إذا لزم الأمر، وإزالة القطع الأثرية التصويرية. ثم، عزل تجزئة الصورة المناطق ذات الاهتمام (ROIs) من الخلفية. تتوفر عدة طرق للتجزئة حسب مستوى التجميع وطبيعة الكائنات ذات الأهمية. يتم حفظ الكائنات المجزأة باستخدام واصف محدد (على سبيل المثال، صورة name_Nucleus_1) في مجلد معين ويمكن استخدامها/إعادة استخدامها للتحليل اللاحق. ثم يتم تحليل إشارات الفلورسنت مثل البقع داخل ROIs ويتم تصدير ميزات متعددة (الموقع والحجم والشكل والكثافة والملمس والرقم الموضعي والحجم) إلى جدول بيانات يتم إنشاؤه تلقائيًا. ويتم إبلاغ كل المعالم المقاسة، مثل عدد البقع المكتشفة، إلى واصف عائد الاستثمار المقابل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: واجهة رسومية لسير العمل الجليدي
(أ)يتكون سير العمل من 13 كتل عامة ، والتي يمكن تجميعها وفقًا لوظيفتها العامة: اختر مجلدًا (كتلة 1) يسمح بالوصول إلى الصور ؛ يتم استخدام قنوات دمج (كتلة 2) لدمج قنوات مختلفة من الصور. يتم تخصيص كتل 3 إلى 8 لتجزئة الكائن، كل واحد يجري تكييفها لسياق معين: تجزئة A: الكائنات غير متفاوتة المسافات، B: الكائنات متفاوتة المسافات، تجزئة C: كائنات متفاوتة المسافات مع الأشكال المحدبة، تجزئة D: كائنات متفاوتة الأشكال غير منتظمة (كتلة 7، يعمل بالارتباط مع كتلة 6)، تجزئة E: cytoplasms متفاوت المسافات. وتستخدم كتل 9 إلى 11 لحساب / تحليل بؤر داخل مقصورات تحت الخلية: تحليل الفلوريسين A: 1 قناة، تحليل Fluorescence B: 2 قنوات في نفس المقصورة وتحليل Fluorescence C: 2 قنوات في مقصورتين. يتم تكييف كتل 12 و 13 لتحليل الأحداث النقل: تحليل الفلوريسين D: النقل العالمي وتحليل الفلوريسين E: نقل الخلية الفردية. (ب)عرض عالمي لبنية كتلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الوقت اللازم للتجزئة كدالة من دقة الصورة ومستوى تجميع الكائن
(أ) رسم بياني للوقت اللازم لتنفيذ التجزئة اعتمادا على دقة الصورة ومستوى التجمع. تم اختبار كتلتين مختلفتين: تجزئة A (للكائنات غير متفاوتة المسافات) و تجزئة D (للكائنات متفاوتة المسافات ذات الأشكال غير المنتظمة). يتم رسم وقت المعالجة (بالثواني لكل صورة) كدالة لدقة وضوح الصورة (عدد البكسل). (ب) مثال على الصور التي تم تحليلها إما مع كتلة التجزئة A أو التجزئة D. يشار إلى تلطيخ DAPI والنوى المجزأة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تحليل سير العمل لم مقايسة نقل نووي NFκB استجابة لتحفيز TNFα
(أ)مثال لصور خلايا MCF7 البشرية (الإنسان سرطان الثدي خط الخلية) تعامل مع TNFα من مجموعة صور BBBC014 (مجموعة مرجعية واسعة الصورة الحيوية)¹². وقد تمت دراسة توطين عامل النسخ NFκB في الخلايا المعالجة بتركيزات متزايدة من 12 من TNFα (من 0 إلى 10^-7غ/مل). لكل تركيز، تم إجراء 4 نسخ متماثلة. تم معالجة الصور DAPI (قناة زرقاء) في تجزئة C: الأجسام متفاوتة المسافات مع كتلة الأشكال المحدبة إلى جزية nuclei، ومن ثم تم استخدام تلطيخ NFκB مع FITC (قناة خضراء) لتحديد السيتوبلاسمس مع تجزئة E: كتلة السيتوبلازم المتجمعة. تحليل Fluorescence D: تم استخدام كتلة النقل العالمي لتصدير مجموع قيم البكسل النووي والسيكتوبلازمي. (ب)تستخدم النوى المجزأة (الرمادية) والسيكوبلازم (أبيض) لتحديد الكثافة الكلية لإشارة الفلورسنت NFκB في كل حجرة. (ج)يوضح منحنى الجرعة والاستجابة التي تم الحصول عليها من تحليل البيانات زيادة نسبة الطاقة النووية النووية في النفاح الوطنية مع زيادة تركيزات TNFα. الصور في تنسيق BMP 8 بت، وحجم الصورة هو 1360 × 1024 بكسل. لكل تركيز، يتم حساب الانحراف المعياري بين النسخ المتماثلة 4 و يتم توضيحه كأضاءات خطأ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: القياس الكمي لـ EDC4 (P-bodies) داخل السيتوبلازم في الخلايا الفردية
(أ)التلطيخ المشترك مع DAPI (قناة زرقاء) و Phalloidin (قناة حمراء) يسمح تجزئة وتحديد نواة الخلية وF-actin، على التوالي. يتم استخدام بروتين EDC4 (القناة الخضراء) كعلامة للكشف عن الأجسام P-ة المعروفة بأنها السيتوبلازمية حصرا. شريط مقياس، 10 ميكرومتر(ب) يتم عد Foci، ويتم تصدير العديد من الميزات (هنا منطقتهم بالبكسل) إلى جدول بيانات النتائج المنظم في عدة أوراق. ورقتان مخصصتان لتحليل النوى و ورقتين لتحليل السيتوبلازمات. كل الخام تضمين المعلومات من عائد استثمار معين. في أوراق معلومات Nucleus/Cytoplasm، يتم تصدير خصائص الكائنات المجزأة (معرف العائد على الاستثمار والحجم وشدة الوسط)، متبوعة بعدد البؤر المكتشفة داخل كل عائد استثمار. إذا لزم الأمر، يمكن إضافة عتبة حجم (100 بكسل في هذا المثال) ويتم الإعلام عن عدد بؤر أسفل هذه العتبة وأعلى في العمودين الأخيرين. في Nucleus/Cytoplasm_Distribution من أوراق حجم البؤر، يتم الإبلاغ عن المنطقة (بالبكسل) من كافة البؤر المكتشفة في الخام من عائد الاستثمار المطابق. في هذا المثال، نسلط الضوء على تحليل خليتين (مجزأة cytoplasm_0 and_1)، حيث تم الكشف عن بؤر EDC4 السيتوبلازمية. كما يتم إعطاء حجم في بكسل من كل من بؤر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: حركية من اللوين و 53BP1 توزيع النوى بعد الإجهاد التأكسي
واستند تحليل عدد وحجم البؤر على أكثر من 110 خلية فردية لكل نقطة زمنية من 3 حركيات مستقلة. (أ)الكشف المناعي من اللوين و 53BP1 بؤر في خلايا HeLa S3 في جميع أنحاء حركية العلاج مع 500 μM H₂O₂. 53BP1 يركز على مواقع الاستراحة المزدوجة للحمض النووي ويستخدم لتقييم كفاءة العلاج على كل خلية. يتم إثراء ملفين في الهيئات Cajal. تم إصلاح الخلايا 2, 4, 6, 8, و 20 ح بعد الحث على الاكسدة والأكسدة الملطخة مع المضادة لللفائف (قناة حمراء) ومكافحة 53BP1 (قناة خضراء) الأجسام المضادة. شريط مقياس، 10 μm.(ب)عدد بؤر الملف النووي بعد الأكسدة. تظهر النتائج كمؤامرة مربع ، حيث العلامة المركزية هي الوسيط ، والحافتان السفلية والعلوية للمربع هما^المئين 25^th و 75. في الخلايا المعالجة H₂O₂، يتم الكشف عن زيادة كبيرة في عدد من foci اللفائف وهو أقصى بعد 2 و 4 ساعة من العلاج. ويلكاكسون - تحليل اختبار مان ويتني يوضح وجود فرق كبير بين الخلايا المعالجة غير المعالجة وH₂O₂ (*، p< 0.05؛ **، p<0.01؛ ***، p<0.001). (ج) نسبة الخلايا في وظيفة منطقة فوازين بؤرية (μm²). معظم بؤر لها مساحة أصغر في 2 ساعة و 4 نقاط ساعة بالمقارنة مع عنصر التحكم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: دراسة نوية الأجسام Cajal 'في الخلايا overexpressing بروتين الانصهار GFP-coilin
(أ)كانت خلايا HeLa S3 مصابة بشكل عابر في ثلاثية الليكات البيولوجية مع 500 نانوغرام من البلازميد التعبير عن بروتين الانصهار GFP-Coilin باستخدام إجراء قياسي اتباعا لتوصيات الشركة المصنعة. بعد 48 ساعة، تم إصلاح الخلايا وملطخة بالجسم المضاد ضد اللوين. يسمح DAPI (قناة زرقاء) لشريحة النوى. لهذه التحليلات، تم تحليل أكثر من 100 خلية. تعكس إشارة GFP تعريب بروتين اللفائف الخراجية -GFP (القناة الخضراء)، في حين أن إشارة اللفائف (القناة الحمراء) تتوافق مع كل من توطين البروتين الداخلي والخارجية. لكل نواة، يعكس متوسط شدة إشارة GFP مستوى التعبير الملفي. وفقا لهذه المعلمة، تم تحليل ملامح من بؤر كويلين باستخدام كتلة تحليل الفلوريسنس B: 2 قنوات في نفس المقصورة. شريط مقياس، 10 ميكرومتر.(ب)العلاقة بين عدد من foci ملف ويعني كثافة GFP لكل نواة. وتظهر النتائج على أنها مخططات مربع، حيث العلامة المركزية هي الوسيط، والحافة السفلى والعليا من مربع هي 25^و 75^{المئين.} ويلكاكسون - تحليل اختبار مان ويتني يوضح زيادة كبيرة في عدد بؤر كثافة GFP > 10 (*، p< 0.05؛ **، p<0.01؛ ***، p<0.001). (ج)العلاقة بين منطقة بؤر اللفائف ويعني كثافة GFP لكل نواة. وتظهر النتائج على أنها مخططات مربع، حيث العلامة المركزية هي الوسيط، والحافة السفلى والعليا من مربع هي 25^و 75^{المئين.} ويلكاكسون - تحليل اختبار مان ويتني يوضح زيادة كبيرة في مساحة بؤر اللفائف لكثافة GFP > 10 (*، p<0.05؛ **، p<0.01؛ ***، p<0.001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل S1: حركية 53BP1 توزيع نوكلوبازميك بعد الإجهاد التأكسي
(أ)القياس الكمي لـ 53BP1 بؤر النووية في غير المعالجة أو H₂O₂ الخلايا المعالجة بعد أوقات حضانة مختلفة. وتظهر النتائج على أنها مخططات مربع، حيث العلامة المركزية هي الوسيط، والحافة السفلى والعليا من مربع هي 25^و 75^{المئين.} ويلكاكسون - تحليل اختبار مان ويتني يوضح وجود فرق كبير بين الخلايا المعالجة غير المعالجة وH₂O₂ (*، p< 0.05؛ **، p<0.01؛ ***، p<0.001). (ب)لكل نقطة زمنية من الحركية، تم إنشاء منحنى ROC (جهاز الاستقبال خصائص التشغيل) لتحديد أفضل عتبة للتمييز بين الخلايا المجهدة والخلايا غير المجهدة. يتم الإبلاغ عن معلمات كل اختبار في الجدول (الحساسية، التحديد، TP: إيجابية حقيقية، TN: صحيح سلبي، FP: إيجابية كاذبة، FN: سلبية كاذبة). ومن هذه البيانات، تم تصميم عتبة عالمية قدرها 17 بؤرة 53BP1 على التمييز مع التشديد من الخلايا غير المجهدة من خلال الحركية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عدد متزايد من البرمجيات الحرة المتاحة لتحليل الصور الخلايا المفلورة. يجب على المستخدمين اختيار البرامج المناسبة بشكل صحيح وفقا لتعقيد إشكالية ، إلى معرفتهم في معالجة الصور ، والوقت الذي يريدون قضاءه في تحليلهم. الجليدية، CellProfiler، أو ImageJ / فيجي هي أدوات قوية تجمع بين قابلية الاستخدام والوظائف³. Icy هي أداة قائمة بذاتها التي تقدم واجهة مستخدم رسومية واضحة (GUI)، ولا سيما "بروتوكولات" نقطة وانقر فوق واجهة التي من خلالها سير العمل يمكن بسهولة تصميم أو التلاعب⁴. يتم تعزيز وظيفة هذا البرنامج من خلال دعم واستخدام المكونات الإضافية ImageJ ، والكثير من الوثائق متاحة بفضل مجتمعها الكبير من المستخدمين. استخدمنا هذا المزيج القوي من قابلية الاستخدام والوظائف للبرامج الجليدية لتطوير سير عمل محلل الهيكل الفرعي. وهدفها الرئيسي هو اقتراح حل آلي لإجراء تحليل كامل للإشارة الفلورية الخلية من صور متعددة. يشمل التحليل المعالجة المسبقة للصورة وتجزئة الكائن وتحليل الإشارة الفلورسنت.

يتم مشاركة العديد من البروتوكولات بامتنان على موقع Icy ويقترح استخدام وظائف الجليدية للكشف عن الإشارات الفلورية وتحليلها مثل البؤر الخلوية. ومع ذلك، بعض هذه البروتوكولات معالجة صورة واحدة فقط لكل تشغيل أو لا تصدير النتائج في ملف معين أو تحليل قناة واحدة. ولا تحتوي بعض الخوارزميات على تجزئة أولية لتحديد المناطق ذات الأهمية (ROIs) أو اقتراح خوارزميات بسيطة مثل "HK-means" التي لا تناسب تجزئة الكائنات ذات المجموعات العالية. محلل الهيكل الفرعي بأتمتة جميع خطوات تحليل الصورة من معالجة ما قبل الصورة لتجزئة الكائنات والكشف / تحليل الإشارات الفلورية. يقترح البروتوكول أيضاً طرق بسيطة أو أكثر تعقيداً لتجزئة الكائن وتصدير البيانات (أسماء الكائنات المجزأة، تحليل البؤر) في مخرجات محسنة مكيفة مع المشكلة. CellProfiler تقترح أيضا خطوط أنابيب قوية تتألف من الوحدات التي تغلف وظائف¹⁸^،¹⁹. خطوط الأنابيب المتاحة هي تتكيف بشكل جيد مع مشاكل محددة. مهام سير العمل الجليدية هي شبكة من مربعات مختلفة، كل منها تنفيذ مهمة معينة. من خلال واجهة "بروتوكولات" ، وصناديق تؤلف الشبكة هي بديهية وسهلة لمعالجة. يتم تكييف محلل الهيكل الفرعي لعدة سياقات مثل الدمج البسيط للقنوات ، والتخصيصة الكمية لتوزيع الإشارات الفلورية بين مقصورتين فرعيتين ، وتحليل البؤر في قناة واحدة أو عدة قنوات من مقصورات خلوية واحدة أو اثنتين في الخلايا الفردية. تسمح عدة شاشات عرض بتصور النتائج المتوسطة أثناء كل تشغيل للتحكم في المعالجة. وعلاوة على ذلك، يقدم Icy أشرطة الرموز التي تجمع الأساليب حسب الموضوع والتي يمكن من خلالها معالجة الوظائف الموجودة في سير العمل بشكل منفصل لاختبار معلمات محددة يدويًا على بعض الصور قبل استخدامها في مجموعة صور كاملة.

كما هو الحال في حقل تحليل الصورة الحيوية، فإن الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي تجزئة الكائن. يقترح البروتوكول تجزئة الكائنات الأساسية، والتي هي في معظم نواة الخلية الزمنية، ويحتوي أيضًا على كتلة أخرى مهمة تقسيم نوع ثاني من الكائنات داخل الخلية. يمكن أن يكون تجزئة النوى صعبة عندما تكون الكائنات مجمعة للغاية بحيث تلمس أو تتداخل مع بعضها البعض. وترد بدائل مختلفة لتجزئة الكائنات الأساسية في البروتوكول، وفقا لشكل الكائنات ومستوى التجمع حتى لو لم يكن حتى الآن نجاح خوارزمية عالمية في تجزئة كاملة من الأجسام ذات المسافات العالية. عملية التجزئة محدودة بشكل رئيسي بتحديد المعلمات الصحيحة التي يمكن أن تجزئة جزء من الكائنات بنجاح ولكن يؤدي إلى أقل أو أكثر من تجزئة جزء آخر. يجب على المستخدم تنفيذ عمليات تشغيل مختلفة مع معلمات مختلفة للحصول على تجزئة صحيحة نهائية، خاصة بالنسبة للكائنات متفاوتة المسافات التي تقدم أشكالًا غير متجانسة وغير محدبة.

هذا البروتوكول هو في الغالب محدودة من قبل خطوة تجزئة، والتي يمكن أن تكون مستهلكة للوقت للغاية وتحتاج إلى تكوين الكمبيوتر قوية للحالات الأكثر تعقيدا. وبشكل أكثر تحديداً، كلما كانت الصور أكثر عدداً أو تعقيداً (كائنات متفاوتة المسافات إلى قطعة، عدد كبير من البيكسلات في الصور)، كلما تطلب المستخدم الوصول العشوائي أكثر إلى الذاكرة (RAM). على الصعيد العالمي، لأية مشكلة، سيحتاج المستخدم إلى تشغيل البروتوكول على 64 بت بيئة وقت تشغيل جافا (متاحة بحرية على موقع جافا) واستخدام نظام تشغيل 64 بت (OS) لزيادة الذاكرة المتاحة المستخدمة من قبل الجليدية (الذاكرة محدودة إلى 1300 ميغابايت ل32 بت JRE). وبسبب البرنامج النصي، لا يعمل البروتوكول بشكل صحيح على كمبيوتر Mac. وعلاوة على ذلك، يزداد عدد البارامترات مع تعقيد المشكلة وسيتطلب مزيدا من المعرفة في تحليل الصور. فيما يتعلق بمعايير الأداء الوظيفي، لم يتم بعد تكييف هذا البروتوكول لتحليل الصور المكدسة (مداخن الوقت، ورصة z) حتى لو كان Icy يقوم بتحليلات على هذا النوع من البيانات.

سيتم تحقيق التحديثات المستقبلية بشكل ملحوظ لتحسين تجزئة الكائنات مجمعة معقدة. وسيتم تطوير كتل إضافية لتكييف تجزئة الهياكل الخلوية المتجمعة ذات الأشكال غير المحدبة غير النظامية. كما سنقوم بتكييف سير العمل لتحليل الوقت و رصة z (للتصوير المباشر والبيانات ثلاثية الأبعاد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم G.H. من قبل زمالة الدراسات العليا من Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. وقد تم دعمها من قبل زمالة الدراسات العليا من معهد الكانتيرولوجيا دي لورين (ICL)، في حين تم دعم Q.T. من قبل منحة عامة أشرفت عليها وكالة البحوث الوطنية الفرنسية (ANR) كجزء من "Investissements d'Avenir" برنامج FIGHT-HF (المرجع: ANR-15-RHU4570004). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل CNRS وجامعة لورين (UMR 7365).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free	Thermo Fisher Scientific	28908	to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-11008	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21425	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A34055	fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA)	euromedex	04-100-812-E
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796-500ml	cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040-5ML	mounting medium
Human: HeLa S3 cells	IGBMC, Strasbourg, France		cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	H1009-100ml	used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668-019	transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin	abcam	ab11822	Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope	Nikon		epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	transfection medium
PBS pH 7.4 (10x)	gibco	70011-036	to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1	Thermo Fisher Scientific	PA1-16565	53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4	Sigma-Aldrich	SAB4200114	EDC4-specific antibody
Triton X-100	Roth	6683	to permeabilize the cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
Molecular Devices. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software. , Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018).
Nikon. NIS-Elements Imaging Software. , Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014).
Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
D'Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).

Bioengineering

محلل البنية الفرعية: سير عمل سهل الاستخدام للاستكشاف السريع والتحليل الدقيق للأجسام الخلوية في صور المجهر الفلوري

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.