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Bioengineering

Analyseur de sous-structure : Un flux de travail convivial pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans les images de microscopie de fluorescence

Published: July 15, 2020 doi: 10.3791/60990
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, 2Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

Summary

Nous présentons un flux de travail librement disponible construit pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans des compartiments cellulaires spécifiques dans des images de microscopie de fluorescence. Ce flux de travail convivial est conçu sur le logiciel open-source Icy et utilise également les fonctionnalités ImageJ. Le pipeline est abordable sans connaissance dans l’analyse d’image.

Abstract

La dernière décennie a été caractérisée par des percées dans les techniques de microscopie de fluorescence illustrées par l’amélioration de la résolution spatiale, mais aussi dans l’imagerie à cellules vivantes et les techniques de microscopie à haut débit. Cela a conduit à une augmentation constante de la quantité et de la complexité des données de microscopie pour une seule expérience. Étant donné que l’analyse manuelle des données de microscopie prend beaucoup de temps, qu’elle est subjective et qu’elle interdit les analyses quantitatives, l’automatisation de l’analyse de la bioimage devient presque inévitable. Nous avons construit un flux de travail informatique appelé Substructure Analyzer pour automatiser entièrement l’analyse du signal dans les bioimages à partir de la microscopie fluorescente. Ce flux de travail est développé sur la plate-forme open-source iux conviviale et est complété par des fonctionnalités d’ImageJ. Il comprend le pré-traitement des images pour améliorer le rapport signal/bruit, la segmentation individuelle des cellules (détection des limites cellulaires) et la détection/quantification des corps cellulaires enrichis dans des compartiments cellulaires spécifiques. Le principal avantage de ce flux de travail est de proposer des fonctionnalités complexes de bio-imagerie aux utilisateurs sans expertise en analyse d’image via une interface conviviale. En outre, il est très modulaire et adapté à plusieurs questions allant de la caractérisation de la translocation nucléaire/cytoplasmique à l’analyse comparative de différents corps cellulaires dans différentes sous-structures cellulaires. La fonctionnalité de ce flux de travail est illustrée par l’étude des corps Cajal (enroulés) dans des conditions de stress oxydatif (OS). Les données de la microscopie de fluorescence montrent que leur intégrité dans les cellules humaines est affectée quelques heures après l’induction de l’OS. Cet effet est caractérisé par une diminution de la nucléation de la coiline dans les corps cajal caractéristiques, associée à une redistribution nucléoplasmique de la coiline dans un nombre accru de foyers plus petits. Le rôle central de la coiline dans l’échange entre les composants CB et le nucléoplasme environnant suggère que la redistribution induite par l’OS de la coiline pourrait affecter la composition et la fonctionnalité des corps de Cajal.

Introduction

La microscopie légère et, plus particulièrement, la microscopie de fluorescence sont des techniques robustes et polyvalentes couramment utilisées en sciences biologiques. Ils donnent accès à la localisation précise de diverses biomolécules comme les protéines ou l’ARN par leur étiquetage fluorescent spécifique. La dernière décennie a été caractérisée par des progrès rapides dans les technologies de microscopie et d’imagerie comme en témoigne le prix Nobel de chimie 2014 qui récompense Eric Betzig, Stefan W. Hell et William E. Moerner pour le développement de la microscopie de fluorescence super-résolue (SRFM)1. SFRM contourne la limite de diffraction de la microscopie optique traditionnelle pour l’introduire dans la nanodimension. L’amélioration des techniques comme l’imagerie vivante ou les approches de dépistage à haut débit augmente également la quantité et la complexité des données à traiter pour chaque expérience. La plupart du temps, les chercheurs sont confrontés à des populations hétérogènes élevées de cellules et veulent analyser les phénotypes au niveau unicellulaire.

Au départ, des analyses telles que le comptage des foyers ont été effectuées par l’œil, ce qui est préféré par certains chercheurs car il fournit un contrôle visuel complet sur le processus de comptage. Toutefois, l’analyse manuelle de ces données prend trop de temps, entraîne une variabilité entre les observateurs et ne donne pas accès à des fonctionnalités plus complexes de sorte que les approches assistées par ordinateur sont de plus en plus largement utilisées et presqueinévitables 2. Les méthodes informatiques de Bioimage augmentent considérablement l’efficacité de l’analyse des données et sont exemptes de la subjectivité inévitable de l’opérateur et du biais potentiel de l’analyse manuelle de comptage. L’augmentation de la demande dans ce domaine et l’amélioration de la puissance informatique ont conduit au développement d’un grand nombre de plates-formes d’analyse d’images. Certains d’entre eux sont disponibles gratuitement et donnent accès à divers outils pour effectuer l’analyse avec des ordinateurs personnels. Une classification des outils d’accès libre a été récemment établie3 et présente Icy4 comme un logiciel puissant combinant la facilité d’utilisation et la fonctionnalité. De plus, Icy a l’avantage de communiquer avec ImageJ.

Pour les utilisateurs qui n’ont pas d’expertise en analyse d’image, les principaux obstacles sont de choisir l’outil approprié en fonction des paramètres problématiques et correctement régler qui sont souvent mal compris. De plus, les temps d’installation sont souvent longs. Icy propose une interface point-and-click conviviale nommée « Protocoles » pour développer le flux de travail en combinant certains plugins trouvés dans une collection exhaustive4. La conception modulaire flexible et l’interface point-and-click rendent la mise en place d’une analyse réalisable pour les non-programmeurs. Nous présentons ici un flux de travail appelé Substructure Analyzer, développé dans l’interface de Icy, dont la fonction est d’analyser les signaux fluorescents dans des compartiments cellulaires spécifiques et de mesurer différentes caractéristiques comme la luminosité, le nombre de foyers, la taille des foyers et la distribution spatiale. Ce flux de travail aborde plusieurs questions telles que la quantification de la translocation du signal, l’analyse des cellules transfectées exprimant un journaliste fluorescent, ou l’analyse des foyers de différentes sous-structures cellulaires dans les cellules individuelles. Il permet le traitement simultané de plusieurs images, et les résultats de sortie sont exportés vers une feuille de calcul délimitée par onglets qui peut être ouverte dans les programmes de feuille de calcul couramment utilisés.

Le pipeline De substructure Analyzer est présenté à la figure 1. Tout d’abord, toutes les images contenues dans un dossier spécifié sont pré-traitées pour améliorer leur rapport signal/bruit. Cette étape augmente l’efficacité des étapes suivantes et diminue le temps de fonctionnement. Ensuite, les régions d’intérêt (ROV), correspondant aux zones d’image où le signal fluorescent doit être détecté, sont identifiées et segmentées. Enfin, le signal fluorescent est analysé et les résultats sont exportés dans une feuille de calcul délimitée par onglets.

La segmentation des objets (détection des limites) est l’étape la plus difficile dans l’analyse d’image, et son efficacité détermine la précision des mesures cellulaires résultantes. Les premiers objets identifiés dans une image (appelés objets primaires) sont souvent des noyaux d’images tachées d’ADN (taches DAPI ou Hoechst), bien que les objets primaires puissent aussi être des cellules entières, des perles, des taches, des tumeurs ou tout autre objet taché. Dans la plupart des images biologiques, les cellules ou les noyaux se touchent ou se chevauchent, ce qui provoque l’échec des algorithmes simples et rapides. À ce jour, aucun algorithme universel ne peut effectuer une segmentation parfaite de tous les objets, principalement parce que leurs caractéristiques (taille, forme ou texture) modulent l’efficacité de la segmentation5. Les outils de segmentation couramment distribués avec des logiciels de microscopie (tels que le logiciel d’imagerie MetaMorph par Molecular Devices6, ou le logiciel NIS-Elements Advances Research par Nikon7) sont généralement basés sur des techniques standard telles que l’appariement de corrélation, le seuil ou les opérations morphologiques. Bien qu’efficaces dans les systèmes de base, ces méthodes surgénéralisées présentent rapidement des limites lorsqu’elles sont utilisées dans des contextes plus difficiles et spécifiques. En effet, la segmentation est très sensible aux paramètres expérimentaux tels que le type de cellule, la densité cellulaire ou les biomarqueurs, et nécessite souvent des ajustements répétés pour un grand ensemble de données. Le flux de travail Substructure Analyzer intègre des algorithmes simples et plus sophistiqués pour proposer différentes alternatives adaptées à la complexité de l’image et aux besoins des utilisateurs. Il propose notamment l’algorithme de bassin versant8 basé sur des marqueurs pour les objets fortement groupés. L’efficacité de cette méthode de segmentation repose sur la sélection de marqueurs individuels sur chaque objet. Ces marqueurs sont choisis manuellement la plupart du temps pour obtenir des paramètres corrects pour la segmentation complète, ce qui prend beaucoup de temps lorsque les utilisateurs font face à un grand nombre d’objets. Substructure Analyzer propose une détection automatique de ces marqueurs, offrant un processus de segmentation très efficace. La segmentation est, la plupart du temps, l’étape limitante de l’analyse d’image et peut modifier considérablement le temps de traitement en fonction de la résolution de l’image, le nombre d’objets par image, et le niveau de regroupement des objets. Les pipelines typiques nécessitent de quelques secondes à 5 minutes par image sur un ordinateur de bureau standard. L’analyse d’images plus complexes peut nécessiter un ordinateur plus puissant et des connaissances de base dans l’analyse d’images.

La flexibilité et la fonctionnalité de ce flux de travail sont illustrées par divers exemples dans les résultats représentatifs. Les avantages de ce flux de travail sont notamment affichés par l’étude des sous-structures nucléaires dans des conditions de stress oxydatif (OS). L’OS correspond à un déséquilibre de l’homéostasie redox en faveur des oxydants et est associé à des niveaux élevés d’espèces réactives d’oxygène (ROS). Puisque ros agissent comme molécules de signalisation, les changements dans leur concentration et la localisation subcellulaire affectent positivement ou négativement une myriade de voies et de réseaux qui régulent les fonctions physiologiques, y compris la transduction du signal, les mécanismes de réparation, l’expression des gènes, la mort cellulaire, et la prolifération9,10. OS est donc directement impliqué dans diverses pathologies (maladies neurodégénératives et cardiovasculaires, cancers, diabète, etc.), mais aussi dans le vieillissement cellulaire. Par conséquent, déchiffrer les conséquences de l’OS sur l’organisation et la fonction de la cellule humaine constitue une étape cruciale dans la compréhension des rôles de l’OS dans le début et le développement des pathologies humaines. Il a été établi que l’OS régule l’expression des gènes en modulant la transcription à travers plusieurs facteurs de transcription (p53, Nrf2, FOXO3A)11, mais aussi en affectant la régulation de plusieurs processus co- et post-transcriptionnels tels que l’épissage alternatif (AS) des pré-ARN12,13,14. L’épissage alternatif des transcriptions primaires de codage et de non-codage est un mécanisme essentiel qui augmente la capacité d’encodage des génomes en produisant des isoformes de transcription. AS est effectuée par un énorme complexe de ribonucléoprotéines appelé splicéosome, contenant près de 300 protéines et 5 RN nucléaires riches en U (UsnARN)15. L’assemblage splicéosome et l’AS sont étroitement contrôlés dans les cellules et certaines étapes de la maturation splicéosome se produisent dans les compartiments nucléaires sans membrane nommés Cajal Bodies. Ces sous-structures nucléaires se caractérisent par la nature dynamique de leur structure et leur composition, qui sont principalement menées par des interactions multivalentes de leur ARN et des composants protéiques avec la protéine coiline. L’analyse de milliers de cellules avec le flux de travail de l’analyseur de sous-structure a permis la caractérisation des effets jamais décrits de l’OS sur les corps de Cajal. En effet, les données obtenues suggèrent que l’OS modifie la nucléation des corps de Cajal, induisant une redistribution nucléoplasmique de la protéine de coiline dans de nombreux foyers nucléaires plus petits. Un tel changement de la structure des corps de Cajal pourrait affecter la maturation du splicéosome et participer à la modulation AS par OS.

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Protocol

REMARQUE : Des didacticiels convivial sont disponibles sur le site web de Icy http://icy.bioimageanalysis.org.

1. Télécharger icy et le protocole d’analyseur de sous-structure

  1. Téléchargez Icy à partir du site Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/download) et téléchargez le protocole Substructure Analyzer : http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
    REMARQUE : Si vous utilisez un système d’exploitation 64 bits, assurez-vous d’utiliser la version 64 bits de Java. Cette version permet d’augmenter la mémoire allouée à Icy (Préférences | Généralités | Mémoire maximale).

2. Ouverture du protocole

  1. Ouvrez Icy et cliquez sur Outils dans le menu Ruban.
  2. Cliquez sur Protocoles pour ouvrir l’interface Éditeur de protocoles.
  3. Cliquez sur Charger et ouvrez l’analyseur de sous-structure deprotocole . Le chargement du protocole peut prendre quelques secondes. Assurez-vous que l’ouverture du protocole est terminée avant de l’utiliser.
    REMARQUE : Le flux de travail est composé de 13 blocs généraux présentés à la figure 2a. Chaque bloc fonctionne comme un pipeline composé de plusieurs boîtes effectuant des sous-tâches spécifiques.

3. Interagir avec le flux de travail sur Icy

REMARQUE : Chaque bloc ou boîte est numéroté et a un rang spécifique dans le flux de travail (Figure 2b). En cliquant sur ce numéro, la position la plus proche possible de la première est attribuée au bloc/boîte sélectionné, puis la position des autres blocs/cases est réorganisée. Respectez le bon ordre des blocs lors de la préparation du flux de travail. Par exemple, le bloc de détection de taches a besoin d’vois prédéfinis de sorte que les blocs de segmentation doivent s’exécuter avant les blocs de détecteur de tache. Ne modifiez pas la position des cases. N’utilisez pas « » dans le nom de l’image.

  1. En cliquant sur l’icône du coin supérieur gauche, effondrez, élargissez, agrandissez, rétrécissez ou supprimez le bloc (Figure 2b).
  2. Chaque pipeline du flux de travail est caractérisé par un réseau de boîtes connectées via leur entrée et leur sortie (Figure 2b). Pour créer une connexion, cliquez sur Sortie et maintenez jusqu’à ce que le curseur atteigne une entrée. Les connexions peuvent être supprimées en cliquant sur la balise Sortie.

4. Fusion des canaux d’une image

  1. Utilisez le bloc Merge Channels pour générer des images fusionnées. Si nécessaire, renommez les fichiers de sorte que les séquences à fusionner ont le préfixe du même nom suivi d’un séparateur distinct. Par exemple, les séquences de canaux individuels d’une image A sont nommées : ImageA_red, ImageA_blue.
    REMARQUE : Pour le séparateur, n’utilisez pas les caractères déjà présents dans le nom de l’image.
  2. Dans le même dossier, créez un nouveau dossier par canal pour fusionner. Par exemple, pour fusionner les canaux rouges, verts et bleus, créez 3 dossiers et stockez les séquences correspondantes dans ces dossiers.
  3. Utilisez uniquement le bloc Merge Channels, supprimez les autres blocs et enregistrez le protocole en tant que canaux de fusion.
    1. Accédez aux cases pour définir des paramètres. Pour chaque canal, remplissez les cases Numéro de canal X (cases 1, 5 ou 9), Numéro de canal dossier X (boîtes 2, 6 ou 10), numéro de canal séparateur X (boîtes 3, 7 ou 11) et canal Colormap nb X (boîtes 4, 8 et 12) respectivement.
      REMARQUE : Ces boîtes sont regroupées horizontalement par quatre, chaque ligne correspondant au même canal. Dans chaque ligne, un affichage est également disponible (cases 23, 24 ou 25) pour visualiser directement la séquence du canal correspondant.
      1. Dans la zone Numéro de canal X, choisissez le canal à extraire (dans les images RGB classiques, 0=Rouge, 1=Vert, 2=Bleu). L’utilisateur accède rapidement aux différents canaux d’une image dans la fenêtre Inspecteur de Icy, dans l’onglet Séquence. Écrivez la valeur du plus petit canal dans la ligne supérieure et la plus élevée de la ligne de fond.
      2. Dans la zone Dossier numéro de canal X, écrivez le \Nom du dossier contenant des images du canal X.
      3. Dans la boîte Numéro de canal séparateur X, écrivez le séparateur utilisé pour le nom de l’image (dans l’exemple précédent : « _red », « _green » et « _blue »).
      4. Dans la zone Colormap channel nb X, indiquez avec un nombre quel modèle colormap utiliser pour visualiser le canal correspondant dans Icy. Les colormaps disponibles sont visibles dans l’onglet Séquence de la fenêtre Inspecteur.
      5. Dans la zone Format des images fusionnées (encadré 28), écrivez l’extension pour enregistrer les images fusionnées : .tif, .gif, .jpg, .bmp ou .png.
        REMARQUE : Pour fusionner seulement 2 canaux, ne remplissez pas les quatre cases correspondant au troisième canal.
    2. Dans le coin supérieur gauche du bloc Canaux de fusion, cliquez sur le lien directement à droite du dossier. Dans la boîte de dialogue Ouvrir qui s’affiche, double-cliquez sur le dossier contenant des séquences du premier canal qui a été défini dans la zone Dossier numéro 1 (encadré 2). Ensuite, cliquez sur Ouvrir.
    3. Exécutez le protocole en cliquant sur la flèche noire dans le coin supérieur gauche du bloc Canaux de fusion (voir la partie 7 pour plus de détails). Les images fusionnées sont enregistrées dans un dossier Merge dans le même répertoire que les dossiers des canaux individuels.

5. Segmentation des régions d’intérêt

REMARQUE : Substructure Analyzer intègre des algorithmes simples et plus sophistiqués pour proposer différentes alternatives adaptées à la complexité de l’image et aux besoins des utilisateurs.

  1. Sélectionnez le bloc adapté.
    1. Si les objets ne se touchent pas ou si l’utilisateur n’a pas besoin de différencier individuellement les objets en cluster, utilisez le bloc Segmentation A : Objets non groupés.
    2. Lorsque les objets ne se touchent pas, mais que certains d’entre eux sont proches, utilisez le bloc Segmentation B : objets mal regroupés.
    3. Pour les objets ayant un niveau de clustering élevé et une forme convexe, utilisez le bloc Segmentation C : objets groupés avec des formes convexes.
    4. Si les objets présentent un niveau de clustering élevé et ont des formes irrégulières, utilisez le bloc Segmentation D : objets groupés de formes irrégulières.
    5. Utilisez le bloc Segmentation E : Cytoplasme groupé pour segmenter les cytoplasmes en touchant individuellement en utilisant des noyaux segmentés comme marqueurs. Ce bloc a un besoin impératif de noyaux segmentés pour le traiter.
      REMARQUE : Blocs adaptés au processus de segmentation des objets primaires indépendamment afin que plusieurs blocs puissent être utilisés dans la même course pour comparer leur efficacité pour une sous-structure particulière ou pour segmenter différents types de sous-structures. Si le niveau de clustering est hétérogène dans le même ensemble d’images, traitez les objets petits et fortement groupés séparément dans les blocs adaptés.
  2. Reliez la sortie0 (Fichier) du bloc Sélectionner le dossier à l’entrée de dossier du bloc de segmentation choisi.
  3. Définissez les paramètres du bloc de segmentation choisi.
    1. Segmentation A : objets non groupés et segmentation C : objets groupés avec des formes convexes
      1. Dans la boîte Signal de canal (encadré 1), définissez le canal des objets sur segment.
      2. En option, dans la boîte filtre gaussien (encadré 2), augmentez les valeurs sigma X et Y si le signal à l’intérieur des objets est hétérogène. Le filtre gaussien lisse les textures pour obtenir des régions plus uniformes et augmente la vitesse et l’efficacité de la segmentation des noyaux. Plus les objets sont petits, plus la valeur sigma est faible. Évitez les valeurs sigma élevées. Définissez les valeurs par défaut sur 0.
      3. Dans la case HK-Means (encadré 3), définissez le paramètre Intensité des classes et les tailles minimales et maximales approximatives (en pixels) des objets à détecter.
        REMARQUE : Pour les classes d’intensité, une valeur de 2 classes classe en 2 classes : arrière-plan et premier plan. Il est ainsi adapté lorsque le contraste entre les objets et l’arrière-plan est élevé. Si les objets de premier plan ont des intensités différentes ou si le contraste avec l’arrière-plan est faible, augmentez le nombre de classes. Le paramètre par défaut est 2. La taille de l’objet peut être rapidement évaluée en dessinant manuellement un retour sur investissement autour de l’objet d’intérêt. La taille du ROI (Intérieur en pixels) apparaît directement sur l’image lorsque vous la pointez avec le curseur ou peut être consultée dans la fenêtre statistiques de retour sur investissement (ouvrez-la à partir de la barre de recherche). Les paramètres optimaux détectent chaque objet de premier plan dans un seul roi. Ils peuvent être définis manuellement dans Icy(Détection et suivi | HK-Means).
      4. Dans la zone Contours actifs (encadré 4), optimisez la détection des bordures d’objet. Une documentation exhaustive pour ce plugin est disponible en ligne: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. Les paramètres corrects peuvent également être définis manuellement dans Icy (Détection et suivi | Contours actifs).
      5. Pendant le processus, un dossier est automatiquement créé pour enregistrer des images d’objets segmentés. Dans la zone Texte (zone 6), nommez ce dossier (ex : noyaux segmentés). Pour définir le format d’enregistrement des images d’objets segmentés (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG), remplissez le format de boîte d’images d’objets segmentés. Le dossier est créé dans le dossier contenant des images fusionnées.
      6. Exécutez le flux de travail (pour plus de détails, voir la partie 7).
    2. Segmentation B : objets mal regroupés
      1. Suivez les mêmes étapes que dans 5.3.1 pour définir les paramètres des cases Signal de canal, HK-Means, Active Contours , Extension pour enregistrer les objets segmentés et le texte (Les rangs des boîtes ne sont pas les mêmes qu’à l’étape 5.3.1). Active Contours
      2. Dans la zone Appelez le plugin IJ (encadré 4), définissez le paramètre Rolling pour contrôler la soustraction d’arrière-plan. Définissez ce paramètre sur au moins la taille de l’objet le plus grand qui ne fait pas partie de l’arrière-plan. La diminution de cette valeur augmente la suppression de l’arrière-plan, mais peut également induire la perte du signal de premier plan.
      3. Dans la zone D’égalisation d’histogramme adaptatif (encadré 6), améliorez les contrastes entre les objets de premier plan et l’arrière-plan. L’augmentation de la pente donne des séquences plus contrastées.
      4. Exécutez le flux de travail (pour plus de détails, voir la partie 7).
    3. Segmentation D : objets groupés de formes irrégulières
      REMARQUE : Trois méthodes différentes de segmentation s’appliquent à chaque image : premièrement,Clustering hk-meanscombiné avec leActive Contours, méthodeest appliquée. Ensuite, lealgorithme classique de bassin versant(à l’aide de la carte de distance Euclidian) est appliqué aux objets précédemment mal segmentés. Enfin, unalgorithme de bassin versant basé sur les marqueursest utilisé. Seules les méthodes de pointe hk et de bassins versants basées sur les marqueurs doivent être interventions de l’utilisateur. Pour les deux méthodes, les mêmes paramètres peuvent être appliqués pour toutes les images (version entièrement automatisée) ou être modifiés pour chaque image (version semi-automatisée). Si l’utilisateur n’est pas formé à ces méthodes de segmentation, le traitement semi-automatisé est fortement recommandé. Pendant le traitement de ce bloc, une intervention manuelle est nécessaire. Lorsqu’une méthode de segmentation est terminée, l’utilisateur doit supprimer manuellement les objets mal segmentés avant le début de la méthode de segmentation suivante. Les objets segmentés avec succès sont enregistrés et non pris en compte à l’étape suivante. Ce bloc doit être connecté au blocBoîte de dialogue Segmentation des objets primaires de formes groupées/hétérogènesfonctionner correctement.
      1. Téléchargez la collection ImageJ MorphoLibJ sur https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. La version MorphoLibJ 1.4.0 est utilisée dans ce protocole. Placez le fichier MorphoLibJ_-1.4.0.jar dans le dossier icy/ij/plugins. Plus d’informations sur le contenu de cette collection sont disponibles sur https://imagej.net/MorphoLibJ.
      2. Suivez les mêmes étapes que dans l’étape 5.3.1 pour définir les paramètres des boîtes Signal de canal, Filtre gaussien, Contours actifs , Extension pour enregistrer les objets segmentés et Texte. Active Contours Les rangs des boîtes ne sont pas les mêmes qu’à l’étape 5.3.1.
      3. Définir les paramètres de la boîte D’égalisation d’histogramme adaptatif (voir étape 5.3.2.3).
      4. Pour activer Subtract Background, écrivez oui dans Appliquer l’arrière-plan de soustrait ? (encadré 5). Sinon, écrivez No. Si le plugin est activé, définissez le paramètre de roulement (voir l’étape 5.3.2), dans la zone Soustraire le paramètre Background (encadré 7).
      5. Automatisation des moyens HK : Pour appliquer les mêmes paramètres pour toutes les images (traitement entièrement automatisé), définissez le Nb des classes (encadré 11), la taille minimale (encadré 12) et la taille maximale (encadré13) (voir étape 5.3.1). Ces paramètres doivent être configurés pour sélectionner un maximum de pixels de premier plan et pour optimiser l’individualisation des objets de premier plan. Pour la version de traitement semi-automatisée, aucune intervention n’est nécessaire.
      6. Automatisation des extractions de marqueurs : pour la version entièrement automatisée, développez la zone Extraction de marqueurs internes (encadré 27) et définissez la valeur du paramètre « dynamique » dans la ligne 13 du script. Pour la version de traitement semi-automatisée, aucune intervention n’est nécessaire.
        REMARQUE : Les marqueurs sont extraits en appliquant une transformation de minima étendus sur une image d’entrée contrôlée par un paramètre « dynamique ». Dans l’algorithme de bassin versant basé sur les marqueurs, l’inondation de ces marqueurs est simulée pour effectuer la segmentation des objets. Pour la segmentation réussie des objets de premier plan, un seul marqueur par objet de premier plan doit être extrait. Le réglage du paramètre « ypiqu » pour l’extraction optimale des marqueurs dépend principalement de la résolution des images. Ainsi, si vous n’êtes pas familier avec ce paramètre, utilisez la version semi-automatisée.
      7. Exécutez le flux de travail (pour plus de détails, voir la partie 7).
      8. Au début du traitement, les boîtes de dialogue HK-means paramètres et le bassin versant basé sur les marqueurs s’ouvrent successivement. Pour appliquer les mêmes paramètres pour toutes les images (version entièrement automatisée), cliquez sur OUI. Sinon, cliquez sur NO. Une boîte d’information s’ouvre, demandant de « Déterminer les ROI optimaux avec le plugin HK-Means et l’image étroite ». Cliquez sur OK et appliquez manuellement le plugin HK-Means(Détection et suivi| HK-Means) sur l’image, qui s’ouvre automatiquement. Sélectionnez l’option Exporter des ROV dans la zone plugin HK-Means. Appliquez les meilleurs paramètres pour avoir des ROI contenant un maximum de pixels de premier plan et pour optimiser l’individualisation des objets de premier plan. Lorsque des VOI optimaux sont trouvés, fermez directement l’image.
      9. À la fin de la première méthode de segmentation, une boîte d’information s’ouvre et demande de « Supprimer les ORI indésirables et fermer l’image ». Ces VOI correspondent aux bordures des objets segmentés. Sélectionnez OK et supprimez les VOI des objets mal segmentés dans l’image, qui s’ouvre automatiquement. Un retour sur investissement peut être facilement supprimé en plaçant le curseur sur sa bordure et en utilisant le bouton « upprime » du clavier. Fermez l’image. Répétez la même procédure après l’achèvement de la deuxième étape de segmentation.
      10. À ce stade, si le bouton OUI a été sélectionné pour l’automatisation complète de l’algorithme de bassin versant basé sur les marqueurs, les paramètres précédemment fixés seront appliqués à toutes les images.
      11. Si le bouton NO a été sélectionné, une zone d’information s’ouvre, demandant de « Déterminer et ajuster les marqueurs internes ». Cliquez sur OK et dans l’interface ImageJ de Icy, accédez à Plugins | MorphoLibJ | Minima et Maxima| Min et Max étendus. Dans Operation, sélectionnez Minima étendu.
      12. Sélectionnez Aperçu pour pré-visualiser sur l’image ouverte automatiquement le résultat de la transformation. Déplacez la dynamique jusqu’à ce que des marqueurs optimaux soient observés. Les marqueurs sont des groupes de pixels d’une valeur de 255 (pas nécessairement des pixels blancs). Les paramètres optimaux conduisent à un marqueur par objet. Concentrez-vous sur les objets restants qui n’ont pas été bien segmentés avec les deux méthodes de segmentation précédentes.
      13. Si nécessaire, améliorer les marqueurs en appliquant des opérations morphologiques supplémentaires comme « unt » ou « oute » (Plugins | MorphoLibJ | Filtres morphologiques). Lorsque vous obtenez l’image finale des marqueurs, gardez-la ouverte et fermez toutes les autres images se terminant par l’image initialement utilisée comme entrée pour l’opération Minima étendu. Cliquez sur Non si une zone ImageJ demande à enregistrer les modifications sur cette image.
      14. Dans la zone Nb des images avec la zone d’information (encadré 14), déterminez le nombre d’images avec les boîtes d’information à afficher.
    4. Segmentation E : cytoplasme groupé
      REMARQUE : Ce bloc utilise des noyaux segmentés précédemment comme marqueurs individuels pour initier la segmentation du cytoplasme. Assurez-vous que le bloc de segmentation des noyaux a été traité avant de l’utiliser.
      1. Dans la boîte Canal cytoplasme (encadré 1), définissez le canal du signal cytoplasmique.
      2. Dans la boîte Extension segmenté noyaux (encadré 2), écrivez le format utilisé pour enregistrer des images de noyaux segmentés (tif, jpeg, bmp, png). Le format par défaut est tif.
      3. Dans la zone Texte (zone 3), écrivez le \Nom du dossier contenant des noyaux segmentés.
      4. Dans la boîte Format d’images de cytoplasmes segmentés (encadré 4), définissez le format à utiliser pour enregistrer des images d’objets segmentés (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG).
      5. Pendant le processus, un dossier est automatiquement créé pour enregistrer des images de cytoplasmes segmentés. Dans la zone Texte (zone 5), nommez ce dossier (ex : cytoplasmes segmentés). Le dossier est créé dans le dossier contenant des images fusionnées.
      6. Suivez les mêmes étapes qu’à l’étape 5.3.1 pour définir les paramètres des cases Filtre gaussien et Contours actifs (Attention, les classements des cases ne sont pas les mêmes qu’à l’étape 5.3.1).
      7. Exécutez le flux de travail (pour plus de détails, voir la partie 7).

6. Détection et analyse des signaux fluorescents

  1. Sélectionnez le bloc adapté.
    1. Dans le bloc Fluorescence Analysis A: 1 Channel, effectuer la détection et l’analyse des foyers dans un canal à l’intérieur d’un type d’objet segmenté: détection des foyers de coilin (canal rouge) dans le noyau.
    2. Dans le bloc Fluorescence Analysis B: 2 Canaux dans le même compartiment, effectuer la détection et l’analyse des foyers dans deux canaux à l’intérieur d’un type d’objet segmenté: détection de la coiline (canal rouge) et 53BP1 (canal vert) foyers dans le noyau.
    3. Dans le bloc Fluorescence Analysis C: 2 Canaux dans deux compartiments, effectuer la détection et l’analyse des foyers dans un ou deux canaux, en particulier à l’intérieur des noyaux et de leur cytoplasme correspondant: détection de Coilin foyers (canal rouge) à la fois dans le noyau et son cytoplasme correspondant ou la détection de Coilin foyers (canal rouge) dans le noyau et G3BP foyers (canal vert) dans le cytoplasme correspondant.
    4. Dans le bloc Fluorescence Analysis D: Global Translocation, calculer le pourcentage de signal à partir d’un canal dans deux compartiments cellulaires (a et b). Par exemple, dans un essai de translocation cytoplasme/noyau, exporter des pourcentages calculés de signaux nucléaires et cytoplasmiques pour chaque image de la feuille de calcul finale « Résultats ». La formule utilisée pour calculer le pourcentage de signal nucléaire est indiquée ci-dessous. Ce bloc peut être utilisé pour n’importe quel compartiment subcellulaire :
      Equation 1
    5. Dans le bloc Fluorescence Analysis E: Individual Cell Translocation, calculer le pourcentage de signal à partir d’un canal dans deux compartiments cellulaires pour chaque cellule. Ce bloc est spécialement optimisé pour l’essai de translocation du noyau/cytoplasme au niveau unicellulaire.
      REMARQUE : Étant donné que le bloc De fluorescence Analyse E : La translocation individuelle des cellules effectue une analyse au niveau unicellulaire, une segmentation efficace du noyau et du cytoplasme est nécessaire.
  2. Reliez la sortie0 (Fichier) du bloc Sélectionner le dossier (bloc 1) à l’entrée de dossier (flèches blanches dans les cercles noirs) du bloc choisi.
  3. Définissez les paramètres du bloc choisi.
    1. Analyse de fluorescence A : 1 canal, analyse de fluorescence B : 2 canaux dans le même compartiment et analyse de fluorescence C : 2 canaux dans deux compartiments
      1. Dans la zone Images du dossier ROI, écrivez le nom du dossier contenant des images d’objets segmentés précédés d’une barre oblique inverse. (Par exemple : \Noyaux segmentés).
      2. Dans la case Format d’images d’objets segmentés (encadré 2), écrivez le format utilisé pour enregistrer des images d’objets segmentés (tif, jpeg, bmp, png). Le format par défaut est tif.
      3. Dans la zone Kill Borders?, écrire Oui pour supprimer les objets de bordure. Sinon, écrivez No. L’installation de la collection MorphoLibJ d’ImageJ est nécessaire pour utiliser cette fonction (voir l’étape 5.3.3).
      4. Dans la boîte(es) Signal de taches de canal, définissez le canal où les taches doivent être détectées. Dans les images RGB classiques, 0=Rouge, 1=Vert et 2=Bleu.
      5. Dans les cases Nom de la molécule localisée, écrire le nom de la molécule qui se localise dans les taches. Le nombre de champs à entrer dépend du nombre de molécules.
      6. Dans la zone(es) Wavelet Spot Detector Block, définissez les paramètres de détection de tache pour chaque canal. Définissez l’échelle (s) (référence à la taille du spot) et la sensibilité de la détection (une sensibilité plus faible diminue le nombre de taches détectées, la valeur par défaut étant de 100 et la valeur minimale étant 0). La documentation exhaustive de ce plugin est disponible en ligne: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. Les paramètres peuvent également être définis manuellement dans Icy (Détection et suivi | Détecteur de taches).
      7. En option, dans la zone Filtrer le retour sur investissement par taille, filtrez les objets segmentés où les taches sont détectées en définissant un intervalle de taille (en pixels). Cette étape est particulièrement utile pour supprimer les objets sous-segmentés ou sur segmentés. Pour estimer manuellement la taille des objets, voir étape 5.3.1. Les paramètres par défaut n’incluent pas le filtrage des ROV par taille. Le bloc 2 Canaux dans deux compartiments contient deux cases : les noyaux de filtre par taille (encadré 19) et le cytoplasme de filtre par taille (encadré 46).
      8. En option, dans la boîte Filtrer les taches par taille, filtrer les taches détectées en fonction de leur taille (en pixels) pour supprimer les artefacts indésirables. Pour estimer manuellement la taille des taches, cliquez sur Détection et suivi et ouvrez le plugin du détecteur spot. Dans les options De sortie, sélectionnez Exporter vers le retour sur investissement. Veillez à ce que les paramètres par défaut n’incluent pas le filtrage des taches par taille et que les taches filtrées ne soient pas prises en compte pour l’analyse. Le nombre de champs à entrer dépend du nombre de canaux.
      9. En option, dans la boîte Taches de filtre, appliquez un filtre supplémentaire (contraste, homogénéité, périmètre, rondeur) sur les taches détectées. Veillez à ce que les paramètres par défaut n’incluent pas le filtrage des taches et que les taches filtrées ne soient pas prises en compte pour l’analyse. Le nombre de champs à entrer dépend du nombre de canaux.
      10. En option, dans les cases Seuil de taille de tache, définissez un seuil pour la zone (en pixels) des taches analysées. Le nombre de taches comptées en dessous et au-dessus de ce seuil est exporté dans la feuille de calcul final des résultats. Le nombre de cases à informer dépend du nombre de canaux.
      11. Exécutez le flux de travail (pour plus de détails, voir la partie 7). Les données sont exportées dans une feuille de calcul Résultats enregistrée dans le dossier contenant des images fusionnées.
    2. Analyse de fluorescence D : Analyse globale de translocation et de fluorescence E : Translocation individuelle des cellules :
      1. Dans les cases Images du dossier (cases 1 et 2), écrivez le \Nom du dossier contenant des images d’objets segmentés. Dans le bloc Fluorescence Analysis D: Global Translocation, les deux types de retour sur investissement sont identifiés comme roi a et roi b. Pour le bloc Fluorescence Analysis E: Individual Cell Translocation, dans les images de dossier segmentés noyaux et dossiers images segmentées cytoplasmes boîtes, écrire le nom du dossier contenant des noyaux segmentés et cytoplasmes, respectivement.
      2. Dans la zone Signal de canal (encadré 3), entrez le canal du signal.
      3. Dans la case Format d’images d’objets segmentés (encadré 4), écrivez le format utilisé pour enregistrer des images d’objets segmentés (tif, jpeg, bmp, png). Le format par défaut est tif. L’option Kill Borders est également disponible pour supprimer les objets de bordure (voir l’étape 6.3.1).
      4. En option, dans les cases Filtrer le retour sur investissement par taille, filtrer les objets segmentés en définissant un intervalle de taille (en pixels). Cette étape peut être utile pour supprimer les objets sous ou sur segmentés. Pour estimer manuellement la taille des objets, voir étape 5.3.1. Il y a deux champs à entrer, un par canal. Les paramètres par défaut n’incluent pas le filtrage du retour sur investissement par taille.
      5. Exécutez le flux de travail (pour plus de détails, voir la partie 7). Exporter des données dans une feuille de calcul Résultats enregistrés dans le dossier contenant des images fusionnées.

7. Exécuter le protocole

  1. Pour traiter un bloc dans une course, supprimez la connexion entre le bloc sélectionné et le bloc Sélectionner un dossier. Placez le bloc recherché au1er rang. Dans le coin supérieur gauche du bloc recherché, cliquez sur le lien directement à droite du dossier. Dans la boîte de dialogue Ouvrir qui s’affiche, double-cliquez sur le dossier contenant les images fusionnées. Ensuite, cliquez sur Ouvrir. Cliquez sur Exécuter pour démarrer le flux de travail. Le traitement peut être arrêté en cliquant sur le bouton Arrêter.
  2. Pour traiter différents blocs dans une course, conservez les connexions des blocs choisis avec le bloc Sélectionner le dossier (bloc 1). Assurez-vous que leur rang permet le bon traitement du flux de travail. Par exemple, si un bloc spécifique a besoin d’objets segmentés pour traiter, assurez-vous que le bloc de segmentation traite avant. Avant d’exécuter le flux de travail, supprimez les blocs inutilisés et enregistrez le nouveau protocole avec un autre nom.
  3. Cliquez sur Exécuter pour démarrer le flux de travail. Lorsque la boîte de dialogue ouverte s’affiche, double-cliquez sur le dossier contenant les images fusionnées. Ensuite, cliquez sur Ouvrir. Le flux de travail s’exécute automatiquement. Si nécessaire, arrêtez le traitement en cliquant sur le bouton Arrêter.
  4. À la fin du traitement, vérifiez que le message Le flux de travail exécuté avec succès est apparu dans le coin inférieur droit et que tous les blocs sont marqués avec un signe vert ( Figure2b). Si ce n’est pas le cas, le bloc et la boîte intérieure présentant le signe d’erreur indiquent l’élément à corriger (Figure 2b).
    REMARQUE : Une fois le flux de travail exécuté avec succès, une nouvelle exécution ne peut pas être démarrée directement et pour traiter à nouveau le flux de travail, au moins un bloc doit être marqué avec le signe « prêt à traiter ». Pour modifier l’état d’un bloc, supprimez et créez à nouveau un lien entre deux cases à l’intérieur de ce bloc, soit fermez et réal ouverts le protocole. Si une erreur se produit pendant le traitement, une nouvelle exécution peut être démarrée directement. Au cours d’une nouvelle course, tous les blocs du pipeline sont traités, même si certains d’entre eux sont signalés avec le signe vert.

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Representative Results

Toutes les analyses décrites ont été effectuées sur un ordinateur portable standard (processeur quad-core 64 bits à 2,80 GHz avec mémoire d’accès aléatoire (RAM) de 16 Go fonctionnant avec la version 64 bits de Java. La mémoire à accès aléatoire est un paramètre important à considérer, en fonction de la quantité et de la résolution des images à analyser. L’utilisation de la version 32 bits de Java limite la mémoire à environ 1300 Mo, ce qui pourrait être inapproprié pour l’analyse big data, tandis que la version 64 bits permet d’augmenter la mémoire allouée à Icy. La figure 3 indique le temps nécessaire à la segmentation des différents types d’images et des résolutions différentes. Il confirme que la haute résolution augmente considérablement le temps de segmentation des objets primaires.

Les données présentées dans les paragraphes suivants démontrent que le flux de travail de substructure Analyzer peut être utilisé pour résoudre la plupart des problèmes courants rencontrés en biologie cellulaire et moléculaire (comptage cellulaire, comptage et analyse des foyers, analyse de translocation).

La mesure dans de nombreuses cellules de la proportion précise de molécules concentrées dans un compartiment donné ou le changement de localisation dans les domaines subcellulaires peut être une tâche très lourde et sujette aux erreurs, surtout lorsqu’elle est effectuée manuellement. La figure 4 illustre la capacité du flux de travail à quantifier rapidement et précisément la translocation nucléaire bien décrite du facteur de transcription NFκB en réponse à la stimulation de TNFα. Les images utilisées pour l’analyse ont été gracieusement compilées par Ilya Ravkin (http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm) et sont accessibles au public à la Broad Bioimage Benchmark Collection16. Cet ensemble contient des images de lignées cellulaires MCF7 et A549 traitées avec des concentrations croissantes de TNFα. L’analyse a été effectuée sur plus de 40 000 cellules et 96 images (48 images pour chaque canal) de la ligne cellulaire MCF7 (Figure 4a). L’analyse complète (de l’importation d’images à l’enregistrement des données) a pris 26 minutes. Chaque image correspond à une concentration spécifique de TNFα. Les proportions nucléaires/cytoplasmiques de NFκB étaient homogènes dans toutes les cellules pour une image donnée. Pour cette raison, pour chaque image, les valeurs de tous les pixels nucléaires ou cytoplasmiques ont été résumées pour calculer les proportions nucléaires et cytoplasmiques de NFκB, et l’individualisation des noyaux de toucher/cytoplasmes pendant leur segmentation n’était pas nécessaire. Les images DAPI ont été traitées dans la segmentation C : les objets groupés avec des formes convexes bloquent les noyaux de segment et le canal vert a été utilisé pour délimiter les cytoplasmes avec le bloc de segmentation E : cytoplasme groupé (figure 4b). Le bloc de fluorescence D : Translocation globale a été utilisé pour exporter la somme des valeurs de pixels nucléaires et cytoplasmiques. Les données obtenues sont représentées dans une courbe dose-réponse (figure 4c) et illustrent l’augmentation de la proportion nucléaire de NFκB après stimulation avec des concentrations croissantes de TNFα.

Le flux de travail analyse non seulement le signal d’intensité globale dans différents compartiments sous-cellulaires, mais peut également être utilisé pour détecter les foyers et extraire des informations spécifiques sur leurs fonctionnalités. La figure 5a illustre la détection des corps P dans les cellules individuelles en localisant l’exhausteur de la protéine 4 (EDC4) de l’ARNm. Le bloc segmentation A : objets non groupés a été utilisé pour segmenter les noyaux qui présentent un faible niveau de clustering, le bloc de segmentation E : cytoplasme groupé pour délimiter les cytoplasmes et l’analyse de fluorescence C : 2 canaux dans deux compartiments pour détecter les foyers EDC4. Les objets segmentés sont identifiés (nuclei_0 segmentés, segmentés cytoplasms_0) et plusieurs informations sont recueillies dans la feuille de calcul correspondante (Information sur les noyaux segmentés et informations sur les cytoplasmes segmentés) comme l’intensité moyenne d’EDC4 ou le nombre/taille des corps détectés dans chaque roi(figure 5b). Avant d’être analysés, les corps détectés peuvent être préalablement filtrés en fonction de leur zone, ce qui peut être utile pour exclure les objets en dessous de la puissance de résolution du microscope. Pour estimer la taille des objets conservés, un seuil de surface supplémentaire peut être introduit. Les zones de tous les corps détectés sont signalées dans des feuilles de calcul dédiées (taille segmentée nuclei_Distribution foci, segmentée cytoplasms_Distribution taille des foyers). Dans cet exemple, nous soulignons l’analyse de deux cellules (segmentées nuclei_0 and_1 et segmentées cytoplasm_0 and_1), où des foyers EDC4 cytoplasmiques sont détectés. Notez que même si le signal de la protéine EDC4 est détecté dans les compartiments nucléaires et cytoplasmiques, seuls les foyers cytoplasmiques correspondent aux corps P. Le signal nucléaire résulte très probablement de la réactivité croisée de l’anticorps utilisé pour effectuer des expériences d’immunofluorescence. La taille en pixels de chacun des foyers est donnée.

Ensuite, comme l’effet du stress oxydatif (OS) sur les corps de Cajal était encore inconnu, nous avons profité de la polyvalence du flux de travail pour l’étudier pendant la cinétique de temps (2 à 20 heures après l’induction d’OS avec 500 μM H2O2) (Figure 6). Les corps cajal sont des structures dynamiques nucléant et se dissolvant dans le nucléoplasme sous le contrôle de paramètres spécifiques comme le taux de transcription ou la progression du cycle cellulaire. Les corps de Cajal ont été visualisés en localisant leur principal composant structurel et fonctionnel, la protéine de coiline. Des informations sur le nombre et la taille des corps de Cajal ont été recueillies en étudiant 2300 cellules individuelles à partir d’images haute résolution (3840X3072) contenant 3 canaux: DAPI (bleu), 53BP1 (vert) et coiline (rouge) (Figure 6a). Le traitement complet a pris moins de 1 h. Étant donné que les noyaux présentaient la forme convexe et que certains d’entre eux étaient regroupés, le bloc Segmentation C : objets groupés avec des formes convexes a été choisi pour effectuer la segmentation. Comme os est connu pour induire des ruptures de double brin d’ADN (DDSBs), la protéine p53-liaison 1 (53BP1), connue pour être un effecteur essentiel des voies de signalisation de dommages d’ADN, a été employée comme marqueur pour distinguer entre les cellules stressées et non-stressées. En effet, en l’absence de dommages à l’ADN, 53BP1 est homogènement réparti dans le nucléoplasme, alors qu’après des dommages à l’ADN, il se concentre sur les DDSB, qui forment des foyers facilement reconnaissables en microscopie. Le nombre et la taille des foyers nucléaires 53BP1 et coilin dans chaque cellule ont été analysés à l’aide du bloc Fluorescence Analysis B: 2 Canaux dans le même compartiment. Tout d’abord, l’analyse des données 53BP1 a permis de déterminer à chaque point de la cinétique le meilleur seuil pour classer les cellules en fonction de leur état de stress. Parmi l’ensemble de la cinétique, OS induit une augmentation significative du nombre de foyers 53BP1 avec une augmentation de 11 fois à 2, 4, et 8 h après l’induction de l’OS (Figure S1). Cet effet est moins prononcé à 6 h (6,5 fois) en raison d’un niveau initial plus élevé d’ORD dans les cellules non stressées. Même après 20 h, une augmentation soutenue demeure (près de 6 fois). Ces données reflètent l’efficacité du traitement pour induire le système d’exploitation et établissent 53BP1 comme marqueur de stress efficace pour les observations précoces et tardives en microscopie. D’autre part, une petite proportion de cellules stressées avec un faible niveau de DDSBs a été observée à chaque point de la cinétique, ce qui suggère que les cellules ne sont pas homogènement stressées, ce qui renforce l’importance d’utiliser un marqueur de stress dans les expériences de stress. Sur la base de l’analyse roc, un seuil global de 17 53BP1 foyers a été choisi pour faire la distinction entre les cellules stressées et non stressées tout au long de la cinétique (Figure S1).

Ensuite, le nombre et la taille des foyers nucléaires de la coiline ont été analysés en fonction de l’état de stress de la cellule. Une augmentation significative du nombre de foyers a été observée 2, 4 et 6 h après induction du stress (figure 6b). L’effet le plus soutenu est observé à 2 h, le nombre de cellules ayant plus de 10 foyers passant de 0% dans les cellules non stressées à 75% dans les cellules stressées. En outre, plus de 25% des cellules stressées de ce point de temps avaient plus de 20 foyers de coilin. Cet effet diminue progressivement jusqu’à 8 h. À 20 h, on observe une légère augmentation du premier et du troisième quartiles, mais les données montrent également que 84 % et 80 % des cellules présentent moins de 8 foyers dans les cellules non stressées et stressées, respectivement. Ces données montrent que l’OS a également des effets tardifs sur les paramètres contrôlant la nucléation des corps de Cajal, qui pourraient être différents des effets précoces. Fait intéressant, une analyse minutieuse des caractéristiques des foyers nucléaires de coilin a révélé que l’augmentation observée du nombre de focis de coilin s’associe à une diminution de leur taille (figure 6c). Par exemple, 2 h après l’induction de l’OS, la proportion de foyers de coilin avec une superficie inférieure à 0,2 μm2 passe de 26 % à 64 %. Cet effet diminue jusqu’à 8 h, mais, contrairement au nombre de corps de Cajal, aucun changement significatif n’est observé à 20 h. Cela pourrait refléter que la redistribution nucléoplasmique précoce et tardive des corps de Cajal sont des événements différents.

Au total, ces données suggèrent fortement que l’OS modifie le pouvoir de nucléation des corps de Cajal, induisant une redistribution nucléoplasmique dans de nombreux foyers nucléaires plus petits. Puisque la nucléation des corps de Cajal est entraînée par leurs composants de protéine et d’ARN, ceci suggère que l’effet d’OS pourrait changer la composition des corps de Cajal. Au sein de Cajal Bodies, la protéine de coilin interagit avec plusieurs partenaires protéiques différents tels que les composants du complexe SMN et les protéines Sm. Ces interactions impliquaient souvent des phosphodomaines de coiline, et on peut imaginer qu’une modification de la structure des corps de Cajal pourrait être liée à des changements dans le statut de phosphorylation de la coiline. En outre, des travaux récents ont démontré que les corps de Cajal ne sont pas localisés au hasard dans le noyau, et peuvent affecter l’expression de gène par l’association proximale avec le loci de gène spécifique17. Compte tenu de tous ces faits, il ne serait pas surprenant qu’un effet sur la fonctionnalité des corps de Cajal accompagne des changements dans leur structure. À partir de ces résultats, nous pouvons également nous demander si le remodelage de ces corps Cajal est une conséquence passive de l’OS ou participe à la réponse en interagissant avec des loci génétiques spécifiques, par exemple.

Pour tester si un changement dans l’expression de la coiline pourrait modifier sa localisation et changer la nucléation des corps de Cajal, nous avons surexprimé une protéine exogène de fusion GFP-coiline. Les noyaux n’ont pas été regroupés, de sorte que la segmentation a été effectuée avec le bloc Segmentation A : Objets non groupés. Ensuite, pour quantifier précisément le nombre et la taille des foyers de coilin (signal rouge, canal 1) en fonction du niveau de GFP-coilin (signal vert, canal 2) surexpression, le bloc Fluorescence Analysis B: 2 Canaux dans le même compartiment a été utilisé. Le niveau de GFP-coilin a été reflété par l’intensité moyenne du signal GFP dans le noyau individuel (Figure 7a). Dans les cellules dont le niveau moyen ou élevé de surexpression GFP-coilin (intensité GFP supérieure à 10), le nombre de corps Cajal par noyau augmente de façon significative avec certains noyaux affichant jusqu’à 21 foyers (Figure 7b). Nous avons également remarqué que la luminosité (intensité moyenne) des corps de Cajal augmente considérablement parallèlement au niveau de surexpression conduisant à la saturation d’intensité. De telles régions saturées pourraient ainsi masquer la présence de foyers plus petits et plus faibles. Dans les cellules surexprimant un niveau moyen ou élevé de GFP-coilin, la taille des corps de Cajal augmente également de manière significative, les valeurs médianes passant de 1 à 2 μm2 (figure 7c). En outre, plus de 25 % des cellules ayant un niveau élevé d’expression GFP-coilin présentent des foyers dont la superficie est supérieure à 2,5 μm2,alors qu’elle ne dépasse jamais 0,8 μm2 dans les cellules non transfectées. En conclusion, la surexpression GFP-Coilin entraîne une augmentation significative du nombre et de la taille des corps de Cajal. Puisque l’OS augmente le nombre de corps de Cajal mais réduit leur taille, ces données pourraient refléter que l’effet d’OS sur la structure des corps de Cajal est très probablement induit par un changement de leur composition plutôt que par un effet sur la quantité cellulaire de coilin.

Figure 1
Figure 1 : Le pipeline analyseur de sous-structure
Le flux de travail est développé dans Icy, une plate-forme communautaire ouverte pour l’informatique bioimage, et effectue l’analyse automatique des images de microscopie à fluorescence multiple. Tout d’abord, les images multicanaux sont automatiquement chargées dans le protocole et pré-traitées pour améliorer, si nécessaire, le rapport signal/bruit et supprimer les artefacts d’imagerie. Ensuite, la segmentation de l’image isole les régions d’intérêt (ROI) de l’arrière-plan. Plusieurs méthodes de segmentation sont disponibles en fonction du niveau de regroupement et de la nature des objets d’intérêt. Les objets segmentés sont enregistrés avec un descripteur spécifique (par exemple, Image name_Nucleus_1) dans un dossier spécifique et peuvent être utilisés/réutilisés pour une analyse ultérieure. Les signaux fluorescents comme les taches sont ensuite analysés dans les ROV et plusieurs fonctionnalités (emplacement, taille, forme, intensité, texture, nombre de taches et taille) sont exportées dans une feuille de calcul créée automatiquement. Toutes les caractéristiques mesurées, comme le nombre de taches détectées, sont signalées au descripteur du retour sur investissement correspondant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Interface graphique du flux de travail Icy
(a) Le flux de travail est composé de 13 blocs généraux, qui peuvent être regroupés en fonction de leur fonction générale : Sélectionnez Dossier (bloc 1) autoriser l’accès aux images; Merge Channels (bloc 2) est utilisé pour fusionner différents canaux d’images. Les blocs 3 à 8 sont dédiés à la segmentation des objets, chacun étant adapté à un contexte spécifique : Segmentation A : Objets non groupés, Segmentation B : Objets mal regroupés, Segmentation C : Objets groupés avec des formes convexes, Segmentation D : Objets groupés aux formes irrégulières (bloc 7, travail en association avec le bloc 6), Segmentation E : cytoplasmes groupés. Les blocs 9 à 11 sont utilisés pour compter/analyser les foyers dans les compartiments subcellulaires : Analyse de fluorescence A : 1 Canal, Analyse de fluorescence B : 2 canaux dans le même compartiment et Analyse de fluorescence C : 2 canaux dans deux compartiments. Les blocs 12 et 13 sont adaptés pour l’analyse des événements de translocation : Analyse de fluorescence D : Translocation globale et analyse de fluorescence E : Translocation individuelle des cellules. b) Présentation globale d’une architecture de bloc. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Temps nécessaire à la segmentation en fonction de la résolution d’image et du niveau de clustering d’objets
aa) Illustration graphique du temps nécessaire pour effectuer la segmentation en fonction de la résolution de l’image et du niveau de clustering. Deux blocs de segmentation différents ont été testés : segmentation A (pour les objets non groupés) et segmentation D (pour les objets groupés de formes irrégulières). Le temps de traitement (en secondes par image) est tracé en fonction de la résolution d’image (nombre de pixels). b) Exemple d’images analysées avec le bloc segmentation A ou segmentation D. La coloration DAPI et les noyaux segmentés sont indiqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Analyse du flux de travail d’un test de translocation nucléaire de la NFκB en réponse à la stimulation du TNFα
(a) Exemple d’images de cellules MCF7 humaines (lignée de cellules adénocarcinomes mammaires humaines) traitées avec TNFα à partir de l’ensemble d’images BBBC014 (Broad Bioimage Benchmark Collection)12. La localisation du facteur de transcription NFκB a été étudiée dans des cellules traitées avec 12 concentrations croissantes de TNFα (de 0 à 10-7g/mL). Pour chaque concentration, 4 répliques ont été faites. Les images DAPI (canal bleu) ont été traitées dans la segmentation C : les objets groupés avec des formes convexes bloquent les noyaux pour segmenter les noyaux, puis la coloration NFκB avec FITC (canal vert) a été utilisée pour délimiter les cytoplasmes avec le bloc de cytoplasme en cluster de segmentation E : Le bloc de fluorescence D : Translocation globale a été utilisé pour exporter la somme des valeurs de pixels nucléaires et cytoplasmiques. b) Les noyaux segmentés (gris) et les cytoplasmes (blancs) sont utilisés pour déterminer l’intensité totale du signal fluorescent NFκB dans chaque compartiment. c) La courbe dose-réponse obtenue à partir de l’analyse des données illustre l’augmentation de la proportion nucléaire de NFκB à mesure que la concentration de TNFα augmente. Les images sont dans un format BMP 8 bits, et la taille de l’image est de 1360 x 1024 pixels. Pour chaque concentration, l’écart type entre les 4 répliques est calculé et illustré sous forme de barres d’erreur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Quantification des foyers EDC4 (P-corps) dans le cytoplasme dans les cellules individuelles
aa) La co-coloration avec DAPI (canal bleu) et la phalloïdine (canal rouge) permet respectivement la segmentation et l’identification des noyaux cellulaires et de la F-actin. La protéine EDC4 (canal vert) est utilisée comme marqueur pour la détection des corps P connus pour être exclusivement cytoplasmiques. La barre d’échelle, 10 μm.b) Les focis sont comptés, et plusieurs fonctionnalités (ici leur zone en pixels) sont exportées vers la feuille de calcul des résultats structurée en plusieurs feuilles. Deux feuilles sont consacrées à l’analyse des noyaux et deux à l’analyse des cytoplasmes. Chaque brut intègre les informations d’un roi spécifique. Dans les feuilles d’information Nucleus/Cytoplasme, les caractéristiques des objets segmentés sont exportées (ID de retour sur investissement, taille et intensité moyenne), suivies du nombre de foyers détectés dans chaque roi. Si nécessaire, un seuil de taille (100 pixels dans cet exemple) peut être ajouté, et le nombre de foyers en dessous et au-dessus de ce seuil est signalé dans les deux dernières colonnes. Dans Nucleus/Cytoplasm_Distribution des feuilles de taille des foyers, la zone (en pixels) de tous les foyers détectés est signalée dans le brut du roi correspondant. Dans cet exemple, nous soulignons l’analyse de deux cellules (segmentées cytoplasm_0 and_1), où des foyers EDC4 cytoplasmiques ont été détectés. La taille en pixels de chacun des foyers est également donnée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Cinétique de la coiline et distribution nucléoplasmique 53BP1 après stress oxydatif
L’analyse du nombre et de la taille des foyers a été basée sur plus de 110 cellules individuelles pour chaque point de temps à partir de 3 cinétiques indépendantes. aa) Détection d’immunofluorescence de la coiline et de 53BP1 foyers dans les cellules HeLa S3 tout au long de la cinétique du traitement avec 500 μM H2O2. 53BP1 se concentre sur les sites de rupture à double brin d’ADN et est utilisé pour évaluer l’efficacité du traitement sur chaque cellule. Coilin est enrichi en corps cajal. Les cellules ont été fixées 2, 4, 6, 8 et 20 h après induction oxydative de stress et co-tachées avec des anticorps anti-coilubin (canal rouge) et anti-53BP1 (canal vert). Barre d’échelle, 10 μm.b) Le nombre de foyers nucléaires de coilin après stress oxydatif. Les résultats sont affichés sous forme de parcelles de boîte, où la marque centrale est la médiane, les bords inférieurs et supérieurs de la boîte sont les 25e et 75e percentiles. Dans les cellules traitées avec H2O2, une augmentation significative du nombre de foyers de coiline est détectée et est maximale après 2 et 4 h de traitement. Wilcoxon - L’analyse des tests mann whitney démontre une différence significative entre les cellules traitées non traitées et les cellules traitées H2O2 (*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0.001). c) La proportion de cellules en fonction de la zone des focis de coilin (μm2). La plupart des foyers ont une zone plus petite à 2 h et 4 h points de temps par rapport à la commande. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Étude de la nucléation des corps cajal dans les cellules surexprimant une protéine de fusion GFP-coilin
(a) Les cellules HeLa S3 ont été transfectées de façon transitoire dans des triples biologiques avec 500 ng de plasmide exprimant une protéine de fusion GFP-Coilin en utilisant une procédure standard suivant les recommandations du fabricant. Après 48 h, les cellules ont été fixées et tachées avec un anticorps contre la coiline. DAPI (canal bleu) permet de segmenter les noyaux. Pour ces analyses, plus de 100 cellules ont été analysées. Le signal GFP reflète la localisation de la protéine ectopique coilin-GFP (canal vert), tandis que le signal de coiline (canal rouge) correspond à la fois à la localisation endogène et exogène des protéines. Pour chaque noyau, l’intensité moyenne du signal GFP reflète le niveau d’expression de la coiline. Selon ce paramètre, les caractéristiques des foyers Coilin ont été analysées à l’aide du bloc Fluorescence Analysis B: 2 Canaux dans le même compartiment. Barre d’échelle, 10 μm.b) Relation entre le nombre de foyers de coilin et l’intensité moyenne de GFP par noyau. Les résultats sont affichés sous forme de parcelles de boîte, où la marque centrale est la médiane, le bord inférieur et supérieur de la boîte sont les25 e et 75e percentiles. Wilcoxon - L’analyse des tests mann whitney démontre une augmentation significative du nombre de foyers pour une intensité GFP >10 (*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0.001). c) Relation entre la zone des foyers de coilin et l’intensité moyenne de GFP par noyau. Les résultats sont affichés sous forme de parcelles de boîte, où la marque centrale est la médiane, le bord inférieur et supérieur de la boîte sont les25 e et 75e percentiles. Wilcoxon - L’analyse d’essai de Mann Whitney démontre une augmentation significative de la superficie des foyers de coilin pour une intensité GFP >10 (*, p<0,05; **, p<0.01; ***, p<0.001). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure S1 : Cinétique de la distribution nucléoplasmique 53BP1 après stress oxydatif
aa) Quantification de foyers nucléaires 53BP1 dans les cellules traitées non traitées ou H2O2 après différents temps d’incubation. Les résultats sont affichés sous forme de parcelles de boîte, où la marque centrale est la médiane, le bord inférieur et supérieur de la boîte sont les25 e et 75e percentiles. Wilcoxon - L’analyse des tests mann whitney démontre une différence significative entre les cellules traitées non traitées et les cellules traitées H2O2 (*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0.001). b) Pour chaque point de la cinétique, une courbe ROC (Caractéristique d’exploitation du récepteur) a été établie pour déterminer le meilleur seuil de distinction entre les cellules stressées et non stressées. Les paramètres de chaque test sont signalés dans le tableau (Sensibilité, spécificité, TP: vrai positif, TN: vrai négatif, FP: faux positif, FN: faux négatif). À partir de ces données, un seuil global de 17 53BP1 foyers a été déterminé à discriminer les cellules non stressées par la cinétique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Un nombre croissant d’outils logiciels libres sont disponibles pour l’analyse des images des cellules de fluorescence. Les utilisateurs doivent choisir correctement le logiciel adéquat en fonction de la complexité de leur problématique, de leurs connaissances dans le traitement d’image, et au temps qu’ils veulent passer dans leur analyse. Icy, CellProfiler, ou ImageJ / Fidji sont des outils puissants combinant à la fois la facilité d’utilisation et la fonctionnalité3. Icy est un outil autonome qui présente une interface utilisateur graphique claire (GUI), et notamment son point et interface de clic « Protocoles » à travers laquelle les flux de travail peuvent être facilement conçus ou manipulés4. La fonctionnalité de ce logiciel est améliorée par la prise en charge et l’utilisation de plug-ins ImageJ, et beaucoup de documentation est disponible grâce à sa grande communauté d’utilisateurs. Nous avons utilisé cette forte combinaison de facilité d’utilisation et de fonctionnalité du logiciel Icy pour développer le flux de travail Substructure Analyzer. Son objectif principal est de proposer une solution automatisée pour effectuer une analyse complète du signal fluorescent cellulaire à partir de plusieurs images. L’analyse comprend le prétraitement de l’image, la segmentation des objets et l’analyse des signaux fluorescents.

Plusieurs protocoles sont partagés avec gratitude sur le site Web de Icy et proposent d’utiliser les fonctionnalités de Icy pour détecter et analyser les signaux fluorescents comme les foyers cellulaires. Toutefois, certains de ces protocoles ne traitent qu’une image par exécution, n’exportent pas les résultats dans un fichier spécifique ou n’analysent pas un seul canal. D’autres ne contiennent pas de segmentation préliminaire pour déterminer les régions d’intérêt (ROI) ou ne proposent pas d’algorithmes simples comme les « oyens H » qui ne sont pas adaptés à la segmentation d’objets fortement groupés. Substructure Analyzer automatise toutes les étapes de l’analyse d’image, du prétraitement de l’image à la segmentation des objets et à la détection/analyse des signaux fluorescents. Le protocole propose également des méthodes simples ou plus complexes pour la segmentation des objets et l’exportation des données (noms des objets segmentés, analyse des foyers) est réalisée dans des sorties optimisées adaptées au problème. CellProfiler propose également de puissants pipelines composés de modules qui encapsulent les fonctionnalités18,19. Les pipelines disponibles sont bien adaptés à des problèmes spécifiques. Les flux de travail glacés sont un réseau de boîtes différentes, chacune d’entre elles effectuant une tâche spécifique. Grâce à l’interface « Protocoles », les boîtes composant le réseau sont intuitives et faciles à manipuler. L’analyseur de sous-structure est adapté à plusieurs contextes comme la simple fusion des canaux, la quantification de la distribution des signaux fluorescents entre deux compartiments subcellulaires, l’analyse des foyers dans un ou plusieurs canaux à partir d’un ou deux compartiments cellulaires dans des cellules individuelles. Plusieurs affichages permettent de visualiser les résultats intermédiaires au cours de chaque exécution pour contrôler le traitement. En outre, Icy présente des barres d’icônes qui regroupent les méthodes par sujet et à partir desquelles les fonctionnalités trouvées dans le flux de travail peuvent être manipulées séparément pour tester manuellement des paramètres spécifiques sur certaines images avant de les utiliser sur un ensemble d’images entier.

Comme dans le domaine de l’analyse bioimage, l’étape la plus critique de ce protocole est la segmentation d’objet. Le protocole propose la segmentation des objets primaires, qui sont la plupart des noyaux de cellules de temps, et contient également un autre bloc dont la tâche consiste à segmenter un deuxième type d’objets dans la cellule. La segmentation des noyaux peut être difficile lorsque les objets sont fortement regroupés de sorte qu’ils se touchent ou se chevauchent. Différentes alternatives pour la segmentation des objets primaires sont contenues dans le protocole, en fonction de la forme des objets et du niveau de clustering, même si à ce jour aucun succès d’algorithme universel dans la segmentation complète des objets fortement groupés. Le processus de segmentation est principalement limité par la détermination de paramètres corrects qui pourraient segmenter avec succès une partie des objets mais conduire à une sous-segmentation ou à une sur segmentation d’une autre partie. L’utilisateur devrait effectuer différentes exécutions avec différents paramètres pour obtenir une segmentation correcte finale, en particulier pour les objets en cluster présentant des formes hétérogènes et non convexes.

Ce protocole est principalement limité par l’étape de segmentation, qui pourrait prendre beaucoup de temps et avoir besoin d’une configuration informatique puissante pour les cas les plus complexes. Plus précisément, plus les images sont nombreuses ou complexes (objets groupés en segment, un nombre élevé de pixels dans les images), plus la mémoire d’accès aléatoire (RAM) de l’utilisateur aura besoin. Globalement, pour tout problème, l’utilisateur devra exécuter le protocole sur un environnement Java Runtime 64 bits (librement disponible sur le site Java) et d’utiliser un système d’exploitation 64 bits (OS) pour augmenter la mémoire disponible utilisée par Icy (mémoire est limitée à 1300 Mo pour 32 bits JRE). En raison du script, le protocole ne fonctionne pas correctement sur un ordinateur Mac. En outre, le nombre de paramètres augmente avec la complexité du problème et nécessitera plus de connaissances dans l’analyse d’image. En ce qui concerne les critères de fonctionnalité, ce protocole n’a pas encore été adapté pour l’analyse des images empilées (piles de temps, z-stacks) même si Icy effectue efficacement l’analyse sur ce type de données.

Des mises à jour futures seront réalisées notamment pour améliorer la segmentation des objets en cluster complexes. Des blocs supplémentaires seront développés pour adapter la segmentation aux structures cellulaires groupées avec des formes irrégulières non convexes. Nous adapterons également le flux de travail pour l’analyse du temps et des piles z (pour l’imagerie en direct et les données 3D).

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

G.H. a reçu une bourse d’études supérieures du Ministère délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. a reçu une bourse d’études supérieures de l’Institut de Cédrologie de Lorraine (ICL), tandis que Q.T. a bénéficié d’une subvention publique supervisée par l’Agence nationale de la recherche Français (ANR) dans le cadre du deuxième programme « Investissements d’Avenir » FIGHT-HF (référence : ANR-15-RHU4570004). Ces travaux ont été financés par le CNRS et l’Université de Lorraine (UMR 7365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free Thermo Fisher Scientific 28908 to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific A-11008 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific A-21425 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A34055 fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA) euromedex 04-100-812-E
DMEM Sigma-Aldrich D5796-500ml cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040-5ML mounting medium
Human: HeLa S3 cells IGBMC, Strasbourg, France cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) Sigma-Aldrich H1009-100ml used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent Thermo Fisher Scientific 11668-019 transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin abcam ab11822 Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope Nikon epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985062 transfection medium
PBS pH 7.4 (10x) gibco 70011-036 to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1 Thermo Fisher Scientific PA1-16565 53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4 Sigma-Aldrich SAB4200114 EDC4-specific antibody
Triton X-100 Roth 6683 to permeabilize the cells

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References

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Bioingénierie Numéro 161 Microscopie de fluorescence Analyse de bio-image Segmentation cellulaire Comptage des focis Corps cellulaires Stress oxydatif Automatisation Analyse de translocation Analyseur de sous-structure Icy Image J
Analyseur de sous-structure : Un flux de travail convivial pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans les images de microscopie de fluorescence
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Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, … More

Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, L., Thuillier, Q., de Chaumont, F., Dallongeville, S., Behm-Ansmant, I. Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images. J. Vis. Exp. (161), e60990, doi:10.3791/60990 (2020).

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