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Bioengineering

Analisador de subestrutura: Um fluxo de trabalho fácil de usar para exploração rápida e análise precisa de corpos celulares em imagens de microscopia de fluorescência

Published: July 15, 2020 doi: 10.3791/60990
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Université de Lorraine, CNRS, IMoPA F54000 Nancy France, 2Institut Pasteur, BioImage Analysis Unit, CNRS UMR 3691, Paris, France.

Summary

Apresentamos um fluxo de trabalho livremente disponível construído para rápida exploração e análise precisa de corpos celulares em compartimentos celulares específicos em imagens de microscopia de fluorescência. Este fluxo de trabalho fácil de usar é projetado no software de código aberto Icy e também usa funcionalidades ImageJ. O gasoduto é acessível sem conhecimento em análise de imagens.

Abstract

A última década tem sido caracterizada por avanços em técnicas de microscopia de fluorescência ilustradas pela melhoria da resolução espacial, mas também em imagens de células vivas e técnicas de microscopia de alto rendimento. Isso levou a um aumento constante na quantidade e complexidade dos dados de microscopia para um único experimento. Como a análise manual dos dados de microscopia é muito demorada, subjetiva e proíbe análises quantitativas, a automação da análise de bioimagem está se tornando quase inevitável. Construímos um fluxo de trabalho de informática chamado Substructure Analyzer para automatizar totalmente a análise de sinais em bioimagems de microscopia fluorescente. Este fluxo de trabalho é desenvolvido na plataforma de código aberto Icy e é concluído por funcionalidades do ImageJ. Inclui o pré-processamento de imagens para melhorar a relação sinal/ruído, a segmentação individual das células (detecção de limites celulares) e a detecção/quantificação de corpos celulares enriquecidos em compartimentos celulares específicos. A principal vantagem deste fluxo de trabalho é propor funcionalidades complexas de bioimagem aos usuários sem experiência em análise de imagem por meio de uma interface fácil de usar. Além disso, é altamente modular e adaptado a várias questões desde a caracterização da translocação nuclear/citoplasmática até a análise comparativa de diferentes corpos celulares em diferentes subescobrições celulares. A funcionalidade deste fluxo de trabalho é ilustrada através do estudo dos Corpos de Cajal (enrolados) sob condições de estresse oxidativo (OS). Dados da microscopia de fluorescência mostram que sua integridade em células humanas é impactada poucas horas após a indução do SO. Este efeito é caracterizado pela diminuição da nucleação de coilina em corpos característicos de Cajal, associados a uma redistribuição nucleoplasmática de coilina em um número aumentado de focos menores. O papel central da coilina na troca entre os componentes do CB e o nucleoplasma circundante sugere que a redistribuição induzida pelo SO do coilin poderia afetar a composição e a funcionalidade dos Corpos de Cajal.

Introduction

Microscopia leve e, mais particularmente, microscopia de fluorescência são técnicas robustas e versáteis comumente utilizadas em ciências biológicas. Eles dão acesso à localização precisa de várias biomoléculas como proteínas ou RNA através de sua rotulagem fluorescente específica. A última década foi caracterizada por rápidos avanços em tecnologias de microscopia e imagem, evidenciados pelo Prêmio Nobel de Química de 2014, premiando Eric Betzig, Stefan W. Hell e William E. Moerner pelo desenvolvimento de microscopia de fluorescência super resolvida (SRFM)1. O SFRM contorna o limite de difração da microscopia óptica tradicional para trazê-lo para a nanodimensional. A melhoria de técnicas como imagens ao vivo ou abordagens de triagem de alto rendimento também aumenta a quantidade e a complexidade dos dados para tratar para cada experimento. Na maioria das vezes, os pesquisadores se deparam com altas populações heterogêneas de células e querem analisar fenótipos no nível unicelular.

Inicialmente, análises como a contagem de focos foram realizadas por olho, o que é preferido por alguns pesquisadores, uma vez que fornece controle visual total sobre o processo de contagem. No entanto, a análise manual desses dados é muito demorada, leva à variabilidade entre observadores e não dá acesso a recursos mais complexos para que abordagens assistidas por computador estejam se tornando amplamente utilizadas e quase inevitáveis2. Os métodos de informática da bioimagem aumentam substancialmente a eficiência da análise de dados e estão livres da subjetividade inevitável do operador e do viés potencial da análise de contagem manual. O aumento da demanda neste campo e a melhoria do poder computacional levaram ao desenvolvimento de um grande número de plataformas de análise de imagens. Alguns deles estão disponíveis gratuitamente e dão acesso a várias ferramentas para realizar análises com computadores pessoais. Uma classificação de ferramentas de acesso aberto foi recentemente estabelecida3 e apresenta o Icy4 como um software poderoso que combina usabilidade e funcionalidade. Além disso, Icy tem a vantagem de se comunicar com ImageJ.

Para usuários sem experiência em análise de imagem, os principais obstáculos são escolher a ferramenta apropriada de acordo com os parâmetros problemáticos e de sintonia correta que muitas vezes não são bem compreendidos. Além disso, os tempos de configuração são muitas vezes longos. A Icy propõe uma interface de ponto e clique amigável chamada "Protocolos" para desenvolver fluxo de trabalho, combinando alguns plugins encontrados dentro de uma coleção exaustiva4. O design modular flexível e a interface point-and-click tornam a configuração uma análise viável para não-programadores. Aqui apresentamos um fluxo de trabalho chamado Substructure Analyzer,desenvolvido na interface de Icy, cuja função é analisar sinais fluorescentes em compartimentos celulares específicos e medir diferentes características como brilho, número de focos, tamanho de focos e distribuição espacial. Este fluxo de trabalho aborda várias questões como quantificação da translocação de sinal, análise de células transfeminadas expressando um repórter fluorescente ou análise de focos de diferentes subestruturas celulares em células individuais. Ele permite o processamento simultâneo de várias imagens e os resultados de saída são exportados para uma planilha delimitada por guias que podem ser abertas em programas de planilha comumente usados.

O gasoduto Analisador de Subestrutura é apresentado na Figura 1. Primeiro, todas as imagens contidas em uma pasta especificada são pré-processadas para melhorar sua relação sinal/ruído. Esta etapa aumenta a eficiência das etapas seguintes e diminui o tempo de execução. Em seguida, são identificadas e segmentadas as Regiões de Interesse (ROIs), correspondentes às áreas de imagem onde o sinal fluorescente deve ser detectado, são identificadas e segmentadas. Finalmente, o sinal fluorescente é analisado e os resultados são exportados para uma planilha delimitada por guias.

A segmentação de objetos (detecção de limites) é o passo mais desafiador na análise de imagens, e sua eficiência determina a precisão das medições celulares resultantes. Os primeiros objetos identificados em uma imagem (chamados objetos primários) são frequentemente núcleos de imagens manchadas de DNA (coloração DAPI ou Hoechst), embora objetos primários também possam ser células inteiras, contas, manchas, tumores ou quaisquer objetos manchados. Na maioria das imagens biológicas, células ou núcleos se tocam ou se sobrepõem fazendo com que os algoritmos simples e rápidos falhem. Até o momento, nenhum algoritmo universal pode realizar a segmentação perfeita de todos os objetos, principalmente porque suas características (tamanho, forma ou textura) modulam a eficiência da segmentação5. As ferramentas de segmentação comumente distribuídas com software de microscopia (como o MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices6, ou o NIS-Elements Advances Research software by Nikon7) são geralmente baseadas em técnicas padrão, como correspondência de correlação, limiar ou operações morfológicas. Embora eficientes em sistemas básicos, esses métodos supergeralizados rapidamente apresentam limitações quando utilizados em contextos mais desafiadores e específicos. De fato, a segmentação é altamente sensível a parâmetros experimentais, como tipo de célula, densidade celular ou biomarcadores, e frequentemente requer ajuste repetido para um grande conjunto de dados. O fluxo de trabalho do Analisador de Subestrutura integra algoritmos simples e mais sofisticados para propor diferentes alternativas adaptadas à complexidade da imagem e às necessidades do usuário. Ele propõe notavelmente o algoritmo de bacia hidrográfica baseado em marcador8 para objetos altamente agrupados. A eficiência deste método de segmentação depende da seleção de marcadores individuais em cada objeto. Esses marcadores são escolhidos manualmente na maior parte do tempo para obter parâmetros corretos para a segmentação completa, o que é altamente demorado quando os usuários enfrentam um alto número de objetos. O Analisador de Subestrutura propõe uma detecção automática desses marcadores, proporcionando um processo de segmentação altamente eficiente. A segmentação é, na maioria das vezes, a etapa limitante da análise de imagens e pode modificar consideravelmente o tempo de processamento dependendo da resolução da imagem, do número de objetos por imagem e do nível de agrupamento de objetos. Os dutos típicos requerem alguns segundos a 5 minutos por imagem em um computador de mesa padrão. A análise de imagens mais complexas pode exigir um computador mais poderoso e alguns conhecimentos básicos em análise de imagens.

A flexibilidade e funcionalidade deste fluxo de trabalho são ilustradas com vários exemplos nos resultados representativos. As vantagens deste fluxo de trabalho são notavelmente demonstradas através do estudo de subestruturas nucleares sob condições de estresse oxidativo (OS). O OS corresponde a um desequilíbrio da homeostase redox em favor dos oxidantes e está associado a altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS). Uma vez que a ROS atua como moléculas de sinalização, as mudanças em sua concentração e localização subcelular afetam positiva ou negativamente uma miríade de vias e redes que regulam funções fisiológicas, incluindo transdução de sinais, mecanismos de reparação, expressão genética, morte celular e proliferação9,,10. Assim, a OS está diretamente envolvida em diversas patologias (doenças neurodegenerativas e cardiovasculares, cânceres, diabetes, etc.), mas também no envelhecimento celular. Portanto, decifrar as consequências da OS na organização e função da célula humana constitui um passo crucial na compreensão dos papéis da OS no início e desenvolvimento das patologias humanas. Foi estabelecido que o OS regula a expressão genética através da modulação da transcrição através de vários fatores de transcrição (p53, Nrf2, FOXO3A)11, mas também afetando a regulação de vários processos co e pós-transcrição, como o emenda alternativa (AS) das pré-RNAs12,,13,,14. O splicing alternativo de codificação primária e transcrições não codificadas é um mecanismo essencial que aumenta a capacidade de codificação dos genomas produzindo isoformas de transcrição. O AS é realizado por um enorme complexo de ribonucleoproteína chamado emenda ao esfarmato, contendo quase 300 proteínas e 5 pequenas RNAs nucleares (UsnRNAs)15. A montagem de spliceosome e as são fortemente controladas em células e alguns passos da maturação de emendas ocorrem dentro de compartimentos nucleares sem membrana chamados Corpos de Cajal. Essas subestruturas nucleares são caracterizadas pela natureza dinâmica de sua estrutura e sua composição, que são conduzidas principalmente por interações multivalentes de seus componentes de RNA e proteína com a proteína coilina. A análise de milhares de células com o fluxo de trabalho do Analisador de Subestrutura permitiu a caracterização de efeitos nunca descritos do SO em Corpos de Cajal. De fato, dados obtidos sugerem que o OS modifica a nucleação dos Corpos de Cajal, induzindo uma redistribuição nucleoplasmática da proteína coilin em numerosos focos nucleares menores. Tal mudança na estrutura dos Corpos de Cajal pode afetar o amadurecimento do emenda e participar da modulação de AS pela OS.

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Protocol

NOTA: Tutoriais fáceis de usar estão disponíveis no site da Icy http://icy.bioimageanalysis.org.

1. Baixe O Gelo e o protocolo Analisador de Subestrutura

  1. Baixe Icy no site da Icy(http://icy.bioimageanalysis.org/download) e baixe o protocolo Substructure Analyzer: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
    NOTA: Se usar um SO de 64 bits, certifique-se de usar a versão de 64 bits do Java. Esta versão permite aumentar a memória alocada ao Gelo (Preferências | Geral | Memória máxima).

2. Abertura do protocolo

  1. Abra o Gelo e clique em Ferramentas no menu Fita.
  2. Clique em Protocolos para abrir a interface do Editor de Protocolos.
  3. Clique em Carregar e abra o protocolo Subestrutura Analisador. O carregamento do protocolo pode levar alguns segundos. Certifique-se de que a abertura do protocolo está completa antes de usá-lo.
    NOTA: O fluxo de trabalho é composto por 13 blocos gerais apresentados na Figura 2a. Cada bloco funciona como um pipeline composto por várias caixas executando subtarefas específicas.

3. Interagindo com o fluxo de trabalho em Icy

NOTA: Cada bloco ou caixa é numerado e tem uma classificação específica dentro do fluxo de trabalho (Figura 2b). Ao clicar neste número, a posição mais próxima possível da primeira é atribuída ao bloco/caixa selecionado, em seguida, a posição dos outros blocos/caixas é reorganizada. Respeite a ordem certa dos blocos ao preparar o fluxo de trabalho. Por exemplo, o bloco Spot Detector precisa de ROIs pré-definidos para que os blocos de segmentação tenham que ser executados antes dos blocos do Detector de Manchas. Não modifique a posição das caixas. Não use "." no nome da imagem.

  1. Clicando no ícone do canto superior esquerdo, desabar, expandir, ampliar, estreitar ou remover o bloco(Figura 2b).
  2. Cada pipeline do fluxo de trabalho é caracterizado por uma rede de caixas conectadas através de sua entrada e saída(Figura 2b). Para criar uma conexão, clique em Saída e mantenha até que o cursor atinja uma entrada. As conexões podem ser removidas clicando na tag Saída.

4. Fusão dos canais de uma imagem

  1. Use o bloco Mesclar canais para gerar imagens mescladas. Se necessário, renomeie os arquivos para que as sequências a serem mescladas tenham o prefixo do mesmo nome seguido por um separador distinto. Por exemplo, sequências de canais individuais de uma imagem A são nomeadas: ImageA_red, ImageA_blue.
    NOTA: Para o separador, não utilize caracteres já presentes no nome da imagem.
  2. Na mesma pasta, crie uma nova pasta por canal para mesclar. Por exemplo, para mesclar canais vermelhos, verdes e azuis, crie 3 pastas e armazene as sequências correspondentes nessas pastas.
  3. Use apenas os canais de mesclagemdo bloco, remova os outros blocos e salve o protocolo como Canais de Mesclagem.
    1. Acesse as caixas para definir parâmetros. Para cada canal, preencha as caixas Canal X (caixas 1, 5 ou 9), pasta do canal número X (caixas 2, 6 ou 10), separador número X (caixas 3, 7 ou 11) e canal Colormap nb X (caixas 4, 8 e 12) respectivamente.
      NOTA: Estas caixas são agrupadas horizontalmente por quatro, cada linha correspondente ao mesmo canal. Em cada linha, um display também está disponível (caixas 23, 24 ou 25) para visualizar diretamente a sequência do canal correspondente.
      1. Na caixa Canal X,escolha qual canal extrair (em imagens RGB clássicas, 0=Vermelho, 1=Verde, 2=Azul). O usuário acessa rapidamente os diferentes canais de uma imagem dentro da janela Inspetor de Gelo, na guia Sequência. Escreva o menor valor do canal na linha superior e o mais alto na linha de fundo.
      2. Na caixa Pasta do canal X,escreva o \Nome da pasta contendo imagens do canal X.
      3. Na caixa Separador do canal X,escreva o separador usado para o nome da imagem (no exemplo anterior: "_red", "_green" e "_blue").
      4. Na caixa Colormap canal nb X,indique com um número qual modelo colormap usar para visualizar o canal correspondente em Gelo. As imagens coloridas disponíveis são visíveis na guia Sequência da janela Inspetor.
      5. Na caixa Formato de imagens mescladas (caixa 28), escreva a extensão para salvar imagens mescladas: .tif, .gif, .jpg, .bmp ou .png.
        NOTA: Para mesclar apenas 2 canais, não preencha as quatro caixas correspondentes ao terceiro canal.
    2. No canto superior esquerdo do bloco Canais de Mesclagem, clique no link diretamente à direita da Pasta. Na caixa de diálogo Abrir que aparece, clique duas vezes na pasta contendo sequências do primeiro canal que foi definido na caixa Pasta do canal número 1 (caixa 2). Em seguida, clique em Abrir.
    3. Execute o protocolo clicando na seta preta no canto superior esquerdo do bloco Canais de Mesclagem (consulte a parte 7 para obter mais detalhes). As imagens mescladas são salvas em uma pasta 'Mescla' no mesmo diretório das pastas de canais individuais.

5. Segmentação das regiões de interesse

NOTA: O Analisador de Subestrutura integra algoritmos simples e mais sofisticados para propor diferentes alternativas adaptadas à complexidade da imagem e às necessidades do usuário.

  1. Selecione o bloco adaptado.
    1. Se os objetos não se tocarem, ou o usuário não precisar diferenciar objetos agrupados individualmente, use o bloco Segmentação A: Objetos não agrupados.
    2. Quando os objetos não se tocam, mas alguns deles estão próximos, use o bloco Segmentação B: Objetos mal agrupados.
    3. Para objetos com alto nível de agrupamento e forma convexa, use o bloco Segmentação C: Objetos agrupados com formas convexas.
    4. Se os objetos apresentarem um alto nível de agrupamento e tiverem formas irregulares, use o bloco Segmentação D: Objetos agrupados com formas irregulares.
    5. Use o bloco Segmentação E: Citoplasma agrupado para segmentar citoplasmas tocantes individualmente usando núcleos segmentados como marcadores. Este bloco precisa imperativamente de núcleos segmentados para processar.
      NOTA: Blocos adaptados para o processo de segmentação de objetos primários de forma independente para que vários blocos possam ser usados na mesma execução para comparar sua eficiência com uma subestrutura específica ou para segmentar diferentes tipos de subestruturas. Se o nível de agrupamento for heterogêneo dentro do mesmo conjunto de imagens, então processe objetos pequenos e altamente agrupados separadamente nos blocos adaptados.
  2. Vincule a saída0 (Arquivo) do bloco Selecione pasta à entrada da pasta do bloco de segmentação escolhido.
  3. Definir parâmetros do bloco de segmentação escolhido.
    1. Segmentação A: Objetos não agrupados e Segmentação C: Objetos agrupados com formas convexas
      1. Na caixa Sinal do canal (caixa 1), defina o canal dos objetos para segmentar.
      2. Como opção, na caixa filtro gaussiano (caixa 2), aumente os valores X e Y sigma se o sinal dentro dos objetos for heterogêneo. O filtro gaussiano suaviza texturas para obter regiões mais uniformes e aumenta a velocidade e eficiência da segmentação dos núcleos. Quanto menor os objetos, menor é o valor sigma. Evite valores sigma altos. Defina os valores padrão para 0.
      3. Na caixa HK-Means (caixa 3), defina o parâmetro de classes de intensidade e os tamanhos mínimos e máximos aproximados (em pixels) dos objetos a serem detectados.
        NOTA: Para classes de intensidade, um valor de 2 classifica pixels em 2 classes: fundo e primeiro plano. Assim, é adaptado quando o contraste entre os objetos e o fundo é alto. Se os objetos em primeiro plano tiverem intensidades diferentes ou se o contraste com o fundo for baixo, aumente o número de classes. A configuração padrão é 2. O tamanho do objeto pode ser rapidamente avaliado desenhando um ROI manualmente em torno do objeto de interesse. O tamanho do ROI (Interior em pixels) aparece diretamente na imagem ao apontá-lo com o cursor ou pode ser acessado na janela de estatísticas do ROI (abra-a da barra de pesquisa). Parâmetros ideais detectam cada objeto em primeiro plano em um único ROI. Eles podem ser definidos manualmente em Gelo(Detecção e Rastreamento | HK-Means).
      4. Na caixa Contornos Ativos (caixa 4), otimize a detecção de bordas de objeto. A documentação exaustiva para este plugin está disponível online: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. Parâmetros corretos também podem ser definidos manualmente em Gelo (Detecção e Rastreamento | Contornos Ativos).
      5. Durante o processo, uma pasta é criada automaticamente para salvar imagens de objetos segmentados. Na caixa Texto (caixa 6), nomeie esta pasta (ex: Núcleos segmentados). Para definir o formato para salvar imagens de objetos segmentados (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG), preencha o formato de caixa de imagens de objetos segmentados. A pasta é criada na pasta contendo imagens mescladas.
      6. Execute o fluxo de trabalho (para mais detalhes, consulte a parte 7).
    2. Segmentação B: Objetos mal agrupados
      1. Siga os mesmos passos do 5.3.1 para definir parâmetros de caixas Sinal de canal, HK-Means, Contornos Ativos, Extensão para salvar objetos segmentados e Texto (As fileiras das caixas não são as mesmas da etapa 5.3.1).
      2. Na caixa Ligue para o plugin IJ (caixa 4), defina o parâmetro Rolamento para controlar a subtração de fundo. Defina este parâmetro para pelo menos o tamanho do maior objeto que não faz parte do fundo. A diminuição desse valor aumenta a remoção de fundo, mas também pode induzir a perda de sinal em primeiro plano.
      3. Na caixa Equalização de histograma adaptativo (caixa 6), melhore os contrastes entre os objetos do primeiro plano e o fundo. Aumentar a inclinação dá sequências mais contrastadas.
      4. Execute o fluxo de trabalho (para mais detalhes, consulte a parte 7).
    3. Segmentação D: Objetos agrupados com formas irregulares
      NOTA: Três métodos diferentes de segmentação se aplicam a cada imagem: em primeiro lugar,Agrupamento de meios HKcombinado com oMétodo de contornos ativosé aplicado. Então, oalgoritmo divisor de águas clássico(usando o mapa de distância euclidiano) é aplicado a objetos segmentados anteriormente. Finalmente, umalgoritmo de bacia hidrográfica baseado em marcadoré usado. Apenas os métodos de bacia hidrográfica baseados em HK e marcadores precisam de intervenção do usuário. Para ambos os métodos, os mesmos parâmetros podem ser aplicados para todas as imagens (versão totalmente automatizada) ou ser alterados para cada imagem (versão semi-automatizada). Se o usuário não for treinado nesses métodos de segmentação, o processamento semi-automatizado é altamente recomendado. Durante o processamento deste bloco, é necessária intervenção manual. Quando um método de segmentação é concluído, o usuário deve remover manualmente objetos segmentados incorretamente antes do início do próximo método de segmentação. Objetos segmentados com sucesso são salvos e não considerados na próxima etapa(s). Este bloco tem que ser conectado com o blocoAgrupado/heterogêneo formas de segmentação de objetos primários Caixa de diálogopara trabalhar corretamente.
      1. Baixe a coleção ImageJ MorphoLibJ em https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. A versão MorphoLibJ 1.4.0 é usada neste protocolo. Coloque o arquivo MorphoLibJ_-1.4.0.jar na pasta icy/ij/plugins. Mais informações sobre o conteúdo desta coleção estão disponíveis na https://imagej.net/MorphoLibJ.
      2. Siga os mesmos passos da etapa 5.3.1 para definir parâmetros de caixas Sinal de canal, filtro gaussiano, Contornos Ativos, Extensão para salvar objetos segmentados e Texto. Active Contours As caixas não são as mesmas da etapa 5.3.1.
      3. Definir parâmetros da caixa Equalização do histograma adaptativo (ver passo 5.3.2.3).
      4. Para ativar o fundo subtraído,escreva sim em Aplicar fundo subtraído? (caixa 5). Senão, escreva "Não". Se o plugin estiver ativado, defina o parâmetro de rolamento (ver o passo 5.3.2), na caixa Subtrair parâmetro de fundo (caixa 7).
      5. Automatização de hk-significa: Para aplicar os mesmos parâmetros para todas as imagens (processamento totalmente automatizado), defina o Nb de classes (caixa 11), o tamanho mínimo (caixa 12) e o tamanho máximo (box13) (ver etapa 5.3.1). Esses parâmetros devem ser definidos para selecionar um máximo de pixels em primeiro plano e otimizar a individualização de objetos em primeiro plano. Para a versão de processamento semi-automatizada, não é necessária nenhuma intervenção.
      6. Automatização de extrações de marcadores: para a versão totalmente automatizada, expanda a caixa Extração de Marcadores Internos (caixa 27) e defina o valor do parâmetro "dinâmico" na linha 13 do script. Para a versão de processamento semi-automatizada, não é necessária nenhuma intervenção.
        NOTA: Os marcadores são extraídos aplicando uma transformação de minima estendida em uma imagem de entrada controlada por um parâmetro "dinâmico". No algoritmo da bacia hidrográfica baseado em marcadores, a inundação desses marcadores é simulada para realizar a segmentação de objetos. Para a segmentação bem sucedida de objetos em primeiro plano, um único marcador por objeto em primeiro plano deve ser extraído. A configuração do parâmetro "dinâmico" para extração de marcadores ideais depende principalmente da resolução de imagens. Assim, se não estiver familiarizado com este parâmetro, use a versão semi-automatizada.
      7. Execute o fluxo de trabalho (para mais detalhes, consulte a parte 7).
      8. No início do processamento, as caixas de diálogo HK-means parâmetros e a bacia hidrográfica baseada em marcadores são abertas sucessivamente. Para aplicar os mesmos parâmetros para todas as imagens (versão totalmente automatizada), clique em YES. Caso contrário, clique em NO. Uma caixa de informações é aberta, pedindo para "Determinar ROIs ideais com plugin HK-Means e imagem fechada". Clique em OK e aplique manualmente o plugin HK-Means (Detecção e Rastreamento| HK-Means) na imagem, que se abre automaticamente. Selecione a opção ROIs de exportação na caixa de plugin HK-Means. Aplique os melhores parâmetros para ter ROIs contendo um máximo de pixels em primeiro plano e para otimizar a individualização de objetos em primeiro plano. Quando forem encontrados ROIs ideais, feche diretamente a imagem.
      9. No final do primeiro método de segmentação, uma caixa de informações é aberta e pede para "Remover ROIs indesejados e fechar imagem". Esses ROIs correspondem às bordas dos objetos segmentados. Selecione OK e remova ROIs de objetos segmentados errados na imagem, que abre automaticamente. Um ROI pode ser facilmente removido colocando o cursor em sua borda e usando o botão "Excluir" do teclado. Feche a imagem. Repita o mesmo procedimento após a conclusão da segunda etapa de segmentação.
      10. Nesta fase, se o botão YES for selecionado para a automatização completa do algoritmo de bacia hidrográfica baseado em marcadores, os parâmetros previamente definidos serão aplicados a todas as imagens.
      11. Se o botão NO for selecionado, uma caixa de informações será aberta, pedindo para "Determinar e ajustar marcadores internos". Clique em OK e dentro da interface ImageJ do Icy, vá para Plugins | MorphoLibJ | Minima e Maxima| Min & Max estendido. Em Operação, selecione Minima Estendida.
      12. Selecione Visualizar para visualizar previamente a imagem aberta automaticamente, o resultado da transformação. Mova a dinâmica até que os marcadores ideais sejam observados. Marcadores são grupos de pixels com um valor de 255 (não necessariamente pixels brancos). Os parâmetros ideais levam a um marcador por objeto. Concentre-se nos objetos remanescentes que não foram bem segmentados com os dois métodos de segmentação anteriores.
      13. Se necessário, melhore os marcadores aplicando operações morfológicas adicionais como "Abertura" ou "Fechamento"(Plugins | MorphoLibJ | Filtros Morfológicos). Ao obter a imagem final dos marcadores, mantenha-a aberta e feche todas as outras imagens terminando com a imagem inicialmente usada como entrada para a operação Minima Estendida. Clique em Não se uma caixa ImageJ pedir para salvar alterações nesta imagem.
      14. Na caixa Nb de imagens com Caixa de Informações (caixa 14), determine quantas imagens com caixas de informação devem aparecer.
    4. Segmentação E: Citoplasma agrupado
      NOTA: Este bloco usa núcleos segmentados anteriormente como marcadores individuais para iniciar a segmentação do citoplasma. Certifique-se de que o bloco de segmentação de núcleos tenha sido processado antes de usá-lo.
      1. Na caixa Canal cytoplasm (caixa 1), defina o canal do sinal citoplasmizado.
      2. Na caixa Extensão de núcleos segmentados (caixa 2), escreva o formato utilizado para salvar imagens de núcleos segmentados (tif, jpeg, bmp, png). O formato padrão é tif.
      3. Na caixa Texto (caixa3), escreva o \Nome da pasta contendo núcleos segmentados.
      4. Na caixa Formato de imagens de citoplasmas segmentados (caixa 4), defina o formato para ser usado para salvar imagens segmentadas (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG).
      5. Durante o processo, uma pasta é criada automaticamente para salvar imagens de citoplasmas segmentados. Na caixa Texto (caixa 5), nomeie esta pasta (ex: citoplasmas segmentados). A pasta é criada na pasta contendo imagens mescladas.
      6. Siga os mesmos passos da etapa 5.3.1 para definir parâmetros de caixas filtro gaussiano e Contornos Ativos (Tenha cuidado, as classificações da caixa não são as mesmas da etapa 5.3.1).
      7. Execute o fluxo de trabalho (para mais detalhes, consulte a parte 7).

6. Detecção e análise de sinal fluorescente

  1. Selecione o bloco adaptado.
    1. No bloco Análise de Fluorescência A: 1 Canal,realize a detecção e análise de focos em um canal dentro de um tipo de objeto segmentado: detecção de focos de coilin (canal vermelho) dentro do núcleo.
    2. No bloco Análise de Fluorescência B: 2 Canais no mesmo compartimento,realizam detecção e análise de focos em dois canais dentro de um tipo de objeto segmentado: detecção de coilin (canal vermelho) e 53BP1 (canal verde) focos dentro do núcleo.
    3. No bloco Análise de Fluorescência C: 2 Canais em dois compartimentos,realizam detecção e análise de focos em um ou dois canais, especificamente dentro dos núcleos e seu citoplasma correspondente: detecção de focos de coilin (canal vermelho) tanto dentro do núcleo quanto de seu citoplasma correspondente ou detecção de focos de coilin (canal vermelho) dentro do núcleo e foci G3BP (canal verde) dentro do citoplasma correspondente.
    4. No bloco Análise de Fluorescência D: Translocação Global,calcule a porcentagem de sinal de um canal em dois compartimentos celulares (a e b). Por exemplo, em um ensaio de translocação de citoplasma/núcleo, exportar percentuais calculados de sinais nucleares e citoplasmáticos para cada imagem na planilha final de "Resultados". A fórmula usada para calcular a porcentagem de sinal nuclear é mostrada abaixo. Este bloco pode ser usado para qualquer compartimento subcelular:
      Equation 1
    5. No bloco Análise de Fluorescência E: Translocação celular individual,calcule a porcentagem de sinal de um canal em dois compartimentos celulares para cada célula. Este bloco é especialmente otimizado para ensaio de translocação de núcleo/citoplasma no nível de célula única.
      NOTA: Como é necessária a análise de fluorescência do bloco E: Translocação celular individual realiza análises no nível unicelular, é necessária uma segmentação eficiente do núcleo e do citoplasma.
  2. Vincule a saída0 (Arquivo) do bloco Selecionar pasta (bloco 1) à entrada da pasta (setas brancas em círculos pretos) do bloco escolhido.
  3. Defina os parâmetros do bloco escolhido.
    1. Análise de Fluorescência A: 1 Canal, Análise de Fluorescência B: 2 Canais no mesmo compartimento e Análise de Fluorescência C: 2 Canais em dois compartimentos
      1. Na caixa Imagens de pasta ROI, escreva o nome da pasta contendo imagens de objetos segmentados precedidos por uma barra traseira. (Por exemplo: \Núcleos segmentados).
      2. Na caixa Formato de imagens de objetos segmentados (caixa 2), escreva o formato usado para salvar imagens de objetos segmentados (tif, jpeg, bmp, png). O formato padrão é tif.
      3. Na caixa Kill Borders?, escreva Sim para remover objetos de fronteira. Caso contrário, escreva "Não". A instalação da coleção MorphoLibJ de ImageJ é necessária para usar esta função (ver passo 5.3.3).
      4. Na caixa(es) Sinal de manchas do canal,defina o canal onde as manchas devem ser detectadas. Em imagens RGB clássicas, 0=Vermelho, 1=Verde e 2=Azul.
      5. Nas caixas Nome da molécula localizada,escreva o nome da molécula localizado nos pontos. O número de campos para entrar depende do número de moléculas.
      6. Na caixa(es) Bloco do detector de pontos de onda,defina parâmetros de detecção de ponto para cada canal. Defina a escala (referida para o tamanho da mancha) e a sensibilidade da detecção (uma sensibilidade menor diminui o número de pontos detectados, o valor padrão é 100 e o valor mínimo é 0). A documentação exaustiva deste plugin está disponível online: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. Os parâmetros também podem ser definidos manualmente em Gelo(Detecção e Rastreamento | Detector de manchas).
      7. Como opção, na caixa Filtro ROI por tamanho,filtrar os objetos segmentados onde as manchas são detectadas definindo um intervalo de tamanho (em pixels). Esta etapa é especialmente útil para remover objetos subous ou sobre-segmentados. Para estimar manualmente o tamanho dos objetos, consulte o passo 5.3.1. Os parâmetros padrão não incluem a filtragem de ROIs por tamanho. O bloco 2 Canais em dois compartimentos contém duas caixas: Núcleos de filtro por tamanho (caixa 19) e citoplasma do filtro por tamanho (caixa 46).
      8. Opcionalmente, na caixa O filtro mancha por tamanho,filtra as manchas detectadas de acordo com seu tamanho (em pixels) para remover artefatos indesejados. Para estimar manualmente o tamanho do local, clique em Detecção e Rastreamento e abra o plugin do detector Spot. Nas opções de saída, selecione Exportar para ROI. Tenha cuidado para que os parâmetros padrão não incluam filtragem de manchas por tamanho, e que as manchas filtradas não são levadas em conta para a análise. O número de campos para entrar depende do número de canais.
      9. Opcionalmente, na caixa Manchas de filtro,aplique um filtro adicional (contraste, homogeneidade, perímetro, arredondamento) nos pontos detectados. Tenha cuidado para que os parâmetros padrão não incluam filtragem de manchas e que as manchas filtradas não sejam levadas em conta para a análise. O número de campos para entrar depende do número de canais.
      10. Opcionalmente, nas caixas Limite de tamanho spot, defina um limite para a área (em pixels) de pontos analisados. O número de pontos contados abaixo e acima desse limite é exportado na planilha de resultados finais. O número de caixas a serem informadas depende do número de canais.
      11. Execute o fluxo de trabalho (para mais detalhes, consulte a parte 7). Os dados são exportados em uma planilha de resultados salva na pasta contendo imagens mescladas.
    2. Análise de Fluorescência D: Análise global de translocação e fluorescência E: Translocação celular individual:
      1. Nas caixas Imagens da pasta (caixas 1 e 2), escreva o \Nome da pasta contendo imagens de objetos segmentados. No bloco Análise de Fluorescência D: Translocação Global,os dois tipos de ROI são identificados como ROI a e ROI b. Para o bloco Análise de Fluorescência E: Translocação celular individual,em imagens de pasta segmentadas núcleos e caixas de pasta segmentadas de citoplasmas, escreva o nome da pasta contendo núcleos segmentados e citoplasmas segmentados, respectivamente.
      2. Na caixa Sinal do canal (caixa 3), digite o canal do sinal.
      3. Na caixa Formato de imagens de objetos segmentados (caixa 4), escreva o formato usado para salvar imagens de objetos segmentados (tif, jpeg, bmp, png). O formato padrão é tif. A opção Kill Borders também está disponível para remover objetos de borda (ver passo 6.3.1).
      4. Opcionalmente, nas caixas Filtro ROI por tamanho,filtrar os objetos segmentados definindo um intervalo de tamanho (em pixels). Esta etapa pode ser útil para remover objetos subous ou super-segmentados. Para estimar manualmente o tamanho do objeto, consulte o passo 5.3.1. Há dois campos para entrar, um por canal. Os parâmetros padrão não incluem filtragem de ROI por tamanho.
      5. Execute o fluxo de trabalho (para mais detalhes, consulte a parte 7). Exportar dados em uma planilha Resultados salvos na pasta contendo imagens mescladas.

7. Execute o protocolo

  1. Para processar um bloco em uma execução, remova a conexão entre o bloco selecionado e a pasta de seleçãodo bloco . Coloque o bloco procurado na1ª fila. No canto superior esquerdo do bloco procurado, clique no link diretamente para a direita da pasta. Na caixa de diálogo Abrir que aparece, clique duas vezes na pasta contendo as imagens mescladas. Em seguida, clique em Abrir. Clique em Executar para iniciar o fluxo de trabalho. O processamento pode ser interrompido clicando no botão Parar.
  2. Para processar diferentes blocos em uma execução, mantenha conexões de blocos escolhidos com o bloco Selecionar pasta (bloco 1). Certifique-se de que sua classificação permite o bom processamento do fluxo de trabalho. Por exemplo, se um bloco específico precisar de objetos segmentados para processar, certifique-se de que o bloco de segmentação processe antes. Antes de executar o fluxo de trabalho, remova blocos nãousados e salve o novo protocolo com outro nome.
  3. Clique em Executar para iniciar o fluxo de trabalho. Quando a caixa de diálogo aberta for exibida, clique duas vezes na pasta que contém as imagens mescladas. Em seguida, clique em Abrir. O fluxo de trabalho é executado automaticamente. Se necessário, pare o processamento clicando no botão Parar.
  4. No final do processamento, verifique se a mensagem O fluxo de trabalho executado com sucesso apareceu no canto inferior direito e que todos os blocos são sinalizados com um sinal verde(Figura 2b). Caso não, o bloco e a caixa interna que apresenta o sinal de erro indicam o elemento para corrigir(Figura 2b).
    NOTA: Após o fluxo de trabalho executado com sucesso, uma nova execução não pode ser iniciada diretamente e, para processar novamente o fluxo de trabalho, pelo menos um bloco deve ser sinalizado com o sinal "pronto para processar". Para alterar o estado de um bloco, exclua e rees crie um link entre duas caixas dentro deste bloco ou simplesmente feche e reassua o protocolo. Se ocorrer um erro durante o processamento, uma nova execução pode ser iniciada diretamente. Durante uma nova corrida, todos os blocos do gasoduto são processados, mesmo que alguns deles sejam sinalizados com o sinal verde.

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Representative Results

Todas as análises descritas foram realizadas em um laptop padrão (processador quad-core de 64 bits a 2,80 GHz com memória de acesso aleatório (RAM) de 16 GB, trabalhando com a versão de 64 bits do Java. A memória de acesso aleatório é um parâmetro importante a ser considerado, dependendo da quantidade e da resolução das imagens para analisar. O uso da versão de 32 bits do Java limita a memória a cerca de 1300 MB, o que pode ser inadequado para análise de big data, enquanto a versão de 64 bits permite aumentar a memória alocada ao Icy. A Figura 3 relata o tempo necessário para segmentação para diferentes tipos de imagens e diferentes resoluções. Confirma que a alta resolução aumenta substancialmente o tempo de segmentação de objetos primários.

Os dados apresentados nos próximos parágrafos demonstram que o fluxo de trabalho do Analisador de Subestrutura pode ser usado para resolver a maioria das problemáticas comuns encontradas na biologia celular e molecular (contagem celular, contagem de focos e análise, análise de translocação).

A medição em numerosas células da proporção precisa de moléculas concentradas dentro de um determinado compartimento ou a mudança de localização entre domínios subcelulares pode ser uma tarefa muito complicada e propensa a erros, especialmente quando é realizada manualmente. A Figura 4 ilustra a capacidade do fluxo de trabalho de quantificar rapidamente e precisamente a bem descrita translocação nuclear do fator de transcrição NFκB em resposta à estimulação TNFα. As imagens utilizadas para a análise foram graciosamente compiladas por Ilya Ravkin (http://www.ravkin.net/SBS/Image-Library.htm) e estão disponíveis publicamente na Broad Bioimage Benchmark Collection16. Este conjunto contém imagens de linhas celulares MCF7 e A549 tratadas com concentrações crescentes de TNFα. A análise foi realizada em mais de 40.000 células e 96 imagens (48 imagens para cada canal) da linha celular MCF7(Figura 4a). Toda a análise (da importação de imagens à economia de dados) levou 26 minutos. Cada imagem corresponde a uma concentração TNFα específica. As proporções nucleares/citoplasmáticas de NFκB foram homogêneas em todas as células para uma determinada imagem. Por essa razão, para cada imagem, não foram necessários os valores de todos os pixels nucleares ou citoplasmados para calcular as proporções nucleares e citoplasmáticas do NFκB, e a individualização de núcleos de toque/citoplasmas durante sua segmentação. As imagens daPI foram processadas na Segmentação C: Objetos agrupados com formas convexas bloqueiam núcleos de segmento e o canal verde foi usado para delinear os citoplasmas com a Segmentação E: Bloco de citoplasma agrupado (Figura 4b). A Análise de Fluorescência D: O bloco de translocação global foi usado para exportar a soma dos valores de pixels nucleares e citoplasmicos. Os dados obtidos são representados em uma curva dose-resposta (Figura 4c) e ilustram o aumento da proporção nuclear NFκB após a estimulação com concentrações crescentes de TNFα.

O fluxo de trabalho não apenas analisa o sinal de intensidade global em diferentes compartimentos subcelulares, mas também pode ser usado para detectar focos e extrair informações específicas sobre suas características. A Figura 5a ilustra a detecção de corpos P em células individuais, localizando o melhorador da proteína de descapping 4 (EDC4). O bloco de segmentação A: Objetos não agrupados foi utilizado para segmentar núcleos que apresentam baixo nível de agrupamento, o bloco de segmentação E: Citoplasma agrupado para delinear os citoplasmas e a Análise de Fluorescência C: 2 canais em dois compartimentos para detectar focos EDC4. São identificados objetos segmentados (nuclei_0 segmentados, cytoplasms_0 segmentados) e várias informações são coletadas na planilha correspondente (Informações segmentadas de núcleos e informações de citoplasmas segmentadas) como a intensidade média EDC4 ou o número/tamanho dos corpos detectados em cada ROI(Figura 5b). Antes de serem analisados, os corpos detectados podem ser filtrados preliminarmente de acordo com sua área, o que pode ser útil para excluir objetos abaixo do poder de resolução do microscópio. Para estimar o tamanho dos objetos conservados, um limite de área adicional pode ser introduzido. Áreas de todos os corpos detectados são relatadas em planilhas dedicadas (tamanho de focos segmentados nuclei_Distribution, segmentado cytoplasms_Distribution tamanho de focos). Neste exemplo, destaca-se a análise de duas células (segmentada nuclei_0 and_1 e segmentada cytoplasm_0 and_1), onde são detectados focos EDC4 citoplasmados. Note que, embora o sinal da proteína EDC4 seja detectado tanto nos compartimentos nucleares quanto citoplasmicos, apenas os focos citoplasmices correspondem aos corpos P. O sinal nuclear provavelmente resulta da reatividade cruzada do anticorpo usado para realizar experimentos de imunofluorescência. O tamanho em pixels de cada um dos focos é dado.

Então, como o efeito do estresse oxidativo (OS) em Corpos de Cajal ainda era desconhecido, aproveitamos a versatilidade do fluxo de trabalho para estudá-lo durante o tempo cinética (2 a 20 horas após a indução do SO com 500 μM H2O2) (Figura 6). Os Corpos de Cajal são estruturas dinâmicas nucleando e dissolvendo-se dentro do nucleoplasma sob o controle de parâmetros específicos como a taxa de transcrição ou progressão do ciclo celular. Os Corpos de Cajal foram visualizados por localização de seu principal componente estrutural e funcional, a proteína coilina. Informações sobre o número e o tamanho dos corpos de Cajal foram coletadas estudando 2300 células individuais a partir de imagens de alta resolução (3840X3072) contendo 3 canais: DAPI (azul), 53BP1 (verde) e coilina (vermelho)(Figura 6a). O processamento completo levou menos de 1h. Como os núcleos apresentavam forma convexa e alguns deles estavam agrupados, o bloco Segmentação C: Objetos agrupados com formas convexas foram escolhidos para realizar a segmentação. Como o OS é conhecido por induzir quebras de dupla-vertente de DNA (DDSBs), a proteína de ligação p53 1 (53BP1), conhecida por ser um efeito essencial das vias de sinalização de danos de DNA, foi usada como um marcador para discriminar entre células estressadas e não estressadas. De fato, na ausência de danos no DNA, 53BP1 é distribuído de forma homogênea dentro do nucleoplasma, enquanto após danos no DNA, concentra-se em DDSBs, que formam focos facilmente distinguíveis na microscopia. O número e o tamanho de focos nucleares de 53BP1 e coilin em cada célula foram analisados utilizando-se o bloco Fluorescência Análise B: 2 Canais no mesmo compartimento. Em primeiro lugar, a análise dos dados de 53BP1 ajudou a determinar para cada ponto de tempo da cinética o melhor limiar para classificar as células de acordo com seu estado de estresse. Dentos a cinética, a OS induz um aumento significativo do número de focos de 53BP1 com um aumento de 11 vezes em 2, 4 e 8 h após a indução do SO(Figura S1). Este efeito é menos pronunciado a 6 h (6,5 vezes) devido a um nível inicial mais alto de DSB em células não estressadas. Mesmo após 20h, um aumento sustentado permanece (quase 6 vezes). Esses dados refletem a eficiência do tratamento para induzir o SO e estabelecer 53BP1 como um marcador de estresse eficiente para observações precoces e tardias em microscopia. Por outro lado, uma pequena proporção de células estressadas com baixo nível de DDSBs foi observada em cada ponto de tempo da cinética, sugerindo que as células não são homogeneamente estressadas, reforçando a importância do uso de um marcador de estresse em experimentos de estresse. Com base na análise roc, um limiar global de 17 focos 53BP1 foi selecionado para discriminar entre células estressadas e não estressadas ao longo da cinética (Figura S1).

Em seguida, o número e o tamanho dos focos nucleares de coilina foram analisados de acordo com o estado de estresse da célula. Observou-se aumento significativo no número de focos 2, 4 e 6 h após indução de estresse(Figura 6b). O efeito mais sustentado é observado em 2h, o número de células com mais de 10 focos aumentando de 0% nas células não estressadas para 75% nas células estressadas. Além disso, mais de 25% das células estressadas desse ponto de tempo tinham mais de 20 focos de coilin. Este efeito diminui progressivamente até 8h. Às 20h, observa-se um pequeno aumento do primeiro e do terceiro quartis, mas os dados também mostram que 84% e 80% das células apresentam menos de 8 focos em células não estressadas e estressadas, respectivamente. Esses dados mostram que a OS também tem efeitos tardios sobre parâmetros que controlam a nucleação dos Corpos de Cajal, que podem ser diferentes dos efeitos iniciais. Curiosamente, uma análise cuidadosa das características dos focos nucleares coilin revelou que o aumento observado do número de focos de coilin associa-se a uma diminuição em seu tamanho (Figura 6c). Por exemplo, 2 h após a indução do SO, a proporção de focos de coilin com área abaixo de 0,2 μm2 aumenta de 26% para 64%. Esse efeito diminui até 8h, mas, ao contrário do número de Corpos de Cajal, nenhuma alteração significativa é observada às 20h. Isso pode refletir que a redistribuição nucleoplasmática precoce e tardia dos Corpos de Cajal são eventos diferentes.

Ao todo, esses dados sugerem fortemente que o SO altera o poder de nucleação dos Corpos de Cajal, induzindo uma redistribuição nucleoplasmática em numerosos focos nucleares menores. Uma vez que a nucleação de Corpos de Cajal é impulsionada por seus componentes de proteína e RNA, isso sugere que o efeito OS pode mudar a composição dos Corpos de Cajal. Dentro dos Corpos de Cajal, a proteína coilina interage com vários parceiros proteicos diferentes, como componentes do complexo SMN e proteínas Sm. Essas interações frequentemente envolviam fosfodomínios de coilina, e pode-se imaginar que uma modificação da estrutura dos Corpos de Cajal poderia estar ligada a mudanças no status de fosforilação da coilina. Além disso, trabalhos recentes demonstraram que os Corpos de Cajal não são localizados aleatoriamente dentro do núcleo, e podem afetar a expressão genética através da associação proximal com o gene específico loci17. Diante de todos esses fatos, não seria surpreendente se um efeito na funcionalidade dos corpos de Cajal acompanhasse mudanças em sua estrutura. A partir desses resultados, podemos também perguntar se a remodelação desses Corpos de Cajal é uma consequência passiva da OS ou participa da resposta interagindo com gene loci específico, por exemplo.

Para testar se uma mudança na expressão da coilina poderia alterar sua localização e alterar a nucleação dos Corpos de Cajal, nós superexpressamos uma proteína de fusão GFP-coilin exógena. Os núcleos não foram agrupados, por isso a segmentação foi realizada com o bloco Segmentação A: Objetos não agrupados. Em seguida, para quantificar precisamente o número e o tamanho dos focos de coilin (sinal vermelho, canal 1) de acordo com o nível de GFP-coilin (sinal verde, canal 2) sobreexpressão, foi utilizado o bloco Fluorescência Análise B: 2 Canais no mesmo compartimento. O nível de GFP-coilin foi refletido pela intensidade média do sinal GFP em núcleo individual(Figura 7a). Em células com nível médio ou superior de superexpressão GFP-coilin (intensidade GFP superior a 10), o número de Corpos de Cajal por núcleo aumenta significativamente com alguns núcleos exibindo até 21 focos(Figura 7b). Também notamos que o brilho (intensidade média) dos Corpos de Cajal aumenta consideravelmente em paralelo com o nível de superexpressão levando à saturação de intensidade. Tais regiões saturadas podem, assim, mascarar a presença de focos menores e mais fracos. Nas células que superexpressam um nível médio ou alto de GFP-coilin, o tamanho dos Corpos de Cajal também aumenta significativamente, os valores médios subindo de 1 para 2 μm2 (Figura 7c). Além disso, mais de 25% das células com alto nível de expressão GFP-coilin apresentam focos com uma área maior que 2,5 μm2,enquanto nunca excede 0,8 μm2 em células não transfeinadas. Em conclusão, a superexpressão GFP-Coilin leva a um aumento significativo no número e no tamanho dos Corpos de Cajal. Uma vez que o SISTEMA OPERACIONAL aumenta o número de Corpos de Cajal, mas reduz seu tamanho, esses dados podem refletir que o efeito de OS na estrutura dos Corpos de Cajal é provavelmente induzido por uma mudança de sua composição, em vez de por um efeito na quantidade celular de coilina.

Figure 1
Figura 1: O gasoduto analisador de subestrutura
O fluxo de trabalho é desenvolvido no Icy, uma plataforma comunitária aberta para informática bioimagem, e realiza análise automática de múltiplas imagens de microscopia de fluorescência. Em primeiro lugar, as imagens multicanais são automaticamente carregadas dentro do protocolo e pré-processadas para melhorar, se necessário, a relação sinal/ruído e remover artefatos de imagem. Em seguida, a segmentação de imagens isola regiões de interesse (ROIs) do fundo. Vários métodos de segmentação estão disponíveis dependendo do nível de agrupamento e da natureza dos objetos de interesse. Objetos segmentados são salvos com um descritor específico (por exemplo, imagem name_Nucleus_1) em uma pasta específica e podem ser usados/reutilizados para análise posterior. Sinais fluorescentes como manchas são então analisados dentro dos ROIs e várias características (localização, tamanho, forma, intensidade, textura, número de ponto e tamanho) são exportados para uma planilha criada automaticamente. Todas as características medidas, como o número de manchas detectadas, são relatadas ao descritor do ROI correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Interface gráfica do fluxo de trabalho gelado
(a) O fluxo de trabalho é composto por 13 blocos gerais, que podem ser agrupados de acordo com sua função geral: Selecionar pasta (bloco 1) permitir o acesso a imagens; Os canais de fusão (bloco 2) são usados para mesclar diferentes canais de imagens. Os blocos 3 a 8 são dedicados à segmentação de objetos, cada um sendo adaptado para um contexto específico: Segmentação A: Objetos não agrupados, Segmentação B: Objetos mal agrupados, Segmentação C: Objetos agrupados com formas convexas, Segmentação D: Objetos agrupados com formas irregulares (bloco 7, funciona em associação com o bloco 6), Segmentação E: Citoplasmas agrupados. Os blocos 9 a 11 são utilizados para contagem/análise de focos dentro de compartimentos subcelulares: Análise fluorescência A: 1 Canal, Análise de Fluorescência B: 2 Canais no mesmo compartimento e Análise de Fluorescência C: 2 Canais em dois compartimentos. Os blocos 12 e 13 são adaptados para análise de eventos de translocação: Análise de Fluorescência D: Análise Global de Translocação e Fluorescência E: Translocação celular individual. (b) Apresentação global de uma arquitetura de blocos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Tempo necessário para segmentação em função da resolução de imagem e nível de agrupamento de objetos
(a) Ilustração gráfica do tempo necessário para realizar a segmentação dependendo da resolução de imagem e do nível de clustering. Dois blocos de segmentação diferentes foram testados: Segmentação A (para objetos não agrupados) e Segmentação D (para objetos agrupados com formas irregulares). O tempo de processamento (em segundos por imagem) é plotado em função da resolução de imagem (número de pixels). bbExemplo de imagens analisadas com o bloco Segmentação A ou Segmentação D. São indicados coloração da DAPI e núcleos segmentados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise do fluxo de trabalho de um ensaio de translocação nuclear NFκB em resposta à estimulação TNFα
(a) Exemplo de imagens de células mcf7 humanas (linha celular de adenocarcinoma mamário humano) tratadas com TNFα do conjunto de imagens BBBC014 (Broad Bioimage Benchmark Collection)12. A localização do fator de transcrição NFκB tem sido estudada em células tratadas com 12 concentrações crescentes de TNFα (de 0 a 10-7g/mL). Para cada concentração, foram feitas 4 réplicas. As imagens DAPI (canal azul) foram processadas na Segmentação C: Objetos agrupados com formas convexas bloqueiam núcleos de segmento, e então a coloração NFκB com FITC (canal verde) foi usada para delinear os citoplasmas com o bloco de segmentação E: Citoplasma agrupado. A Análise de Fluorescência D: O bloco de translocação global foi usado para exportar a soma dos valores de pixels nucleares e citoplasmicos. (b) Núcleos segmentados (cinza) e citoplasmas (brancos) são utilizados para determinar a intensidade total do sinal fluorescente NFκB em cada compartimento. (c) A curva dose-resposta obtida a partir da análise dos dados ilustra o aumento da proporção nuclear NFκB à medida que a concentração de TNFα aumenta. As imagens estão em um formato BMP de 8 bits, e o tamanho da imagem é de 1360 x 1024 pixels. Para cada concentração, o desvio padrão entre as 4 réplicas é calculado e ilustrado como barras de erro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Quantificação de focos EDC4 (P-corpos) dentro do citoplasma em células individuais
(a) A co-coloração com DAPI (canal azul) e Phalloidin (canal vermelho) permite a segmentação e identificação de núcleos celulares e F-actin, respectivamente. A proteína EDC4 (canal verde) é usada como um marcador para a detecção de corpos P conhecidos por serem exclusivamente citoplasmicos. Barra de escala, 10 μm. (b) Focos são contados, e várias características (aqui sua área em pixels) são exportadas para a planilha resultados estruturada em várias folhas. Duas folhas são dedicadas à análise de núcleos e duas à análise de citoplasmas. Cada bruto incorpora as informações de um ROI específico. Nas folhas de informações do Núcleo/Citoplasma, as características dos objetos segmentados são exportadas (ID, tamanho e intensidade média do ROI), seguidas pelo número de focos detectados dentro de cada ROI. Se necessário, um limite de tamanho (100 pixels neste exemplo) pode ser adicionado, e o número de focos abaixo e acima desse limite é relatado nas duas últimas colunas. Em Nucleus/Cytoplasm_Distribution de folhas de tamanho de focos, a área (em pixels) de todos os focos detectados é relatada na matéria-prima do ROI correspondente. Neste exemplo, destaca-se a análise de duas células (segmentadas cytoplasm_0 and_1), onde foram detectados focos citoplasmados EDC4. O tamanho em pixels de cada um dos focos também é dado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Cinética da cotolina e distribuição nucleoplasmática de 53BP1 após estresse oxidativo
A análise do número e tamanho dos focos foi baseada em mais de 110 células individuais para cada ponto de tempo de 3 cinéticas independentes. (a) Detecção de imunofluorescência de coilina e 53BP1 focos em células HeLa S3 ao longo da cinética do tratamento com 500 μM H2O2. 53BP1 concentra-se em sites de DNA Double-Strand Break e é usado para avaliar a eficiência do tratamento em cada célula. Coilin é enriquecido em Corpos de Cajal. As células foram fixadas 2, 4, 6, 8 e 20 h após indução de estresse oxidativo e co-manchadas com anticorpos anti-coilina (canal vermelho) e anti-53BP1 (canal verde). Barra de escala, 10 μm. (b) O número de focos nucleares de coilina após estresse oxidativo. Os resultados são mostrados como parcelas de caixa, onde a marca central é a mediana, as bordas inferior e superior da caixa são ospercentis 25th e 75. Nas células tratadas com H2O2, detecta-se um aumento significativo no número de focos de coilina e é máximo após 2 e 4 horas de tratamento. Wilcoxon - A análise do teste de Mann Whitney demonstra uma diferença significativa entre células tratadas H2O2 (*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001). (c) A proporção de células em função da área de focos de coilin (μm2). A maioria dos focos tem uma área menor em 2h e 4h de ponto de tempo em comparação com o controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Estudo da nucleação de Corpos de Cajal em células superexpressando uma proteína de fusão GFP-coilin
(a) As células HeLa S3 foram transitoriamente transfectadas em triplicados biológicos com 500 ng de um plasmídeo expressando uma proteína de fusão GFP-Coilin usando um procedimento padrão seguindo as recomendações do fabricante. Após 48 h, as células foram fixadas e manchadas com um anticorpo contra a coilina. O DAPI (canal azul) permite segmentar núcleos. Para essas análises, foram analisadas mais de 100 células. O sinal GFP reflete a localização da proteína coilin-GFP (canal verde), enquanto o sinal de coilina (canal vermelho) corresponde tanto à localização da proteína endógena quanto exógena. Para cada núcleo, a intensidade média do sinal GFP reflete o nível de expressão de coilina. De acordo com este parâmetro, as características dos focos de coilin foram analisadas utilizando-se o bloco Análise de Fluorescência B: 2 Canais no mesmo compartimento. Barra de escala, 10 μm. (b) Relação entre o número de focos de coilin e a intensidade média de GFP por núcleo. Os resultados são mostrados como parcelas de caixa, onde a marca central é a mediana, a borda inferior e superior da caixa são ospercentis 25th e 75. Wilcoxon - Mann Whitney análise de teste demonstra um aumento significativo do número de focos para uma intensidade GFP >10 (*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0.001). (c) Relação entre a área de focos de coilina e a intensidade média de GFP por núcleo. Os resultados são mostrados como parcelas de caixa, onde a marca central é a mediana, a borda inferior e superior da caixa são ospercentis 25th e 75. Wilcoxon - Mann Whitney análise de teste demonstra um aumento significativo da área de focos de coilin para uma intensidade GFP >10 (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura S1: Cinética de 53BP1 distribuição nucleoplasmática após estresse oxidativo
(a) Quantificação de focos nucleares de 53BP1 em células tratadas não tratadas ou H2O2 após diferentes tempos de incubação. Os resultados são mostrados como parcelas de caixa, onde a marca central é a mediana, a borda inferior e superior da caixa são ospercentis 25th e 75. Wilcoxon - A análise do teste de Mann Whitney demonstra uma diferença significativa entre células tratadas H2O2 (*, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001). (b) Para cada ponto de tempo da cinética, foi estabelecida uma curva ROC (Receiver Operating Characteristic) para determinar o melhor limiar para discriminar entre células estressadas e não estressadas. Os parâmetros de cada teste são relatados na tabela (Sensibilidade, especificidade, TP: verdadeiro positivo, TN: verdadeiro negativo, FP: falso positivo, FN: falso negativo). A partir desses dados, um limiar global de 17 focos 53BP1 foi determinado a discriminar células não estressadas através da cinética. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Um número crescente de ferramentas de software livre estão disponíveis para a análise de imagens celulares de fluorescência. Os usuários devem escolher corretamente o software adequado de acordo com a complexidade de sua problemática, com seus conhecimentos em processamento de imagem e com o tempo que desejam passar em suas análises. Icy, CellProfiler ou ImageJ/Fiji são ferramentas poderosas que combinam usabilidade e funcionalidade3. O Icy é uma ferramenta autônoma que apresenta uma interface de usuário gráfica clara (GUI), e notavelmente sua interface de ponto e clique "Protocolos" através da qual os fluxos de trabalho podem ser facilmente projetados ou manipulados4. A funcionalidade deste software é aprimorada por suporte e utilização de plug-ins ImageJ, e muita documentação está disponível graças à sua grande comunidade de usuários. Usamos essa forte combinação de usabilidade e funcionalidade do software Icy para desenvolver o fluxo de trabalho subestrutura analisador. Seu principal objetivo é propor uma solução automatizada para realizar uma análise completa do sinal fluorescente celular a partir de múltiplas imagens. A análise abrange pré-processamento de imagem, segmentação de objetos e análise de sinal fluorescente.

Vários protocolos são compartilhados com gratidão no site da Icy e propõem usar funcionalidades geladas para detectar e analisar sinais fluorescentes como focos celulares. No entanto, alguns desses protocolos processam apenas uma imagem por execução, não exportam os resultados em um arquivo específico ou analisam um único canal. Outros não contêm segmentação preliminar para determinar regiões de interesse (ROIs) ou propõem algoritmos simples como "HK-means" que não são adequados para a segmentação de objetos altamente agrupados. O Analisador de Subestrutura automatiza todas as etapas da análise de imagem desde o pré-processamento de imagens até a segmentação de objetos e a detecção/análise de sinais fluorescentes. O protocolo também propõe métodos simples ou mais complexos para segmentação de objetos e exportação dos dados (nomes dos objetos segmentados, análise de focos) é realizado em saídas otimizadas adaptadas ao problemático. CellProfiler também propõe poderosos pipelines compostos por módulos que encapsulam funcionalidades18,,19. Os gasodutos disponíveis estão bem adaptados a problemas específicos. Fluxos de trabalho gelados são uma rede de caixas diferentes, cada uma delas realizando uma tarefa específica. Através da interface "Protocolos", as caixas que compõem a rede são intuitivas e fáceis de manipular. O Analisador de Subestrutura é adaptado a diversos contextos como a simples fusão de canais, a quantificação da distribuição de sinais fluorescentes entre dois compartimentos subcelulares, a análise de focos em um ou vários canais de um ou dois compartimentos celulares em células individuais. Vários displays permitem visualizar os resultados intermediários durante cada corrida para controlar o processamento. Além disso, o Icy apresenta barras de ícones que agrupam os métodos por tópico e a partir dos quais as funcionalidades encontradas no fluxo de trabalho podem ser manipuladas separadamente para testar manualmente parâmetros específicos em algumas imagens antes de usá-las em um conjunto de imagens inteira.

Como no campo de análise de bioimagem, o passo mais crítico deste protocolo é a segmentação de objetos. O protocolo propõe a segmentação de objetos primários, que são a maior parte do tempo núcleos celulares, e também contém outro bloco que a tarefa é segmentar um segundo tipo de objetos dentro da célula. A segmentação dos núcleos pode ser difícil quando os objetos estão altamente agrupados para que toquem ou se sobreponham. Diferentes alternativas para a segmentação de objetos primários estão contidas no protocolo, de acordo com a forma dos objetos e o nível de agrupamento, mesmo que até o momento nenhum sucesso universal de algoritmo na segmentação completa de objetos altamente agrupados. O processo de segmentação é limitado principalmente pela determinação de parâmetros corretos que poderiam segmentar com sucesso uma parte dos objetos, mas levar a subouseção ou sobre-segmentação de outra parte. O usuário teria que realizar diferentes corridas com parâmetros diferentes para obter uma segmentação final correta, especialmente para objetos agrupados que apresentam formas heterogêneas e não convexas.

Este protocolo é limitado principalmente pela etapa de segmentação, que pode ser altamente demorada e precisar de configuração de computador poderosa para os casos mais complexos. Mais especificamente, quanto mais numerosas ou complexas forem as imagens (objetos agrupados ao segmento, um alto número de pixels nas imagens), mais memória de acesso aleatório (RAM) o usuário exigirá. Globalmente, para qualquer problema, o usuário precisará executar o protocolo em um Ambiente Java Runtime de 64 bits (disponível livremente no site java) e usar um sistema operacional de 64 bits (SO) para aumentar a memória disponível usada pela Icy (a memória é limitada a 1300 MB para 32 bits JRE). Por causa do script, o protocolo não funciona corretamente em um computador Mac. Além disso, o número de parâmetros aumenta com a complexidade do problema e exigirá mais conhecimento em análise de imagem. Quanto aos critérios de funcionalidade, este protocolo ainda não foi adaptado para a análise de imagens empilhadas (pilhas de tempo, pilhas de z) mesmo que o Icy realize eficientemente a análise sobre esse tipo de dados.

Atualizações futuras serão realizadas notavelmente para melhorar a segmentação de objetos complexos agrupados. Serão desenvolvidos blocos adicionais para adaptar a segmentação a estruturas celulares agrupadas com formas irregulares não convexas. Também adaptaremos o fluxo de trabalho para a análise de tempo e pilhas z (para imagens ao vivo e dados 3D).

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

G.H. foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação da Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação do Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), enquanto Q.T. foi apoiado por uma bolsa pública supervisionada pela Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR) como parte do segundo programa "Investissements d'Avenir" FIGHT-HF (referência: ANR-15-RHU4570004). Este trabalho foi financiado pelo CNRS e pela Université de Lorraine (UMR 7365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free Thermo Fisher Scientific 28908 to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit Thermo Fisher Scientific A-11008 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse Thermo Fisher Scientific A-21425 fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A34055 fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA) euromedex 04-100-812-E
DMEM Sigma-Aldrich D5796-500ml cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040-5ML mounting medium
Human: HeLa S3 cells IGBMC, Strasbourg, France cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2) Sigma-Aldrich H1009-100ml used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent Thermo Fisher Scientific 11668-019 transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin abcam ab11822 Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope Nikon epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985062 transfection medium
PBS pH 7.4 (10x) gibco 70011-036 to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1 Thermo Fisher Scientific PA1-16565 53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4 Sigma-Aldrich SAB4200114 EDC4-specific antibody
Triton X-100 Roth 6683 to permeabilize the cells

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References

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Bioengenharia Edição 161 Microscopia de Fluorescência Análise de Bioimagem Segmentação celular Contagem de focos Corpos Celulares Estresse Oxidativo Automatização Análise de Translocação Analisador de Subestrutura Gelo Imagem J
Analisador de subestrutura: Um fluxo de trabalho fácil de usar para exploração rápida e análise precisa de corpos celulares em imagens de microscopia de fluorescência
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Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, … More

Heckler, G., Aigueperse, C., Hettal, L., Thuillier, Q., de Chaumont, F., Dallongeville, S., Behm-Ansmant, I. Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images. J. Vis. Exp. (161), e60990, doi:10.3791/60990 (2020).

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