제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝
Summary
Zebrafish 이종이식 모델은 생체 내 미세 환경에서 인간 암 세포의 고처리량 약물 스크리닝 및 형광 이미징을 허용합니다. 당사는 자동 형광 현미경 장착 이미징 유닛을 사용하여 제브라피시의 환자 유래 백혈병 시료에 대한 대규모 자동 약물 스크리닝을 위한 워크플로우를 개발했습니다.
Abstract
환자 유래 이종이식 모델은 생체 내 시스템에서 다른 암이 약물 치료에 어떻게 반응하는지 정의하는 데 중요합니다. 마우스 모델은 현장에서 표준이지만, 제브라피쉬는 고처리량 및 저비용 약물 스크리닝 능력을 포함하여 여러 가지 장점을 가진 대체 모델로 부상했습니다. Zebrafish는 또한 이전에 는 시험관 내 시스템으로만 얻을 수 있던 큰 복제 숫자로 생체 내 약물 스크리닝을 허용합니다. 대규모 약물 스크린을 신속하게 수행 할 수있는 능력은 결과를 신속하게 클리닉으로 신속하게 번역하여 개인화 된 의학의 가능성을 열 수 있습니다. Zebrafish 이종이식 모델은 또한 표적 치료에 대한 종양 반응에 근거를 둔 실행 가능한 돌연변이를 신속하게 선별하거나 대형 라이브러리에서 새로운 항암 화합물을 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 이 분야의 현재 주요 제한은 약물 스크린이 더 큰 규모로 수행되고 노동 집약적이지 않도록 프로세스를 정량화하고 자동화하고 있습니다. 우리는 제브라피쉬 유충으로 1 차 환자 샘플을 이종이 식이식하고 형광 현미경 장착 이미징 장치 및 자동화 된 샘플러 유닛을 사용하여 대규모 약물 스크린을 수행하기위한 워크플로우를 개발했습니다. 이 방법은 제브라피시 유충의 다수에 걸쳐 이식된 종양 영역및 약물 치료에 대한 반응을 표준화하고 정량화할 수 있게 한다. 전반적으로, 이 방법은 약물 치료 전반에 걸쳐 생체 내 환경에서 종양 세포의 성장을 허용하고, 생체 내 약물 스크린에서 대규모의 마우스보다 더 실용적이고 비용 효율적이기 때문에 전통적인 세포 배양 약물 스크리닝에 비해 유리하다.
Introduction
1차 환자 암 또는 인간 암 세포주를 모델 유기체로 Xenografting하는 것은 생체 내에서 종양 진행 및 행동, 약물 치료에 대한 종양 반응, 및 미세 환경과의 암 세포 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용되는 기술이다. 전통적으로, 세포는 면역 손상된 마우스로 이종이 식이식되고, 이것은 필드에 있는 표준남아 있습니다. 그러나, 이 모델 시스템은 높은 비용, 낮은 복제 수, 생체 내 종양 부담을 정확하게 정량화하는 데 어려움, 종양이 생착 및 약물 검사를 완료하기까지 걸리는 연장 된 시간과 같은 몇 가지 제한사항이 있습니다. 최근에는 제브라피쉬가 대체 이종이식 모델로 등장하여 2005년에 최초로 보고되고 있으며, 녹색 형광 단백질(GFP)으로 표지된 인간 흑색종 세포주를 블라스쿨라단계배아로 이식하여 1,,2. 최근에는 2일 후 수정(dpf) 제브라피시 유충이 주사의 해부학적 위치를 조절할 수 있도록 이종이식 수용자로 사용되어 왔으며, 주변 미세환경과의 종양 상호작용의 생체내 영상에서 고해상도로 사용하기 위해3,,4.
제브라피쉬는 이종이식 모델로서 많은 이점을 제공합니다. 첫째, 성인용 제브라피쉬는 비교적 저렴한 비용으로 대량으로 사육하고 빠르게 사육할 수 있습니다. 성제 얼룩말의 각 짝짓기 쌍은 매주 애벌레 물고기의 수백을 생산할 수 있습니다. 그들의 작은 크기 때문에, 이 애벌레 얼룩말은 높은 처리량 약물 검열을 위한 96 웰 플레이트에서 유지될 수 있습니다. 유충은 노른자 주머니가 생후 첫 주 동안 영양분을 공급하기 때문에 전형적인 이종이식 실험 과정에서 먹이를 줄 필요가 없습니다. 더욱이, 제브라피쉬는 7 dpf까지 완전한 기능성 면역 계통을 갖지 않으며, 이는 이종이식 주사 전에 조사 또는 면역 억제 요법을 필요로 하지 않는다는 것을 의미합니다. 마지막으로, 광학적으로 명확한 얼룩말 물고기 라인은 종양 미세 환경 상호 작용의 고해상도 화상 진찰을 허용합니다.
아마도 이종이식 모델로 제브라피시의 가장 유망한 응용 프로그램은 다른 모델 유기체를 사용하여 불가능한 방식으로 인간 암 샘플에 대한 높은 처리량 약물 스크리닝을 수행하는 능력입니다. 애벌레는 피부를 통해 물에서 약물을 흡수, 약물 투여의 용이성을 향상5. 동물은 일반적으로 100-300 μL의 물에서 96 웰 플레이트에서 유지되기 때문에 스크린은 마우스에 비해 적은 약물 양을 필요로합니다. 현재, 제브라피시에 있는 인간 종양 부담에 대한 약물의 효력의 표준화 그리고 정량화를 위한 몇몇 다른 방법이 있습니다, 그 중 일부는 높은 처리량 검열에 단 하나 약 시험을 확장하기 위한 그외 보다는 더 실용적입니다. 예를 들어, 일부 그룹은 물고기를 단일 세포 현탁액으로 해리하고, 반자동 ImageJ 매크로4를사용하여 현탁액의 개별 방울을 이미징하고 형광을 정량화함으로써 형광 표지 또는 염색된 종양 세포를 정량화한다. 반자동 전신 애벌레 이미징 방법은 애벌레 물고기가 96 웰 플레이트에 고정되고 합성 이미지의 재정렬 및 종양 세포 초점6의 정량화 전에 반전형광 현미경을 사용하여 이미지화하는 방식으로개발되었습니다. 이 두 가지 검사는 정량화를 위한 상당히 노동 집약적인 방법이며, 이는 제브라피시 이종이식 모델에서 진정으로 높은 처리량의 약물 스크리닝을 비현실적으로 만들었습니다.
이 문제는 척추동물 자동 선별 기술(VAST) 생체 이미지 및 대입자(LP) 샘플러, 형광 현미경 장착 이미징 유닛 및 자동 샘플러유닛(그림 1 및 표 재료)의개발로 해결되었으며, 이는 제브라피시 유충7,,8,,9의고처리량 이미징을 위한 진정한 자동화 된 방법입니다. 이 장치를 사용하면 생선이 마취되고 96 웰 플레이트에서 자동으로 샘플링되고 모세관에 배치되고 미리 설정된 사용자 선호도에 따라 설정된 방향으로 회전된 다음 추가 연구를 위해 새로운 96웰 플레이트의 동일한 웰에 다시 배치하거나 폐기합니다. 이 화상 진찰 기술을 zebrafish 이종이식과 결합하면 개별 환자 종양에 대한 대형 약물 화합물 라이브러리의 고처리량 약물 스크리닝을 사용하는 개인화 된 의학의 가능성을 허용할 수 있습니다. Zebrafish 이종이식은 또한 생체 내에서 새로운 화합물의 독성과 효능을 모두 테스트하기 위한 대규모 저비용 방법을 제공합니다. 제브라피쉬는 마우스 이종이식 모델로 진행하기 전에 예비 스크리닝 단계로 사용할 수 있습니다.
당사는 1차 환자 백혈병 세포를 제브라피시로 이식하고 다른 1차 환자 종양 세포 또는 암 세포라인에 적용할 수 있는 자동 이미징 및 정량화를 통해 고처리량 약물 스크린을 수행하기 위한 간소화된 워크플로우를 개발했습니다. 이 워크플로우는 형광 현미경 장착 이미징 유닛과 자동 샘플러 유닛을 활용하여 현재 표준화 및 정량화 방법을 개선하고 생체 내에서 종양 질량을 정량화하는 이전의 보다 노동 집약적인 방법에 대한 자동화된 대안을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서, 우리는 이종이식 모델로서 제브라피시로 1차 환자 백혈병 세포를 해동하고 주입하는 표준화된 방법을 입증하였다. 또한 형광 현미경 장착 영상 장치 및 자동 샘플러 유닛을 사용하여 이종이식 제브라피시의 고처리량 약물 스크리닝 프로토콜을 수립했습니다. 이전에는 이종이식은 인간 세포주로 보고되었으며, 이종이식 종양을 높은 처리량 방식으로 정량화하는 것은 현장에서 어려?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 V 재단 V 학자 상과 NIH 교부금 DP2CA228043, R01CA227656 (J.S. 블랙번) 및 NIH 교육 보조금 T32CA165990 (M.G. Haney에)에 의해 지원되었다.
Materials
| 10x TBE Liquid Concentrate | VWR | 0658-5L | |
| 96-well plate, flat bottom | CELLTREAT | 229195 | VAST is compatible with a variety of standard or deep well 24, 48, or 96 well plates |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Borosilicate Glass Capillary without Filament | Sutter Instrument Company | B100-50-10 | |
| Dexamethasone | Enzo Life Sciences | BML-EI126-0001 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2438-5X10ML | |
| E3 media | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | |
| Femtotips Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Fetal Bovine Serum (Premium Heat Inactivated) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| ImageJ | FIJI | N/A | https://imagej.net/Fiji |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | STEMCELL Technologies | 36150 | |
| Large Particle (LP) Sampler | Union Biometrica | N/A | automated sampler unit http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8 |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10MG | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Caisson labs | PBL06-6X500ML | |
| Stage Micrometer (400-Stage) | Hausser Scientific | 400-S | |
| Tricaine-S | Pentair Aquatic | TRS1 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | T10282 | |
| VAST Bioimager | Union Biometrica | N/A | fluorescent equipped microscope imaging unit https://www.unionbio.com/vast/ |
| Vincristine Sulfate | Enzo Life Sciences | BML-T117-0005 | |
| Vybrant DiI Stain | Thermo Fisher | V22885 |
References
- Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., Cornell, R. A., Hendrix, M. J. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Developmental Dynamics. 233 (4), 1560-1570 (2005).
- Topczewska, J. M., et al. Embryonic and tumorigenic pathways converge via Nodal signaling: role in melanoma aggressiveness. Nature Medicine. 12 (8), 925-932 (2006).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (3), 139-151 (2006).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. British Journal of Haematology. 153 (6), 786-789 (2011).
- Rennekamp, A. J., Peterson, R. T. 15 years of zebrafish chemical screening. Current Opinion in Chemical Biology. 24, 58-70 (2015).
- Ghotra, V. P., et al. Automated whole animal bio-imaging assay for human cancer dissemination. PLoS One. 7 (2), 31281 (2012).
- Chang, T. -. Y. Y., Pardo-Martin, C., Allalou, A., Wählby, C., Yanik, M. F. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab On a Chip. 12 (4), 711-716 (2012).
- Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7 (8), 634-636 (2010).
- Pulak, R. Tools for automating the imaging of zebrafish larvae. Methods. 96, 118-126 (2016).
- Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 153 (1), 91-98 (2011).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Paatero, I., Alve, S., Gramolelli, S., Ivaska, J., Ojala, P. Zebrafish Embryo Xenograft and Metastasis Assay. Bio-Protocol. 8 (18), (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Cold Spring Harbor Laboratory Press. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), (2011).
- Wertman, J., Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. The Zebrafish Xenograft Platform: Evolution of a Novel Cancer Model and Preclinical Screening Tool. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 289-314 (2016).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. The Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
- Yan, C., et al. Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).
