Summary

レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを回収する簡略逆遺伝学法

Published: April 17, 2020
doi:

Summary

プラスミドDNAからの組換えロタウイルスの生成は、ロタウイルス複製および病因の研究、およびロタウイルス発現ベクターおよびワクチンの開発に不可欠なツールを提供する。本明細書において、蛍光レポータータンパク質を発現する株を含む組換えロタウイルスを生成するための簡略な逆遺伝学アプローチについて述べる。

Abstract

ロタウイルスは、ヒトを含む多くの哺乳類および鳥類宿主種の若者に重度の胃腸炎を引き起こすセグメント化された二本鎖RNAウイルスの大規模で進化する集団である。近年のロタウイルス逆遺伝学システムの登場により、指向性変異誘発を用いてロタウイルス生物学を探索し、既存のロタウイルスワクチンを修飾・最適化し、ロタウイルス多標的ワクチンベクターを開発することが可能になりました。本報告では、組換えロタウイルスの効率的かつ確実な回復を可能にする、簡素な逆遺伝学システムについて述べる。このシステムは、フルレングスロタウイルス(+)RNAを発現するT7転写ベクターと、T7 RNAポリメラーゼ(BHK-T7)を構成的に産生するBHK細胞にRNAキャッピング酵素をコードするCMVベクターの共同トランスフェクションに基づいている。組換えロタウイルスは、トランスフェクトされたBHK-T7細胞をMA104細胞(ウイルス増殖に対して非常に寛容であるサル腎臓細胞株)で過剰播種することによって増幅される。本報告では、ゲノムセグメント7(NSP3)への2A翻訳ストップリスタート素子の導入を通じて、別の蛍光レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを生成するアプローチについても述べる。このアプローチは、ウイルスのオープンリーディングフレームのいずれかを削除または変更することを避け、蛍光タンパク質を発現させながら完全に機能するウイルスタンパク質を保持する組換えロタウイルスの産生を可能にする。

Introduction

ロタウイルスは、乳幼児の重度の胃腸炎の主な原因であり、他の多くの哺乳類および鳥類の若者1.レオビリダ科の一員として、ロタウイルスはセグメント化された二本鎖RNA(dsRNA)ゲノムを有する。ゲノムセグメントは、タンパク質2の3つの同心層から形成された非エンベロープ二面体のビリオン内に含まれている。ゲノムセグメントのシーケンシングと系統解析に基づいて、9種のロタウイルス(A-D、F-J)が定義されている。ロタウイルス種Aを含む株は、ヒト疾患4の大多数を担っている。過去10年間に始まった小児予防接種プログラムへのロタウイルスワクチンの導入は、ロタウイルスの死亡率および罹患率の有意な減少と相関している。最も顕著なのは、ロタウイルス関連の小児死亡率は、2000年の約528,000人から2016年には128,500人に減少した,5ロタウイルスワクチンは、生きたウイルスの弱化株から処方され、生後6ヶ月までに小児に2〜3回投与される。ヒトおよび他の哺乳類種で循環する多数の遺伝的に多様なロタウイルス株は、突然変異および再分類を通じて急速に進化する能力と相まって、小児66、7、87,8に感染するロタウイルスの種類の抗原性変化を招く可能性がある。このような変化は、既存のワクチンの有効性を損ない、その交換または改変を必要とする可能性がある。

11個のロタウイルスゲノムセグメントの操作を可能にする完全プラスミドベースの逆遺伝学系の開発は、最近になってようやく達成された。これらのシステムの利用により、ロタウイルス複製および病因の分子詳細を解明し、抗ロタウイルス化合物の高スループットスクリーニング方法を開発し、ロタウイルスワクチンの新しい潜在的に効果的なクラスを作成することが可能になりました。ロタウイルス複製の間、制限されたウイルス(+)RNAは、ウイルスタンパク質の合成を導くだけでなく、子孫のdsRNAゲノムセグメント10、11,11の合成のためのテンプレートとしても役立つ。これまでに記載されたすべてのロタウイルス逆遺伝学系は、組換えウイルス9、12、13,の回収に使用されるcDNA由来(+)RNAの供給源として、T7転写ベクターを哺乳動物細胞株に9,トランスフェクションすることに依存している。13転写ベクター内では、フルレングスのウイルスcRNAは、ウイルス(+)RNAが本物の5’および3’末語を含むT7 RNAポリメラーゼによって合成されるような上流T7プロモーターと下流型肝炎デルタウイルス(HDV)リボザイムの間に位置付けられている(図1A)。第1世代逆遺伝学系では、T7RNAポリメラーゼ(BHK-T7)を11T7(pT7)転写ベクターで発現する赤ちゃんハムスター腎臓細胞をトランスフェクトすることにより組換えウイルスが作られた、 各各々は、シミアンSA11ウイルス株のユニークな(+)RNAの合成、及び3つのCMVプロモーター駆動発現プラスミド、1つはワクシニアウイルスD1R-D12Lキャッピング酵素複合体9のアビアンレオウイルスp10FAST融合タンパク質および2つのコード化サブユニットをコードする。トランスフェクトされたBHK-T7細胞で生成された組換えSA11ウイルスは、MA104細胞とのオーバーシードにより増幅され、ロタウイルス増殖に対する細胞株透過性である。第1世代リバース遺伝学系の改変版は、もはや支持プラスミド12を使用していないと述べてきた。代わりに、改変系は、11個のSA11 T7転写ベクターを用いてBHK-T7細胞をトランスフェクトするだけで組み換えロタウイルスを生成することに成功し、ウイルス工場(viroplasm)ビルディングブロック(非構造タンパク質NSP2およびNSP5)のベクターが他のベクターよりも3倍高いレベルで追加されるという14,警告がある。逆遺伝学システムの改変バージョンは、ロタウイルス16、17,17のヒトKUおよびオデリア株の回復をサポートするも開発されている。ロタウイルスゲノムは、逆遺伝学による操作に非常に適しており、VP418、NSP19、NSP219、NSP3,20、21、およびNSP520,2122、23に導入された変異を伴ってこれまでに生成された組換えウイルスを有する。23これまでに生成された最も有用なウイルスの中には、蛍光レポータータンパク質(F)9、12、21、24、2512,21,24,25を発現するように設計されたものがある。9

本稿では、我々の研究室で使用する逆遺伝学システムのプロトコルを提供し、SA11ロタウイルスの組換え株を生成する。我々のプロトコルの主な特徴は、BHK-T7細胞を11 pT7転写ベクター(pT7/NSP2SA11およびpT7/NSP5SA11ベクターの3倍のレベルを含むように改変した)およびアフリカの豚熱ウイルス(ASFV)NP868Rキャッピング酵素をコードするCMV発現ベクターである21(我々の手では、NP868Rプラスミドの存在は、トランスフェクトされたBHK-T7細胞による組換えウイルスのより高い強化剤の産生をもたらす。本稿では、セグメント7タンパク質産物NSP3だけでなく、別のFPを発現する組換えウイルスを生成できるよう、pT7/NSP3SA11プラスミドを改変するためのプロトコルも提供する。これは、pT7/NSP3SA11プラスミドのNSP3オープンリーディングフレーム(ORF)を再設計し、下流の2Aトランスレーショナルストップリスタート要素を含み続いてFP ORF(1B)24、26を含むことによって達成される24このアプローチを通じて、UnaG(緑)、mKate(ファーレッド)、mRuby(赤)、タグBFP(青)、CFP(シアン)、YFP(黄色)24、27、28,27など、さまざまなFPを発現する組み換えロタウイルス28生成しました。これらのFP発現ロタウイルスは、NSP3 ORFを削除することなく作られ、機能するウイルスタンパク質の完全な補完をコードすると予想されるウイルスを生み出す。

Protocol

1. 培地調製および細胞培養のメンテナンス T7 RNAポリメラーゼ(BHK-T7)およびアフリカの緑色のサル腎臓MA104細胞を構成的に発現する赤ちゃんハムスター腎臓細胞を得る。注:BHK-T7(またはBSR-T7)細胞は市販されていませんが、RNAウイルス生物学を研究するために逆遺伝学を使用する実験室の一般的な細胞株です。このプロトコルで使用されるBHK-T7細胞株は、T7 RNAポリメラーゼ…

Representative Results

本稿で説明する逆遺伝学プロトコルは、複数の異なるステップを経て進行します: (1) ロタウイルス pT7 転写ベクターと pCMV/NP868R 発現プラスミドを持つ BHK-T7 細胞の共同トランスフェクション, (2)MA104細胞を用いたトランスフェクトされたBHK-T7細胞の過剰播種、(3)MA104細胞を用いたリセートのBHK-T7/MA104細胞に存在する組換えウイルスの増幅、および(4)MA104細胞を用いた組換えウイルスのプラーク単…

Discussion

我々の研究室では、組換えSA11ロタウイルスを産生するために本明細書に記載されている逆遺伝学プロトコルに日常的に依存しています。このアプローチでは、分子生物学の技術やロタウイルスの研究経験がほとんどない人は、最初の試みでも組み換えウイルスを回復します。このプロトコルに従って、外来タンパク質(例えば、FP)を発現するように再設計され、配列の追加、欠失、点突然変?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NIH助成金R03 AI131072とR21 AI144881、インディアナ大学スタートアップ資金、ローレンスM.ブラット基金によってサポートされました。私たちは、IUロタフージャー研究所、ウルリッヒ・デッセルベルガー、グイド・パパのメンバーに、逆遺伝学プロトコルの開発における多くの貢献と提案に感謝します。

Materials

Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Bio-Rad 45608105
Cellometer AutoT4 viable cell counter Nexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging System Bio-Rad
Chloroform MP 194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate Bio-Rad 170-5060
Competent E.coli DH5alpha Bacteria Lucigen 60602-2
Complete Protease Inhibitor Pierce A32965
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips MTC Bio P4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Lonza 12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) Quality Biological 115-073-101
Ethanol, Absolute (200 proof) Fisher Bioreagents BP2818-500
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) Invitrogen 15585-011
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Corning 35-011-CV
Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal Sigma-Aldrich F1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit Sigma NA0200-1KT
Geneticin (G-418) Invitrogen 10131-027
Gibco FluroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 DMEM with low background fluorescence
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7074S
Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum Patton lab lot 55068
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum Patton lab lot 53963
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated KPL 5220-0366
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit JH Science 25235
Isopropyl alcohol Macron 3032-02
L-glutamine Solution (100x) Gibco 25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) RPI research products L24020-2000.0
Medium 199 (M199) Culture Medium Hyclone Sh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) Lonza 04-719Q
Monkey Kidney (MA104) Cells ATCC ATCC CRL-2378.1
NanoDrop One Spectrophotometer ThermoScientific
Neutral Red Solution (0.33%) Sigma-Aldrich N2889-100ml
Non-Essential Amino Acid Solution (100x) Gibco 11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Invitrogen XP00102BOX
Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water Invitrogen 10977-015
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit Takara 740609.25
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985-070
Pellet pestle (RNase-free, disposable) Fisher 12-141-368
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) Corning 30-002-Cl
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Fisher Bioreagents BP399-20
Porcine Trypsin, Type IX-S Sigma-Aldrich T0303
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1223
Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen 12162
Qiagen Plasmid Midi Kit Qiagen 12143
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
SA11 pT7 Transcription Vectors Addgene 89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins Contact: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE Agarose Lonza 50000 For gel electrophoresis
SeaPlaque agarose Lonza 50100 For plaque assay
Superscript III One-Step RT-PCR kit Invitrogen 12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad 170-4270
Trans-Llot Turbo Transfer System Bio-Rad
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2306
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) Bio-Rad 161-0772
Triton X 100 Fisher Bioreagents BP151-500
Trizol RNA Extraction Reagent Ambion 15596026
Trypan blue Corning 25-900-CI
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution Quality Biological 118-087-721
Tryptose Phosphate Broth Gibco 18050-039
Tween-20 VWR 0777-1L
Vertrel VF solvent Zoro G0707178
Zoe Fluorescent Live Cell Imager Bio-Rad

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Cite This Article
Philip, A. A., Dai, J., Katen, S. P., Patton, J. T. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (158), e61039, doi:10.3791/61039 (2020).

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